Name: Un targeting GPC3 bispecifico, GPC3-S-Fab, con potente citotossicità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri come produrre l'anticorpo bispecifico GPC3-S-Fab in Escherichia coli e valutarne la citotossicità contro le cellule tumorali epatiche GPC3-positive. Questo metodo semplifica la purificazione per la ricerca sul cancro.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal R & D piano della provincia di Guangdong (Cina) (2016A050503028).

Tutte le procedure, compresa la raccolta di sangue umano sono state approvate dal comitato etico di Sun Yat-Sen University.
1. strategia di progettazione GPC3-S-Fab
<ol><li>Progettare GPC3-S-Fab collegando un Fab di anti-GPC3 (umanizzato GC3313) con un anti-CD16 VHH14 (Figura 1).</li>
	<li>Sintetizzare e clonare il VH-CH1-CD16-VHH e VL-CL nei vettori pET26b e pET21a come precedentemente segnalati12.</li>
</ol>2. trasformazione e cultura
<ol><li>Aggiungere 100 ng di pET26b contenenti VH-CH1-CD16 (Figura 1A) e 100 ng di pET21a contenente VL-CL (Figura 1A) in 100 µ l di competenti BL21 (DE3) cellule. Mescolare bene e incubare in ghiaccio per 30 min. Incubare a bagnomaria a 42 ° C per 45-90 s, trasferimento e incubare in ghiaccio per 3-5 min.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di terreno di brodo (LB) di Lisogenesi in una provetta contenente BL21 (DE3) cellule e poi incubare a 37 ° C, 150 giri/min per 45-60 min sviluppa 100 µ l di BL21 (DE3) cellule su LB-agar piastre contenenti 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillina e poi incubare a 37 ° C per 12-16 ore.<ol>
<li>Preparare Lisogenesi supporto di brodo (LB): tryptone wt/vol 1%, 0,5% wt/vol di Estratto di lievito, 1% wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculare le cellule da una singola Colonia in 5 mL di terreno di brodo super (SB) contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillinae coltura a 37 ° C, 220 giri/min, durante la notte. Quindi, inoculare 1 mL di coltura in 100 mL di mezzo di SB contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillina e coltura a 37 ° C, 220 giri/min per 4 h. Quindi, trasferire 10 mL della cultura in 1 L di terreno di SB contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillina e coltura a 37 ° C, 220 giri/min.<ol>
<li>Preparare il supporto di brodo super: 3,2% wt/vol tryptone, Estratto di lievito 2% wt/vol, 0,5% wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando raggiunge il OD600 0.6 - 0.8, aggiungere isopropilico-b-D-thio-galattopiranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,2 mM. Cultura a 16 ° C, 180 giri/min per 36-48 h per espressione periplasmica.</li>
</ol>3. GPC3-S-Fab periplasmico purificazione
<ol><li>Preparazione di frazione periplasmico<ol>
<li>Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4.000 x g, 4 ° C per 30 min, eliminare il terreno e pesano le cellule.</li>
		<li>Risospendere le cellule accuratamente in 4 mL di soluzione di saccarosio ghiacciata (20 mM di Tris-HCl, pH 7.5; 25% (wt/vol) di saccarosio e 1 mM di EDTA) per grammo di cellule e incubare in ghiaccio per 15 min.</li>
		<li>Centrifugare a 8.500 x g (piano tavolo centrifuga, rotore ad angolo fisso), 4 ° C per 20 min. eliminare il surnatante (la frazione di saccarosio) e salvarlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Risospendere il pellet in un mix di 5mm ghiacciata di MgCl2 e 1 mM PMSF (4 mL per grammo di cellule). Aggiungere 40 µ l dello stock di lisozima (15 mg/mL) per grammo e incubare in ghiaccio per 30 min.</li>
		<li>Centrifugare a 8.500 x g (centrifuga piano tavolo, angolo rotore fissata), 4 ° C per 20 min. trasferimento il surnatante (la frazione periplasmico) e salvarlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Combinare la frazione di saccarosio e la frazione periplasmico e centrifugare a 30.000 x g, 4 ° C per 30 min. eliminare il surnatante e salvarlo in una provetta conica da 50 mL su ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificazione di affinità NI-NTA<ol>
<li>Risospendere 1 mL di Ni-NTA agarosio mescolando accuratamente per ottenere una sospensione omogenea, rimuovere 1 mL di agarosio Ni-NTA a un tubo conico di fresco da 15 mL e aggiungere 10 buffer di equilibrazione volumi (CV) colonna (25 mM di Tris-HCl, pH 7.5; 1 M di NaCl) per equilibrare.</li>
		<li>Centrifugare a 400 x g per 5 min e rimuovere il surnatante con attenzione. Quindi, aggiungere l'agarosio Ni-NTA nella provetta 50 mL contenente la frazione di saccarosio e la frazione periplasmico. Roccia a 4 ° C per 2 h.</li>
		<li>Centrifugare la miscela a x 400 g, 4 ° C per 5 min. rimuovere con attenzione il sovranatante in un'altra provetta ghiacciata fresca come la frazione non legata. Trasferire l'agarosio Ni-NTA in una colonna di gravità.</li>
		<li>Aggiungere 10 CV del tampone di lavaggio (25 mM di Tris-HCl, pH 7.5; 1 M di NaCl; 20 mM, 30 mM o 40 mM di imidazolo) per la colonna e raccogliere il elute come la frazione di lavaggio. Nota: Queste soluzioni devono essere aggiunto al fine di aumentare le concentrazioni di imidazolo.</li>
		<li>Aggiungere 3 CV di eluizione buffer (25 mM di Tris-HCl, pH 7.5; 300 mM di NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 o 400 mM di imidazolo) alla colonna e raccogliere il elute come frazione di eluizione 1, 2, 3 e 4. Nota: Queste soluzioni devono essere aggiunto al fine di aumentare le concentrazioni di imidazolo.</li>
		<li>Dialisi le frazioni eluite in 2 L di PBS (137 millimetri di NaCl, 2,7 millimetri di KCl, 10 millimetri di Na2HPO4, 2mm di KH2PO4, pH 7.4) utilizzando tubi di dialisi (12,4 kDa) a 4 ° C per 2 h. verificare la presenza di GPC3-S-Fab 12% SDS-PAGE e quindi di Colorazione blu di Coomassie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificazione di affinità di igG-CH1<ol>
<li>Trasferire 1 mL di resina di affinità di IgG-CH1 in una provetta conica da 50 mL e lavare le perle con PBS in primo luogo. Quindi, aggiungere la soluzione dializzata contenente GPC3-S-Fab dopo passo 3.2.6. Roccia a 4 ° C per 2 h.</li>
		<li>Centrifuga a 400 x g per 5 min, 4 ° C. Con attenzione rimuovere il surnatante in un'altra provetta ghiacciata fresca e trasferire la resina a una colonna di gravità.</li>
		<li>Aggiungere 10 CV di lavaggio buffer (PBS) alla colonna e raccogliere l'eluizione come la frazione di lavaggio.</li>
		<li>Preparare i tubi di raccolta aggiungendo 1 M Tris pH 9.0 (0,1 mL di ciascuna frazione eluite per mL). Eluire con tampone di eluizione 3 CV (0,1 M di glicina-HCl, pH 2,7) e raccogliere la frazione eluita; Ripetere 3 volte.</li>
		<li>Dialisi le frazioni eluite in 2 L di PBS utilizzando tubi di dialisi (12,4 kDa) a 4 ° C per 2 h. Ripetere due volte.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di proteina di ultramicrospectrophotometer (coefficiente di estinzione molare: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS-PAGE e Western blotting analisi
<ol><li>Prendere un 10 µ l del campione in 5 x buffer di caricamento SDS e mescolare bene. Far bollire la miscela di proteine a 100 ° C per 5 min.<ol>
<li>Preparare il tampone di caricamento SDS: 5x: 250 mM di Tris-HCl, pH 6.8, 10% wt/vol SDS, 0,5% wt/vol bromofenolo, glicerolo vol/vol di 50%, 5% vol/vol beta-mercaptoetanolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare un gel di SDS-PAGE con un gel di caricamento (5%) e gel di separazione (12%) come descritto in precedenza26,27,28.</li>
	<li>Caricare 10 µ l della miscela proteica bollito e indicatore di proteina ed eseguire la SDS-PAGE.</li>
	<li>Macchiare il gel agitando per 20 min con soluzione di blu brillante Coomassie e quindi eseguire decolorante.</li>
	<li>Per macchiarsi occidentale, dopo aver trasferito ad una membrana PVDF, bloccare la membrana con TBST (20 mM di Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% vol/vol Tween 20) + 5% wt/vol schiumare il latte per 1 h a temperatura ambiente agitando.</li>
	<li>Incubare la membrana con gli anticorpi primari (anti-sua o Anti-Flag) diluito 1:2,000 in TBST + 5% latte scremato per 1 h.</li>
	<li>Lavare con TBST per 5 min a temperatura ambiente e ripetere per 3 volte.</li>
	<li>Incubare la membrana in 1:2,000 di anticorpo secondario (HRP-collegata di anticorpo anti-topo Fc) diluito in TBST + 5% latte scremato per 1 h.</li>
	<li>Lavare con TBST per 5 min a temperatura ambiente e ripetere per 3 volte.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di substrato HPR per ogni film, sviluppare e prendere le immagini.</li>
</ol>5. gel filtrazione analisi
<ol><li>Utilizzare la seguente colonna: volume di colonna di 24 mL; Buffer di equilibrazione di PBS pH 7.4; Portata di 0,5 mL/min a camera temperato; Volume di campione di 200 µ l.</li>
	<li>Utilizzare il seguente volume di proteine e concentrazione: 500 µ l di 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifugare a 20.000 x g per 30 min e prendere 200 µ l per caricare.</li>
	<li>Per la proteina marker volume e concentrazione, prendere 100 µ l del citocromo C (2 mg/mL, 12,4 kDa), 140 µ l di anidrasi carbonica (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µ l di albumina (10 mg/mL, 66 kDa) e 200 µ l di alcol deidrogenasi (5 mg/mL, 150 kDa) in una provetta. Centrifugare a 20.000 x g per 30 min e prendere 200 µ l per caricare.</li>
	<li>Prima di ogni esecuzione, lavare con almeno 2 CV di acqua distillata a una portata di 0,5 mL/min.</li>
	<li>Equilibrare la colonna con almeno 2 CV del buffer di equilibrazione (PBS, pH 7.4) ad una portata di 0,5 mL/min.</li>
	<li>Automaticamente iniettare il campione a 0,5 mL/min per caricare il campione.</li>
	<li>Eluire con buffer di equilibrazione a 0,5 mL/min e rilevare a 280 e 215 nm.</li>
</ol>6. analisi di citometria a flusso di
<ol><li>Cultura la HepG2 Hep3B (GPC3 positivo), (GPC3 positivo), Huh7 (GPC3 positivo) e le cellule MHCC - 97H (GPC3 negativo) in piatti di plastica 100 x 20 mm contenente mezzo DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS), penicillina (100 µ g/mL) e streptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Cultura CHO (GPC3 negativo) e cellule CHO/GPC3 che harboring il full-length cDNA umano GPC3 (GPC3 positivo) in piatti di plastica 100 x 20 mm contenente medium RPMI 1640 con 10% FBS, penicillina (100 µ g/mL) e streptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Coltura del NK92/CD16 che harboring il full-length cDNA umano CD16 (CD16 positivo) in bottiglia di2 25cm contenente medium RPMI 1640 con 10% FBS, penicillina (100 µ g/mL) e streptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Quando le cellule sono 70-90% confluenti, eliminare il terreno e lavare le cellule con 2 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina 0,25% e incubare a 37 ° C per 2-3 minuti (o fino a quando le cellule iniziano a staccare dalla superficie). Aggiungere 1 mL di mezzo di sviluppo completo per neutralizzare la tripsina e risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù.</li>
	<li>Contare i numeri di cellulare utilizzando un emocitometro Neubauer e rilevare l'attuabilità delle cellule da Trypan Blue.</li>
	<li>Raccogliere 3 x 106 cellule per ogni linea cellulare. Aggiungere 1 mL di PBS + 0,2% di BSA per risospendere le cellule. Centrifuga a 200 x g, 4 ° C per 5 min, Ripeti due volte.</li>
	<li>Aggiungere 0,3 mL di PBS + 0,2% di BSA per risospendere le cellule e trasferire 100 µ l (circa 1 milione) in ogni provetta da 5 mL di turno-fondo in polistirolo. Nota: Si prega di assicurarsi di tutte le misure da qui per i tubi dovrebbero essere tenute a fredde su ghiaccio. Quando l'anticorpo è vincolante per l'antigene di superficie delle cellule, il complesso inizierà a interiorizzare. Da mantenerlo freddo, il processo è rallentato in modo significativo.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di anticorpi primari (GPC3-S-Fab o umana IgG1, concentrazione finale 5 µ g/mL) ad ogni tubo e incubare in ghiaccio per 1 h.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS + 0,2% di BSA a lavare e centrifuga a 200 x g, 4 ° C per 5 min, ripetere tre volte.</li>
	<li>Risospendere in 100 µ l di PBS + 0,2% di BSA e quindi aggiungere 0,5 µ l di anticorpo secondario (anti-umano IgG(H+L)-488, finale concentrazione 10 µ g/mL) e incubare in ghiaccio per 1 h. Nota: da questo passaggio, si prega di tenere le cellule dalla luce.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS + 0,2% di BSA a lavare e centrifuga a 200 x g, 4 ° C per 5 min, ripetere tre volte.</li>
	<li>Analizzare le cellule da citometro a flusso secondo il protocollo standard29. Acquisire le cellule con un laser di 488 nm per l'eccitazione.</li>
</ol>7. citotossici saggi
<ol><li>Preparare le cellule del tumore.<ol>
<li>Cultura HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H e CHO linee cellulari come descritto ai punti 6.1-6.5.</li>
		<li>Diluire le cellule a 0,5/ml di5× 10 e 100 µ l cellule (5.000 per pozzetto) su piastre a 96 pozzetti della lastra. 6-8 h per consentire alle cellule di collegare la cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC).<ol>
<li>Diluire il sangue fresco preparato con un volume uguale di PBS in una provetta conica da 50 mL. Ad esempio, diluire 10 mL di sangue con 10 mL di PBS.</li>
		<li>Prendere 15 mL di terreno di separazione dei linfociti in un tubo conico di fresca 50 mL. Trasferire lentamente il sangue diluito sul supporto del linfocita separazione lungo il lato del tubo. Nota: Tenere il tubo verticale. Non rompere la superficie del mezzo di separazione del linfocita.</li>
		<li>Centrifugare a 400 x g per 35 min a temperatura ambiente con il freno fuori.</li>
		<li>Lentamente rimuovere lo strato superiore del plasma e prendere il livello di sangue bianco contenente PBMCs presso l'interfaccia media di separazione del plasma del linfocita.</li>
		<li>Diluire il PBMCs con un doppio volume di PBS + 2% FBS. Centrifugare a 400 x g per 5 min.</li>
		<li>Lavare le cellule due volte con PBS + 2% FBS. Centrifuga a 400 x g per 5 min, contare il numero di cellulare come descritto al punto 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare le cellule NK.<ol>
<li>Preparare la sospensione di PBMCs ad una concentrazione di 5 x 107 cellule/mL in PBS + 2% FBS e posto loro in una provetta da 5 mL di turno-fondo in polistirolo.</li>
		<li>Aggiungere delle cellule NK umane arricchimento Cocktail a 50 µ l/mL delle cellule. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		<li>Risospendere le particelle magnetiche dalla cellula NK kit di arricchimento e mescolare bene per garantire in modo uniforme sono sospese pipettando su e giù con forza più di 5 volte. Trasferire il sedimento particelle magnetiche a 100 µ l/mL sospensione delle cellule. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Portare la sospensione cellulare fino a un volume totale di 2,5 mL aggiungendo PBS + 2% FBS. Mescolare le cellule nel tubo pipettando delicatamente su e giù per 2 - 3 volte. Inserire il tubo (senza cap) il magnete. Lasciate che i branelli magnetici stabilirsi per 2,5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il magnete. In un movimento continuo, capovolgere la provetta, versando fuori la sospensione cellulare arricchito in un nuovo tubo.</li>
		<li>Contare i numeri di cellulare come descritto al punto 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare la reazione citotossica.<ol>
<li>Diluire le cellule NK a 5 × 105 cellule/mL utilizzando il terreno di coltura corrispondente. Aggiungere 100 µ l della sospensione di cellule NK alle cellule del tumore placcate su una piastra a 96 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l di GPC3-S-Fab a differenti concentrazioni, con la più alta dose ad una concentrazione finale di 30 µ g/mL, 3 volte diluizione, 9 punti (tre repliche).</li>
		<li>Incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 72 h.</li>
		<li>Dopo 72 h di incubazione, rimuovere il mezzo e aggiungere 100 µ l di terreno DMEM contenente 10 µ l di reagente CCK8 in ciascun pozzetto in piastre da 96 pozzetti e poi incubare a 37 ° C.</li>
		<li>Leggere la piastra a 450 nm a 1, 2, 3 e 4 h dopo l'aggiunta del reagente di CCK8.</li>
		<li>Analizzare i dati. Calcolare il tasso di sopravvivenza come (OD450 GPC3-S-Fab + effettrici + tumore - OD450 medio) / (OD450 tumore - OD450 medio) × 100% e (OD450 GPC3-S-Fab + tumore - OD450 medio) / (OD450 tumore - OD450 medio) × 100%. Le cellule effettrici sono cellule NK.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

In questo studio, presentiamo una strategia per costruire un nuovo formato di bsAbs, GPC3-S-Fab, che possono reclutare cellule NK mirare alle cellule del tumore positivo GPC3. La S-Fab è basato sul Fab naturale formato con l'aggiunta di un anti-CD16 VHH11,12. Confrontato con la regione di Fc contenente bsAbs, GPC3-S-Fab possono essere prodotte facilmente nel Periplasma dei batteri su larga scala.
Utilizzando la strategia di espressione...

Gli anticorpi monoclonali sono ora ampiamente utilizzati per cancro trattamento1. Grazie alla flessibilità degli anticorpi, vari formati basati su anticorpi sono stati esplorati attivamente. Rispetto agli anticorpi monoclonali, bsAbs hanno due moduli di associazione differenti dell'antigene, consentendo loro di riconoscere due bersagli contemporaneamente e in modo efficiente innescano il reclutamento di cellule immunitarie effettrici per colpire e uccidere le cellule di tumore2.
Formati attuali bsAb ricombinante possono essere generalmente assegnati a due classi: Fc-contenente bsAbs e bsAbs senza una regione Fc. Rispetto ai formati contenenti Fc che sono prodotti principalmente in cellule di mammifero, bsAbs senza una regione Fc hanno i vantaggi di più piccole dimensioni, sono più facilmente prodotti in sistemi di espressione del microorganismo e può penetrare tessuti del tumore in modo più efficiente 3.
bsAbs senza una regione Fc sono formate comunemente collegando moiety singola associazione, ad esempio frammenti di catena singola variabile (scFvs) o Fabs3. Senza i domini stabilizzanti, bsAbs basato su frammenti di scFv spesso hanno compromesso la stabilità termica, bassa solubilità o un potenziale aumento di aggregazione4,5. Al contrario, basati su Fab bsAbs sono più stabili a causa l'eterodimerizzazione del CH1 e CL in nativo frazione Fab4,6.
Dominio variabile da anticorpi solo pesante-catena (VOX, noto anche come anticorpi di singolo dominio) sono il frammento attivo antigene-legante di catena pesante naturale anticorpi7. VOX ha le caratteristiche di alta affinità, specificità del convenzionale IgGs8, bassa immunogenicità e alti rendimenti in espressione batterica9. Rispetto ai frammenti di Fv, Vox hanno maggiore stabilità termica10. Rispetto ai Fab moiety, Vox hanno dimensioni inferiori a causa della mancanza di CH1 e CL. Così, S-Fab, il formato di bsAb ottenuto collegando il favoloso con un anticorpo di singolo dominio, inquinamenti, è stato progettato e studiato per suoi effetti anti-tumorali11,12.
In questo studio, la costruzione di GPC3-S-Fab collegando il Fab di hGC3313 con un anti-CD16a VHH14 è stata descritta. Il GPC3-S-Fab può essere prodotto in modo efficiente dall'espressione periplasmica in Escherichia coli (Escherichia coli). Gli studi funzionali di GPC3-S-Fab ha suggerito che GPC3-S-Fab è una strategia promettente per la terapia del cancro del fegato. Così, i vantaggi di GPC3-S-Fab su tecniche alternative con riferimenti applicabili agli studi precedenti includono facile produzione e purificazione e bsAbs più stabile.
Sistemi di espressione dei mammiferi e sistemi di espressione procariotici sono stati utilizzati per esprimere vari formati di BsAbs. Contrariamente ai sistemi di espressione dei mammiferi, e. coli-sistemi di espressione della proteina di base hanno molti vantaggi, tra cui alti rendimenti, basso costi e risparmio di lavoro, la facilità di manipolazioni genetiche e di trasformazione ad alta efficienza15. Per bsAbs espressione in e. coli, ci sono due strategie di base: espressione nel citoplasma ed espressione nel Periplasma tra il citoplasma e membrane cellulari esterno15. Rispetto per l'ambiente riducente di citoplasma, il Periplasma è un ambiente, che promuove il corretto ripiegamento più ossidanti e la co-espressione di proteine16. Piegatura corretta svolge un ruolo chiave nella generazione di solubilità, stabilità e funzione di bsAbs. Di conseguenza, un pelB di sequenza segnale è stato aggiunto al N-terminale della S-Fab per dirigere la secrezione per il Periplasma di e. coli17. Per garantire la corretta pieghevole, solubilità, stabilità termica e stabilità conformazionale, riducendo la complessità e la dimensione di un anticorpo è frequentemente impiegato16. Il formato S-Fab è costituito da un Fab e uno VHH, che si esprime molto bene in sistemi batterici probabilmente dovuto la struttura semplice e di piccole dimensioni.
GPC3 è stato scelto in questo formato di anticorpo anticorpo GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) è un membro della famiglia di proteoglycan solfato (HS) di eparina che è ancorata alla superficie delle cellule attraverso glicosilfosfatidilinositolo (GPI)18. GPC3 è iperespresso nel 70% dei casi di carcinoma (HCC) epatocellulare, che rappresentano la maggior parte dei tumori del fegato19,20,21,22. Poiché GPC3 è raramente espresse in tessuti normali, GPC3 è stato proposto come un potenziale bersaglio per HCC. Più anticorpi monoclonali di topo sono state prodotte contro GPC3. Tuttavia, solo GC33 ha esibito un'attività anti-tumorale limitata 22, e non è riuscito a mostrare l'efficacia clinica in pazienti. In questo studio, GPC3-S-Fab è stato indicato per essere in grado di reclutare le cellule NK per uccidere GPC3 tumore cellule14.
Per reclutare le cellule NK, anti-CD16 VHH è stato utilizzato. CD16a è un recettore a bassa affinità IgG, espresso principalmente sulle cellule natural killer (NK), macrofagi, monociti e alcuni sottotipi di cellule T. È coinvolto nella citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) di cellule NK23. Cellule NK umane possono essere suddivise in due tipi, CD56 - CD16 + e CD56 + CD16-. Contrariamente alle cellule NK CD56 + CD16−, CD56-cellule CD16 + NK possono rilasciare livelli più elevati di perforina e granzyme B e presentano quindi una forte citotossicità24. Cellule di Kupffer (KCs), esprimendo CD16a, sono i macrofagi residenti nel fegato. Cellule di Kupffer giocano un ruolo importante nella soppressione di cancro del fegato25. Quindi, bsAbs CD16a di targeting può essere una strategia più promettente rispetto coinvolgente cellule T contro il cancro del fegato.

<table><tbody><tr><td>Incubatore a scuotimento</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a tregua</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Coltro Beckman</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro a raggi ultravioletti</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio analitico per elettroforesi su gel di poliacrilammide</td><td>Mini-PROTEAN&reg; Apparato Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Trans-blot</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging</td><td>Bio-rad</td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Cromatogramma liquido a proteine veloci</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>GF colonna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>Coltro</td> <td>BeckmanFC500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision lettore di piastre</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>Anti His-tag</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag-tag</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano(H& L)-488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-topo IgG HRP-linked</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agarose</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 resina di affinità</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Kit di arricchimento cellulare NK</td><td>Stemcell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>Magnete</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 kit</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Marcatore standard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>Filtrazione su gel</td></tr><tr><td>Isopropil-b-D-tio-galattopiranoside (IPTG)</td><td>Prodotti chimici VWR</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per dialisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>Knanamycine</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>glicina</td><td>aladdin</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>aladdin</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sangon Biotech</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio, monobasico anidro (KH2PO4)</td><td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio, bibasico, anidro (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blu brillante R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>piatto di plastica da 100 mm x 20 mm</td><td>Fiaschetta Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>cluster di coltura cellulare a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>la collezione di cultura del tipo dell'Accademia cinese delle scienze</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>la collezione di cultura del tipo dell'Accademia cinese delle scienze</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>la collezione di cultura del tipo dell'Accademia cinese delle scienze</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>la collezione di cultura del tipo dell'Accademia cinese delle scienze</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>la collezione Type Culture dell'Accademia cinese delle scienze</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

un targeting gpc3 bispecifico, gpc3-s-fab, con potente citotossicità

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Questo protocollo descrive la costruzione e gli studi funzionali di un bispecifico (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs in grado di riconoscere due epitopi diversi attraverso le due armi diverse. bsAbs sono stati attivamente studiati per la loro capacità di reclutare direttamente le cellule immunitarie per uccidere le cellule del tumore. Attualmente, la maggior parte dei bsAbs è prodotte in forma di proteine ricombinanti, come Fc-contenenti bsAbs o come più piccolo bsAb derivati senza regione Fc. In questo studio, è stato progettato GPC3-S-Fab, un anticorpo frammento (Fab) base bispecifico, collegando il Fab dell'anticorpo anti-GPC3 GC33 con un anticorpo anti-CD16 di singolo dominio. Il GPC3-S-Fab può essere espressa in Escherichia coli e purificato da due cromatografie di affinità. Purificata GPC3-S-Fab in particolare può associare a e uccidere le cellule di cancro del fegato positivo GPC3 reclutando cellule natural killer, suggerendo una potenziale applicazione di GPC3-S-Fab nella terapia del cancro del fegato.

Purificazione di GPC3-S-Fab
GPC3-S-Fab è stato purificato da e. coli mediante una purificazione di affinità in due fasi, prima con Ni-NTA-agarosio, seguita da purificazione di affinità di IgG-CH1. Dopo la purificazione di affinità in due fasi, GPC3-S-Fab è stato purificato per omogeneità con le due catene vicino a 1:1 (Figura 2A). La presenza di polipeptidi sia VHH VH-CH1-C...

Qui, presentiamo un protocollo per produrre un bispecifico GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Purificata GPC3-S-Fab ha potente citotossicità contro le cellule di cancro del fegato positivo GPC3.

Un targeting GPC3 bispecifico, GPC3-S-Fab, con potente citotossicità

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo degli anticorpi bispecifici, ad esempio come produrre un anticorpo bispecifico nei batteri e determinare la funzione dell'anticorpo purificato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che GPC3-S-Fab può essere facilmente prodotto e purificato da E.coli. Per preparare la frazione periplasmatica, centrifugare prima la sospensione cellulare a 4.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi, espellere il terreno e pesare le cellule. Dopo la centrifugazione, sciogliere il pellet cellulare in quattro millilitri di soluzione di saccarosio ghiacciata per ogni grammo di cellule. Incubare la sospensione cellulare su ghiaccio per 15 minuti.Dopo 15 minuti, centrifugare la sospensione cellulare a 8,500 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, pipettare il surnatante contenente la frazione di saccarosio e conservarlo in ghiaccio. Risospendere il pellet cellulare in una miscela ghiacciata di cloruro di magnesio da cinque millimolari e PMSF da un millimolare.Quindi, aggiungere 40 microlitri di 15 milligrammi per millilitro di stock lisosomiale alla sospensione cellulare. Dopo aver aggiunto il brodo lisosomico, lasciare la sospensione cellulare in ghiaccio per 30 minuti. Al termine del periodo di incubazione, unire il saccarosio e le frazioni periplasmatiche.Quindi, centrifugare la frazione saccarosio-periplasmatica a 30.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, trasferire il surnatante in una provetta conica da 50 millilitri con ghiaccio. Quindi, mescolare e risospendere un millilitro di agarosio di nichel-NTA con il surnatante per ottenere una sospensione omogenea, quindi un millilitro di agarosio di nichel-NTA in un tubo conico fresco da 15 millilitri.All'agarosio, aggiungere 10 volumi di colonna del tampone di equilibrio. Quindi, centrifugare l'agarosio a 400 g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il surnatante e aggiungere l'agarosio di nichel-NTA alla frazione saccarosio-periplasmatica.Quindi, agitare il tubo contenente la frazione periplasmatica di saccarosio a quattro gradi Celsius per due ore. Anche in questo caso, centrifugare il composto. Quindi, rimuovere con cura il surnatante in un tubo fresco ghiacciato poiché questa è la frazione non legata.Dopo che il surnatante è stato trasferito, aggiungere l'agarosio di nichel-NTA nella colonna gravitazionale. Quindi, aggiungere tre volumi di colonna di tampone di eluizione alla colonna. Quindi, raccogli l'eluato come frazioni di eluizione rispettivamente uno, due, tre e quattro.Diluire e seminare 5.000 cellule in 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per sei-otto ore per l'attaccamento. Per preparare le PBMC, diluire prima il sangue appena preparato con un volume uguale di soluzione salina tamponata con fosfato in una provetta conica da 50 millilitri.Pipettare 15 millilitri di terreno di separazione dei linfociti in una provetta conica fresca da 50 millilitri. Quindi, trasferire con cura il sangue diluito lungo le pareti della provetta al mezzo di separazione dei linfociti. Centrifugare le celle a 400 g per 35 minuti a temperatura ambiente con i freni chiusi.Dopo la centrifugazione, estrarre con cura lo strato superiore di plasma. Quindi, pipettare lo strato di sangue bianco contenente le PBMC. Diluire queste PBMC ottenute con il doppio del volume di soluzione salina tamponata con fosfato con siero bovino fetale al 2%.Quindi, centrifugare la sospensione PBMC. Lavare il pellet cellulare con soluzione fisiologica tamponata con fosfato contenente il 2% di siero fetale bovino e centrifugare nuovamente. Dopo la centrifugazione, contare il numero di cellule.Per preparare le cellule natural killer, ricostituire le PBMC in soluzione salina tamponata con fosfato con soluzione fisiologica fetale bovina al 2%. Quindi, trasferire il composto in un tubo di polistirolo a fondo tondo. Aggiungere 50 microlitri per millilitro di cocktail di arricchimento cellulare natural killer alla miscela PBMC.Mescolare il contenuto e lasciare il tubo per 10 minuti. Successivamente, risospendere e mescolare le particelle magnetiche presenti nel cocktail di arricchimento pipettando più volte, in modo che le particelle siano sospese in modo uniforme. Quindi, aggiungere 100 microlitri per millilitro di particelle magnetiche alla sospensione cellulare.Mescolare le particelle magnetiche della sospensione cellulare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti, aggiungere 2,5 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato con siero fetale bovino al 2% alla sospensione cellulare. Pipettare delicatamente due o tre volte per mescolare le cellule nella provetta.Posiziona il tubo sul magnete e lascia riposare le perle magnetiche per 2,5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, con un solo colpo d'azione, capovolgere il tubo e versare la sospensione cellulare arricchita in un nuovo tubo. Ancora una volta, conta il numero di celle.Una volta terminato il conteggio, diluire le cellule natural killer nel terreno di coltura. Quindi, aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare alle cellule tumorali piastrate in una piastra a 96 pozzetti. Per impostare i test di citotossicità, aggiungere 10 microlitri di concentrazioni variabili di anticorpo GPC3-S-Fab alla piastra a 96 pozzetti.Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 72 ore. Trascorso il tempo di incubazione designato, aspirare il terreno. Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno DMEM contenente 10 microlitri di reagente CCK in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.Ancora una volta, incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, leggere la piastra a 450 nanometri ogni ora consecutiva fino a quattro ore dopo l'aggiunta del reagente CCK8. L'anticorpo GPC3-S-Fab viene purificato utilizzando una purificazione di affinità in due fasi.Qui, i due pannelli mostrano che l'anticorpo viene purificato utilizzando rispettivamente le colonne di purificazione per affinità di nichel-NTA agarosio e IgG-CH1. Successivamente, l'affinità di legame dell'anticorpo GPC3-S-Fab viene valutata utilizzando linee cellulari tumorali GPC3-positive e negative. La GPC3-S-Fab si lega a tutte le cellule GPC3-positive, come Hep3B, Huh7, Hep2G e CHO/GPC3.È interessante notare che quando si utilizzano cellule GPC3-negative, come MHCC-97H e CHO, si osserva un legame minimo o nullo. La citotossicità del GPC3-S-Fab è studiata anche in presenza di cellule tumorali incubate con cellule natural killer fresche. L'anticorpo GPC3-S-Fab suscita una forte citotossicità contro le sette cellule HepG2, Hep3B e Huh7 in modo dose-dipendente in presenza delle cellule natural killer.Tuttavia, tale citotossicità non è osservata in assenza delle cellule natural killer sulle cellule MHCC-97H. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere i passaggi sul ghiaccio.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la modellazione dello xenotrapianto per rispondere a ulteriori domande, come l'effetto tumorale in vivo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo degli anticorpi bispecifici per esplorare gli effetti antitumorali in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre un anticorpo bispecifico funzionale mirato alle cellule tumorali, in particolare l'isolamento delle cellule NK.

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Eliminare cellule specifiche senza danneggiare altre cellule è estremamente difficile, specialmente nei tessuti consolidati, ma c'è un urgente bisogno di un metodo di eliminazione cellulare nel campo dell'ingegneria tissutale. Qui, presentiamo un metodo per l'eliminazione di cellule specifiche da una coltura cellulare 3D mista utilizzando la fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT).

Selective cellulare eliminazione dalla misto Cultura 3D utilizzando una tecnica Near Infrared Photoimmunotherapy

Descriviamo un sistema quantitativo di analisi della citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico che prendono di mira le cellule tumorali liquide e solide. Questo protocollo può essere esteso per valutare altre cellule echeggiatrici immunitarie, così come i trattamenti combinati.

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Questo lavoro descrive la sintesi e la caratterizzazione di un omo-PROTAC bimalidomide a base di pomalimmide come un nuovo approccio per indurre l'ubiquitinazione e la degradazione della cereblon della ligase dell'ubiquitina E3 (CRBN), l'obiettivo degli analoghi di talidomide.

Inattivazione chimica dell'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon da parte di Homo-PROTAC con sede a Pomeredomide

Lo sviluppo di un coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF) è nuovo per l'eliminazione di anticorpi nocivi. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi della molecola DCAF1, che può bloccare selettivamente l'anticorpo 4G2 per eliminare l'effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi durante l'infezione da virus Dengue.

Blocco mirato degli anticorpi da parte di un coniugato dual-funzionale di Peptide antigenico e mimetica Fc-III (DCAF)

Qui presentiamo un protocollo per studiare la localizzazione in vivo degli anticorpi nei modelli di xenograft tumorale dei topi.

Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio

Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane con luciferasi per facilitare il monitoraggio in vivo del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici ai tumori in studi per valutare l'efficacia antitumorale e il meccanismo degli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T.

Monitoraggio del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici utilizzando cellule T umane trasdotte dalla luciferasi

Questo protocollo presenta una tecnica automatizzata ad alto rendimento basata su immagini per identificare i composti che modulano l'uccisione delle cellule di cancro al seno mediate da cellule natural killer in presenza di un anticorpo terapeutico anti-HER-2.

Test di screening ad alto contenuto per l'identificazione di composti modificanti la citotossicità cellulare anticorpo-dipendenti

Qui, presentiamo un metodo per identificare i composti che modulano il meccanismo ADCC, un importante meccanismo di uccisione delle cellule tumorali degli anticorpi antitumorali. L'effetto citotossico delle cellule NK è misurato negli sferoidi delle cellule del cancro al seno in presenza di Trastuzumab. L'analisi delle immagini identifica le cellule killer vive e morte e le cellule bersaglio negli sferoidi.

Quantificazione della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente in un modello di sferoide tumorale: applicazione per la scoperta di farmaci

Qui, presentiamo un metodo per differenziare ed espandere le cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) derivato da iPSC umano con una migliore uccisione contro vari tumori maligni. Questo protocollo dimostra la differenziazione e l'espansione di cellule CAR-NK derivate da iPSC ottimizzate per natural killer (NK) e la misurazione dell'attività antitumorale contro varie linee cellulari tumorali.

Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, descriviamo un metodo per creare goccioline a doppia emulsione che incapsulano una cellula T e una cellula bersaglio del cancro per esaminare l'uccisione cellulare a livello di singola cellula. Questo metodo consente la doppia quantificazione sia delle molecole citotossiche che dell'apoptosi delle cellule bersaglio all'interno di un'ampia popolazione di cellule T.

Saggio di citotossicità basato su goccioline per valutare le cellule T del recettore dell'antigene chimerico a livello di singola cellula

Scopri come produrre l'anticorpo bispecifico GPC3-S-Fab in Escherichia coli e valutarne la citotossicità contro le cellule tumorali epatiche GPC3-positive. Questo metodo semplifica la purificazione per la ricerca sul cancro.

Un targeting GPC3 bispecifico, GPC3-S-Fab, con potente citotossicità

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