Oligomero di β-amiloide a11-positiva preparazione e valutazione utilizzando Dot Blotting analisi
22 maggio 2018
Questo protocollo descrive come preparare oligomeri Aβ da un peptide sintetico in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero Aβ da un punto di analisi macchiante.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo neurofarmacologico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, affidabile e riproducibile formare oligomero di amiloide-beta. Mostriamo che la dimostrazione di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi per la preparazione dell'oligomero beta sono difficili da imparare.
Innanzitutto, regolare la concentrazione della soluzione di monomero A-beta a 0,25 milligrammi per millilitro aggiungendo 900 microlitri di acqua distillata doppia al tubo. Quindi continuare ad evaporare la soluzione monomerica con azoto gassoso ad alta purezza fino a quando il volume raggiunge circa 850 microlitri con una concentrazione di circa 0,29 milligrammi per millilitro. La presenza di HR5P influisce sulla formazione dell'oligomero A-beta.
Pertanto, l'evaporazione il più possibile è una fase fondamentale di questa procedura. Successivamente, utilizzare acqua distillata doppia per diluire la soluzione madre di curcumina per preparare una soluzione di lavoro di 0,2 e due micromolari. Mantenere un rapporto di uno a uno e mescolare la soluzione A-beta con la curcumina per ottenere la concentrazione finale di curcumina a 0,1 e un micromolare.
Quindi, lasciare la soluzione su un agitatore magnetico. Fissare una scatola divisoria di plastica all'agitatore magnetico. Posizionare due ancorette magnetiche ai due angoli della scatola, quindi posizionare le provette con i campioni al centro della scatola.
Continuare ad agitare la scatola a temperatura ambiente per 48 ore a 60 giri al minuto, quindi centrifugare la provetta a 18.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante. Per l'analisi del dot blotting, prendere una membrana di nitrocellulosa e tagliarla in strisce larghe un centimetro, quindi posizionare due microlitri di campione in modo uniforme sulle strisce uno e due con un intervallo di ogni punto a 0,5 centimetri.
Quando si spruzza il campione sulla membrana, è necessario distribuirlo uniformemente e le diverse goccioline sono controllate in modo che i diversi campioni non siano collegati tra loro. Quindi, incubare le strisce a temperatura ambiente per cinque minuti affinché le goccioline si asciughino. Dopo cinque minuti, incubare le strisce con il 5% di albumina sierica bovina per 30 minuti a temperatura ambiente.
Una volta terminata l'incubazione, lavare le strisce con tampone TBST per cinque minuti. Aspirare il tampone al termine del lavaggio, quindi incubare la prima striscia con l'anticorpo anti-oligomero A11 e la seconda con la soluzione di anticorpi anti-A-beta 6E10 per un'ora. Dopo un'ora, lavare le strisce con TBST per cinque minuti ogni tre volte, quindi aspirare il tampone e incubare le strisce con una soluzione di anticorpi secondari per 40 minuti.
Dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi, lavare nuovamente le strisce con TBST per cinque minuti ogni tre volte. Quindi, aggiungere circa 300 microlitri di liquido ECL miscelato sulla superficie delle strisce umide, quindi esporre le strisce in un sistema di imaging automatico a chemiluminescenza. Gli studi TEM mostrano l'assenza di aggregati visibili nella soluzione di monomero A-beta disciolto in HFIP, tuttavia dopo 48 ore di incubazione, gli stessi monomeri formano oligomeri, che sono principalmente aggregati globulari con un diametro da 10 a 80 nanometri.
Sottoponendo il monomero A-beta e i campioni ricchi di oligomeri all'analisi dot blot, mostra la presenza di oligomeri A-beta positivi per A11 in campioni ricchi di oligomeri A-beta. È interessante notare che i peptidi A-beta 6E10 positivi per l'A-beta sono presenti sia nel monomero A-beta che nei campioni ricchi di oligomeri. Successivamente, viene eseguita anche l'analisi semiquantitativa per esprimere il monomero A-beta positivo per anticorpi specifici e i campioni ricchi di oligomeri come percentuale del controllo.
I peptidi A-beta A11 positivi sono significativamente più alti nei campioni ricchi di oligomeri A-beta rispetto ai monomeri. Al contrario, il peptide A-beta positivo A-beta 6E10 è presente sia nel campione monomerico che in quello ricco di oligomeri. Infatti, gli oligomeri A-beta sono anche co-incubati con la curcumina e l'inibitore dell'oligomero A-beta.
La curcumina porta a una significativa riduzione della quantità relativa di oligomero A-beta positivo per A11 con una diminuzione della colorazione A11 nei campioni di oligomero A-beta co-incubati con curcumina. Tuttavia, le concentrazioni variabili di curcumina non influenzano il numero di peptidi A-beta nei campioni 6E10 positivi di monomero e oligomero rispetto ai campioni A11 positivi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in diverse ore se eseguita correttamente.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare farmaci candidati per disturbi neurodegenerativi come il morbo di Alzheimer. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare l'oligomero A-beta e di valutarne la quantità.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la preparazione di oligomeri di Aβ a partire da un peptide sintetico in vitro e la valutazione delle loro quantità relative mediante analisi di dot blot. Questo metodo è semplice, affidabile e riproducibile, rendendolo essenziale per la ricerca neurofarmacologica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neurofarmacologia
- Chimica biochimica
Sfondo
- Si ritiene che gli oligomeri di Aβ siano implicati nelle malattie neurodegenerative.
- Comprendere la loro formazione è fondamentale per lo sviluppo di terapie.
- I metodi attuali per la preparazione di questi oligomeri possono risultare complessi.
- Questo protocollo ha lo scopo di semplificare il processo per i ricercatori.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per la preparazione di oligomeri di Aβ.
- Facilitare la valutazione delle concentrazioni di oligomeri.
- Migliorare la riproducibilità negli esperimenti neurofarmacologici.
Metodi Utilizzati
- Regolazione della concentrazione del monomero A-beta a 0,25 mg/mL.
- Evaporazione della soluzione con gas azoto ad alta purezza.
- Monitoraggio degli effetti di HR5P sulla formazione di oligomeri.
- Utilizzo dell'analisi con dot blotting per la valutazione.
Risultati principali
- Il metodo produce con successo oligomeri di Aβ.
- L'analisi mediante dot blot consente di quantificare efficacemente le quantità di oligomeri.
- La presenza di HR5P influenza in modo significativo la formazione di oligomeri.
- Il protocollo dimostra un'elevata affidabilità e riproducibilità.
Conclusioni
- Questo protocollo semplifica la preparazione di oligomeri di Aβ.
- Fornisce uno strumento prezioso per la ricerca neurofarmacologica.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo affidabile.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La preparazione e la quantificazione affidabili di oligomeri di β-amiloide positivi per A11 sono fondamentali per la validazione precoce di bersagli nella neurodegenerazione e per lo screening di inibitori nella ricerca sulla malattia di Alzheimer. Questo protocollo consente la generazione riproducibile e la valutazione semi-quantitativa di specie oligomeriche tossiche, sostenendo la fiducia predittiva nei test delle ipotesi terapeutiche. Il metodo affronta direttamente un punto critico chiave per la riduzione del rischio meccanicistico e la selezione dei progetti nell'R&S neurofarmacologica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi della formazione di oligomeri di β-amiloide come fattore meccanicistico nella patologia di Alzheimer.
- Consente la validazione funzionale di specie neurotossiche mediante la specificità dell'anticorpo A11.
- Facilita la riduzione dei rischi associati a ipotesi terapeutiche mirate all'inibizione degli oligomeri.
- Fornisce un flusso di lavoro riproducibile per l'analisi comparativa di inibitori candidati.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara campioni arricchiti di oligomeri validati per campagne di screening di inibitori successivi.
- Fornisce risultati semi-quantitativi mediante dot blot per letture standardizzate dei saggi.
- Consente la rilevazione riproducibile di oligomeri positivi per A11 per la valutazione di composti.
- Supporta la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma nei flussi di screening per la neurodegenerazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la caratterizzazione degli oligomeri in vitro alle specie neurotossiche rilevanti per la malattia.
- Fornisce continuità dalla validazione nella fase di scoperta alla valutazione preclinica degli inibitori.
- Permette l'avanzamento mirato dei candidati molecolari in base a evidenze meccanicistiche.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali per interventi mirati agli oligomeri.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si integra nell'interfaccia tra la fase iniziale di scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, consentendo test di ipotesi solidi e lo sviluppo di saggi per portafogli dedicati alle malattie neurodegenerative.
- Biologia della scoperta: Supporta la validazione meccanicistica della tossicità degli oligomeri di β-amiloide e degli effetti degli inibitori.
- Screening: Fornisce output standardizzati e semi-quantitativi mediante dot blot per flussi di lavoro di screening di composti.
- Analisi: Permette la quantificazione comparativa di specie positive per A11 e 6E10 per decisioni basate sui dati.
- Ricerca traslazionale: Collega la valutazione degli oligomeri in vitro a modelli di neurotossicità rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riproducibile e scalabile per iniziative di ricerca continue sulle neurodegenerazioni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistica per la malattia di Alzheimer.
- Valore operativo: Fornisce una preparazione e una quantificazione standardizzate, riproducibili e scalabili degli oligomeri.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e l'efficienza del capitale consentendo schermate robuste di inibitori.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati terapeutici per la neurodegenerazione corretta in base al rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di peptidi e nelle tecniche di immunorilevamento.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per il dot blotting e sistemi di imaging chemiluminescente.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per una preparazione e un'analisi del campione riproducibili.
- Adattabile a diversi candidati inibitori e sistemi peptidici oligomerici.
- Dipende dalla specificità degli anticorpi e dai limiti dell'analisi semi-quantitativa.
