Name: Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Scopri come generare pancreatoidi tridimensionali esprimenti insulina da progenitori pancreatici di topo e10.5. Questo metodo consente di studiare la formazione delle cellule endocrine in un ambiente complesso con mesenchima.

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Jolanta Chmielowiec vi ringraziamo utile discussione per quanto riguarda il protocollo e il manoscritto. Ringraziamo anche Benjamin Arenkiel per l'accesso al microscopio confocale. Questo lavoro è stato supportato da NIH (P30-DK079638 a M.B.) e T32HL092332-13-m.a.s. e M.B., il fondamento medico di McNair (a M.B.) e il nucleo confocale al BCM intellettuale e centro di ricerca di inabilità inerenti allo sviluppo (NIH U54 HD083092 dal Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development).

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo metodo sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato del Baylor College of Medicine.
1. preparazione del Mouse giorno embrionale 10.5 progenitori del pancreas
Nota: Questo protocollo non ha bisogno di essere seguiti in condizioni sterili fino al passaggio 2, tuttavia è ottima per sterilizzare strumenti di dissezione e spruzzare prima di etanolo al 70% di utilizzare.
<ol><li>Per impostare per dissezione, riempire un secchio di ghiaccio e posizionare un contenitore di tampone fosfato salino (PBS) nel ghiaccio. Pulire due pinze a punta fine e forbici per dissezione con etanolo al 70%. Situato vicino alla zona di dissezione, un contenitore con almeno tre borosilicato capillare tubi, una pipetta di bocca, un accendino e filtrata puntali per pipette 1.000 µ l.<ol>
<li>Preparare almeno 1 mL di dispase freddo di 1,25 mg/mL diluito in acqua sterilizzata e posto nel secondo pozzetto di una piastra ben 12 su ghiaccio. Mettere PBS nel primo, terzo e quarto pozzi del 12 ben piatto. Posizionare 1 mL di 0.05% tripsina in un 1,5 mL tubo sul ghiaccio. Pre-riscaldare un agitazione incubatore a 37 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanasia e 10.5 topi temporizzato-incinta conformemente agli orientamenti IACUC. Spruzzare l'addome con etanolo al 70% per pulire la regione prima di effettuare un'incisione a forma di V nella zona genitale del mouse con delle forbici, pinze e continuarlo fino a diaframma. Nota: L'aspetto di un plug vaginale in questo protocollo indica giorno 0,5. Utilizzando 5 - 6-settimana-vecchi topi, un aumento di peso di più di 2 g agisce come misura secondaria di impregnazione di successo.<ol>
<li>Con attenzione asportare l'utero praticando un'incisione le porzioni superiore e laterale dell'utero, tirando l'organo verso l'alto dal mouse e a seguito di questa incisione verso la regione genitale prima di ripetere sul lato opposto. Posto in un 10cm Petri con il PBS freddo. Nota: È possibile ottenere organoids da cellule e11.5 dissociato, tuttavia a differenza del pancreatoids e 10.5, questi organoids non sono ancora caratterizzate e così non possono mantenere la capacità di differenziarsi in tutti i tre lignaggi principali del pancreas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sotto un microscopio chiaro dissezione, collocare la capsula di Petri e aprire con cautela il tessuto uterino posizionando due pinze tra ciascun embrione e peeling tessuto lontano il sacco vitellino. Trasferire gli embrioni afferrando il sacco vitellino delicatamente con forcipe e posto in un 10cm Petri con fresco, PBS freddo. Mettere la capsula di Petri sul ghiaccio. Nota: È importante rimuovere heedfully embrioni, preferibilmente mantenuti entro il sacco vitellino, come rimozione forzata può tirare il cordone ombelicale, lo strappo dei tessuti dell'embrione e compromettere l'integrità strutturale.</li>
	<li>Posto più PBS gocce su un coperchio di scatola di Petri di 10 cm. Utilizzare queste goccioline per trasferire l'embrione durante la dissezione come tessuti extraembryonic vengono rimossi per assicurare la visibilità. Trasferire un embrione a una goccia di PBS e rimuovere delicatamente dal sacco vitellino usando il forcipe, mentre i rimanenti embrioni soggiorno in PBS su ghiaccio (Figura 1A). Rimuovere la testina prima di spostare l'embrione di un nuovo calo di PBS utilizzando forcipe a scoop leggermente l'embrione, a non danneggiare il tessuto (Figura 1B). Nota: Il tessuto potrebbe essere necessario essere trasferiti più frequentemente alle goccioline di PBS fresche rispetto a quelli descritti qui, a seconda l'opacità del liquido.<ol>
<li>Una nuova caduta di PBS, rimuovere i germogli di zampa anteriore usando il forcipe (Figura 1B). Collocare la pinza nell'apertura dove era presente di arto e delicatamente strappare solo il tessuto più esterno anteriormente (Figura 1B). Ruotare l'embrione e ripetere in direzione posteriore, fermandosi sul nascere hindlimb. A questo punto, il tratto gastrointestinale dovrebbe essere visibile (Figura 1B).</li>
		<li>La regione posteriore del tratto gastrointestinale ha una leggera curva (Figura 1F). Inserire la pinza dietro questa curva nell'apertura tra il tratto gastrointestinale e la regione spinale della parete del corpo. Staccare il tratto gastrointestinale, lavorando lentamente verso l'alto fino a raggiungere la regione più anteriore dove la regione cardiaca si connette (Figura 1B-E). FACOLTATIVO: Rimuovere il cuore primordiale e le gemme del fegato dalle regioni ventrali del tratto gastrointestinale, lasciando solo il tubo continuo dell'intestino. Le prime volte che viene eseguito questo protocollo potrebbe essere più facile lasciare il cuore e il fegato come punti di riferimento ventrale fino la morfologia del tratto gastrointestinale e il germoglio pancreatico dorsale sono più familiare (Figura 1C e D ).</li>
		<li>Trasferire il tratto gastrointestinale la gocciolina di PBS.</li>
		<li>Prendere il forcipe e pizzicare delicatamente il tessuto sotto il germoglio sporgente e l'intestino e sollevare leggermente il tessuto esterno fuori (Figura 1D-F). Nota: Il germoglio pancreatico dorsale si trova tra lo stomaco e l'intestino (Figura 1C-G). Il germoglio pancreatico sotto dovrebbe apparire come una struttura rotonda, tassellata (Figura 1G).</li>
		<li>Collocare la pinza dove il germoglio si connette per l'intestino e pizzico verso l'alto per allentare il germoglio (Figura 1G). Lavare una volta in una nuova bolla di PBS prima del trasferimento sul nascere nel primo pozzetto della piastra ben 12 in PBS freddo sul ghiaccio. Ripetere fino a quando tutti i germogli sono raccolti dagli embrioni e collocati nel primo pozzetto della piastra ben 12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettere il piatto ben 12 sotto il microscopio di dissezione luce. Contare il numero di gemme pancreatici con successo sezionati per poi calcolare il rapporto di divisione.<ol>
<li>Posto un filtrato 1.000 puntale µ l nella pipetta bocca con un tubo capillare associata. Fiamma sterilizzare il tubo capillare e creare una curva del tubo per la facilità d'uso. Utilizzare il capillare per trasferire i germogli per la seconda soluzione contenente dispase freddo per 2 min prima del trasferimento al terzo pozzo con il PBS pulito (Figura 1G). Nota: Durante il trasferimento germogli da dispase PBS, evitare di toccare il tessuto fino alla punta del capillare. Se il tessuto si incastra sulla punta del tubo, pipettare su e giù o agitare nella soluzione PBS pulita fino a quando allentato.</li>
		<li>Pipettare germogli su e giù e trasferire al quarto pozzo con PBS pulito. Infine, utilizzando il trasferimento capillare periferica germogli per la provetta da 1,5 mL con 0,05% tripsina. Collocare la provetta nel pre-riscaldato 37 oC shaker e agitare a 1.500 giri/min per 4 min.</li>
		<li>Vortex per circa 10 s, quindi, inserire immediatamente il tubo in una centrifuga e spin per 5 min a 200 g. Togliere tutto ma circa 50 µ l di soluzione con cautela per non disturbare le cellule centrifugate (Figura 1G).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. coltura dissociati progenitori per formare Pancreatoids
Nota: Il seguente deve essere eseguito in un ambiente sterile in un cappuccio di coltura del tessuto standard, utilizzando le procedure sterili standard.
<ol><li>Per ogni gemma raccolto, aggiungere 400 µ l organogenesi media16,17 (tabella 1) le cellule centrifugate. Vortice di impulso tre volte e piastra 100 µ l di un attacco basso 96 ben piatto, spaccare gustative in un rapporto di 1:4 (Figura 1G).</li>
	<li>Controllare al microscopio per visualizzare dissociato cellule galleggiano liberamente (Figura 1H). Posizionare la piastra di coltura in un incubatore a 37 oC con 5% CO2 su un agitatore meccanico a media velocità.</li>
	<li>Monitorare lo stato di pancreatoids al giorno. Sostituire con 100 µ l di media fresca ogni 3 giorni, attentamente pipettaggio media sotto controllo microscopico nella cappa di rimuovere lasciando pancreatoid nel pozzo. In alternativa, fresca 100 µ l di media può essere aggiunto a un nuovo pozzo e pancreatoid trasferiti utilizzando il tubo capillare di borosilicato collegato a bocca pipetta e 1000 µ l filtrata punta della pipetta.</li>
</ol>3. il trattamento Pancreatoids per l'Imaging immunofluorescente
<ol><li>Per elaborare pancreatoids per immagini immunofluorescenti, innanzitutto preparare 4% paraformaldeide/PBS, soluzione pH7.4 (PFA). Mettere 50 µ l di PFA in pozzi di un 96 piastra ben il 4%.<ol>
<li>Utilizzando i tubi capillari borosilicato e pipetta in bocca con la punta della pipetta filtrata 1.000 µ l, trasferimento pancreatoids da terreno di coltura tenendo il pozzo fresco con 4% mezzi come piccoli come possibile PFA. Impostare il rocker a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Trasferimento di pancreatoids da 4% roccia PFA in un pozzo con 100 µ l di PBS fresco, a temperatura ambiente per 5-10 min ripetere per un totale di tre lavaggi di PBS freschi. Nota: Il protocollo può essere sospesa qui, con pancreatoids memorizzati in 100 µ l di PBS a 4 oC fino ad una settimana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per l'imaging di wholemount (consigliato se gli anticorpi sono approccio alternativo adatto nella sezione 3.3. e microscopia in 3.4.), trasferimento da PBS in 50 µ l di siero di 5% asino in 1X PBS con 0,1% detergente non ionico (PBST) al blocco. Rock tutta la notte a 4 oC o in alternativa per 4 h a temperatura ambiente.<ol>
<li>Trasferimento pancreatoids a un nuovo pozzo che contiene gli anticorpi primari diluiti in 50 µ l di siero di 5% asino in 1 x PBST. In modo ottimale, roccia per 24 h a 4 oC (almeno 12 h ma fino a 36 h). Nota: Gli anticorpi elencati nella Tabella materiali contro Chitaga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) e Pdx1 (1: 100) sono adatti per la colorazione del wholemount; altri anticorpi possono richiedere ottimizzazione.</li>
		<li>Trasferimento pancreatoids ad un pozzo che contiene 100 µ l di PBST fresca per lavare e rock per 30 min a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio per un totale di tre lavaggi PBST freschi.</li>
		<li>Trasferimento pancreatoids a un nuovo pozzo contenente anticorpi secondari diluiti in 50 µ l di siero di 5% asino in 1 x PBST. Proteggere la piastra dalla luce e posto in 4 oC, a dondolo per in modo ottimale 24 h (almeno 12 h ma fino a 36 h). Nota: Tutti gli anticorpi secondari elencati nella Tabella materiali e DAPI controcolorazione nucleare sono adatti per la colorazione del wholemount.</li>
		<li>Trasferimento pancreatoids a un nuovo pozzo che contiene 100 µ l di 1x PBST e roccia a temperatura ambiente per 30 min. Ripetere per un totale di tre lavaggi in 1 x PBST. Nel terzo e ultimo lavaggio, aggiungere 300 nM DAPI.</li>
		<li>Infine, inserire in 100 µ l di PBS pulito e conservare a 4 oC al riparo dalla luce per fino ad una settimana prima dell'imaging mediante microscopia confocale, sebbene i migliori risultati provengono da formazione immagine immediatamente dopo la colorazione. Per impedire il movimento di pancreatoids durante la formazione immagine, ma evitare l'essiccazione, inserire ogni pancreatoid in una goccia di 20 µ l di PBS. Se pancreatoids non rimangono ancora, ridurre il volume di PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per sezioni congelate, trasferire pancreatoids da PBS in soluzione di saccarosio 30% durante la notte alle 4 oC.<ol>
<li>Aggiungi media incorporamento in una bolla sotto un microscopio di dissezione. Usando il forcipe sotto controllo microscopico, ammollo pancreatoids spingendo delicatamente attraverso i media che utilizza più volte per rimuovere saccarosio residua prima di trasferire a un blocco di tessuto con media incorporamento congelati.</li>
		<li>Posizionare il blocco di tessuto sul ghiaccio secco fino a quando congelati e sezione del criostato a 8 µm. Nota: Sezioni possono essere conservate a-80 oC o immunostained immediatamente.</li>
		<li>Consentire le sezioni da-80 oC a scongelare a temperatura ambiente per circa 5 min fino a secco. Disegnare una barriera idrofoba utilizzando la penna di pap idrofobo intorno il tessuto e il blocco usando 5% asino siero diluito in 1 x PBST per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere e sostituire immediatamente con gli anticorpi primari diluiti in 5% di siero di asino diluito in 1 x PBST pernottamento in 4 oC.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione primaria e lavare tessuti tre volte con 1 x PBST per 10 minuti ciascuno. In seguito, aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito in 5% di siero di asino diluito in 1 x PBST per 1 h a temperatura ambiente e proteggere i vetrini dalla luce.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione secondaria e lavare i vetrini tre volte in 1 x PBST per 10 minuti ciascuno. Il lavaggio finale, aggiungere 300 nM DAPI.</li>
		<li>Rimuovere i supporti e aggiungere mezzi di montaggio e un vetrino coprioggetti. Archivio scivola lontano dalla luce in 4 oC fino al momento della battuta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. isolamento di RNA da Pancreatoids per analisi della trascrizione
<ol><li>Raccogliere pancreatoids utilizzo capillare di borosilicato collegato a una pipetta di bocca con una punta di pipetta µ l 1.000 filtrata per la sterilità e posto in 500 µ l di soluzione di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium acido in una provetta da 1,5 mL. Conservare a-80 oC o procedere immediatamente all'isolamento del RNA.</li>
	<li>Per l'isolamento di RNA, scongelare i campioni su ghiaccio se necessario e aggiungere 100 µ l di cloroformio. Vortice bene e posto in 4 oC per 15 min. pre-raffreddare una centrifuga a 4 oC.<ol>
<li>Inserire tubi di centrifuga e spin per 20 min a 12.000 g a 4 oC.</li>
		<li>Estrarre con cautela le provette per non disturbare la separazione degli strati. Utilizzando una pipetta di 200 µ l, raccogliere la soluzione acquosa limpida e inserire in una nuova provetta da 1,5 mL, lasciando dietro di sé una piccola quantità di buffer dal livello di proteina bianco e rosa strato di DNA. Non toccare la punta della pipetta per nulla in questo processo e non toccare le pareti del tubo da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di isopropanolo 100% nella nuova provetta contenente lo strato acquoso e vortice. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 20 minuti, più a lungo sul ghiaccio, o per precipitazione massima di lasciare durante la notte-20 oC.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 g per 15 min a 4 oC a pellet il RNA. Rimuovere l'isopropanolo senza disturbare il pellet. Nota: Come pancreatoids sono piccole, è probabile che la pallina non sarà visibile.</li>
		<li>Freddo, aggiungere 75% etanolo e capovolgendo il tubo. Posto nella centrifuga e spin a 9.000 x g per 10 min a 4 oC. Rimuovi l'etanolo e spin per 2 min a 9.000 x g.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta 200 µ l per rimuovere qualsiasi residuo etanolo nel tubo, senza contattare il pellet risiede nella regione. Lasciare aperto il tappo sul tubo per 5-10 min a temperatura ambiente per garantire la evaporazione di etanolo residuo.</li>
		<li>Risospendere il pellet nel Vortex in 20 µ l di acqua pulita, privo di nucleasi. Opzionale: Calore il RNA a 65 oC per 3 min e immediatamente tornare al ghiaccio. RNA possa essere conservato a-80 oC o immediatamente utilizzato per trascrizione inversa e qPCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Akkerman, N., Defize, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dawn+of+the+organoid+era%3A+3D+tissue+and+organ+cultures+revolutionize+the+study+of+development%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration.</a> Bioessays. 39 (4), (2017).</li>
<li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li>
<li>Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001143(2011).</li>
<li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+kidney+organoids+by+differentiation+of+human+pluripotent+cells+to+ureteric+bud+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26444236">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23995685">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Loftus, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinar+cell+apoptosis+in+Serpini2-deficient+mice+models+pancreatic+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency.</a> PLoS Genetics. 1 (3), 38(2005).</li>
<li>Kleeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Chronic pancreatitis.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17060(2017).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+signals%2C+and+lineages+in+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, signals, and lineages in pancreas development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pancreas+organogenesis+from+dispersed+mouse+embryonic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), 51725(2014).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).</li>
<li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li>
<li>Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+pancreatoids+with+native+mesenchyme+develop+Insulin+producing+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10810(2017).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+multiple+steps+of+pancreatic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).</li>
<li>Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+Nkx6.1+and+Nkx6.2+possess+equivalent+activities+in+promoting+beta-cell+fate+specification+in+Pdx1%2B+pancreatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells.</a> Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+is+required+for+maintenance+of+the+pancreatic+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).</li>
<li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+transcriptional+regulator+Ptf1a+in+converting+intestinal+to+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors.</a> Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li>
<li>Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+binding+sites+for+Dolichos+biflorus+agglutinin+at+the+apical+aspect+of+collecting+duct+cells+in+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).</li>
<li>Reichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+genetic+manipulation+of+mouse+pancreatic+ductal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).</li>
<li>Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromogranins+A+and+B%3A+the+first+25+years+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives.</a> Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).</li>
<li>Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+alpha-cell+dysfunction+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes.</a> Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).</li>
<li>Del Prato, S., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-+and+alpha-cell+dysfunction+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hormone+and+Metabolic+Research%22%5BJournal%5D)">Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes.</a> Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).</li>
<li>Piciucchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocrine+pancreatic+insufficiency+in+diabetic+patients%3A+prevalence%2C+mechanisms%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment.</a> International Journal of Endocrinology. 2015, 595649(2015).</li>
<li>Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+of+the+Exocrine+Pancreas+in+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes.</a> Current Diabetes Reports. 15 (10), 79(2015).</li>
<li>Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La progressione dei modelli della coltura cellulare è fondamentale per correttamente modello sviluppo, produrre tipi cellulari clinicamente rilevanti, prova l'efficacia dei farmaci o trapianto anche ai pazienti. Tuttavia, artificialmente ricapitola lo sviluppo in un piatto è impegnativo come siamo ancora lontani dal comprendere i meccanismi della organogenesi e fisiologia in vivo. Così le cellule in vitro sono inefficacemente generato, non completamente funzionale, incapace di essere mantenuti per lungh...

Delineare i meccanismi dello sviluppo normale e la fisiologia è fondamentale per capire l'eziologia di malattia e coltivare in ultima analisi, metodi di trattamento. Mentre la coltura e la differenziazione delle cellule staminali permette analisi di alto-rendimento e veloce di sviluppo, è limitata dal corpo esistente di conoscenza dei meccanismi che regolano il destino delle cellule e artificialmente ricapitola lo sviluppo in un relativamente omogenea, bidimensionale stato1,2. Non solo è in vivo sviluppo influenzato dai fattori estrinseci, con diversi tipi di cellule nella nicchia e milieu fornendo segnali paracrini e supporto organizzativo per guidare l'organogenesi, ma la funzione di queste cellule si basa anche sulla loro dintorni per orientamento3,4,5. Dato l'importanza di queste indicazioni esterne, le limitazioni dei protocolli di differenziazione e la natura laboriosa di in vivo modelli murini, nuovi sistemi sono necessari studiare sperimentalmente fisiologia e processi di base inerente allo sviluppo.
L'emersione dei protocolli per generare organoids tridimensionale, complesso fornisce un sistema conveniente e congruo per studiare l'organogenesi, la fisiologia, l'efficacia dei farmaci e anche patogenesi. Che istituisce organoids murino per diversi sistemi come lo stomaco6 e intestino7 hanno ampliato la nostra comprensione dell'organogenesi, fornendo uno strumento per studiare la complessità inerente allo sviluppo con meno restrizioni rispetto a vivo e modelli in vitro . A causa di questi avanzamenti nella murino organoid formazione e l'avvento di pluripotenti umane derivano cellule, intestinale umano8, retinica9, renale10,11, e cerebrale12 organoids sono state prodotte e questo repertorio è limitato solo dalla conoscenza esistente per quanto riguarda i meccanismi di sviluppo.
Di particolare interesse è la generazione dei organoids del pancreas, come una miriade di malattie affligge tipi differenti delle cellule del pancreas, compreso le cellule acinose e condotti in insufficienza pancreatica exocrine13, cellule acinose in pancreatite14, e cellule beta nel diabete15. Acquisire conoscenze relative allo sviluppo di questi tipi differenti delle cellule potrebbe aiutare a comprendere la loro patologia e può, inoltre, agire come una piattaforma per lo screening di stupefacenti personalizzati o trapianto. In precedenza, Greggio et al ha sviluppato un metodo per creare organoids pancreatico murino che ricapitolare in vivo morfogenesi e sviluppare strutture organizzate, tridimensionale, complesse composte da tutti i principali delle cellule epiteliali del pancreas tipi di16,17. Si tratta di un importante passo avanti nel campo del pancreas, soprattutto come fare le cellule in vitro possibile attivare indagini biologiche dello sviluppo della cellula beta. Tuttavia, una scarsità di cellule endocrine formata in questo protocollo, a meno che il organoids sono stati trapiantati in tessuto, dove la nicchia potrebbe interagire e fornire spunti didattici17. Il mesenchima costituisce la più grande parte della nicchia, pesantemente avvolgente dell'epitelio in via di sviluppo dalle fasi iniziali dell'organogenesi a fasi successive, tra cui endocrino delaminazione e differenziazione3,4, 18. L'interazione del mesenchyme con il pancreas in via di sviluppo è l'ennesimo esempio di segnalazione estrinseca e l'importanza di mantenere in vivo cellulare complessità per studiare l'organogenesi.
Qui, descriviamo come generare tridimensionale organoids pancreatico, chiamato pancreatoids, da progenitori pancreatico murino dissociate e 10.5. Questi pancreatoids conservare mesenchima nativo, auto-assemblarsi in condizioni di libero di fluttuare e generare tutti i tipi principali delle cellule del pancreas, compreso un robusto numero di cellule endocrine beta19. Questo approccio è più adatto per l'analisi dello sviluppo endocrino, come protocolli precedenti mancano robusta differenziazione endocrina. Tuttavia, utilizzando il protocollo per organoids pancreatico come descritto da Greggio et al è più adatto per analisi di ramificazione epiteliale del pancreas e morfogenesi, come ramificazione è più limitato a pancreatoids.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tubi Aspiratore per Pipette Microcapillari Calibrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure Acqua priva di nucleasi</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari in borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>GB1007515</td><td>O.D. 1 mm, D.I. 0,75 mm, lunghezza</td></tr> <tr><td>1,5 cmCaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Greiner per micropiastre a 96 pozzetti repellente per cellule</td><td>Bio-One</td><td>650970</td><td>Centrifuga con fondo a U</td></tr><tr><td>5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo Cromogranina-A</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio compatto e modulare M60</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Contatore di cellule automatizzato</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Countess Contatore di cellule Vetrini</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidina-2'-fenilindo-dicloridrato)</td><td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>DBA</td> in polvere <td>Vector Lab</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, Gibco in polvere</td><td></td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11251-10</td><td>0,05 x 0,02 mm; Titanio; Consiglio per la biologia</td></tr><tr><td>EGF (fattore di crescita epidermico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 200 Proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Incubatori a CO2 a ciclo Forma Steri ThermoFisher</td><td></td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 Anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-271408</td><td>Isopropanolo policlonale di topo</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia isoflurane, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo insulina</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>cavia policlonale</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl KaryoMax</td><td></td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Siero di ricambio</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE Confocale spettrale ad alta risoluzione</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>Mouse C-peptide ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>Mouse ultrasensibile Lame</td> per microtomo ELISA <td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pdx1 anticorpo</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>Mouse monoclonale MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Stampi per inclusione monouso</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Myristate 13- Acetato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Provette per microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>capacità di 1,5 ml</td></tr><tr><td>Proteina umana ricombinante FGF-10</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>FGF-acido umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>Proteina R-spondina I umana ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tessuto Tek O.C.T. Composto</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), senza fenolo rosso</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td>Per vetrini per conteggio cellulare</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05% )</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Rosso fenolo</td></tr><tr><td>Attacco ultrabasso Piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Piastra sferoidale a bassissimo attacco</td><td>Corning</td><td>4520</td> a 96 pozzetti Corning 4520 <td></td></tr><tr><td>Anticorpo Vimentina</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>Pollo policlonale IgY</td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dicloridrato</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>Conosciuto anche come inibitore ROCK</td></tr><tr><td>Zeiss 710 Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo pancreatoids dal mouse progenitori pancreatico in vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Il pancreas è che un organo complesso composto di molti diversi tipi di cellule che lavorano insieme per regolare la digestione e l'omeostasi del glucosio di anima. Questi tipi di cellule includono enzima-secrezione delle cellule acinose, un sistema duttale arborized responsabile del trasporto degli enzimi per le cellule endocrine dell'intestino e producono ormoni.
Beta-cellule endocrine sono il tipo di suola delle cellule nel corpo che producono l'insulina per abbassare i livelli di glucosio nel sangue. Diabete, una malattia caratterizzata da una perdita o la disfunzione delle cellule beta, sta raggiungendo proporzioni epidemiche. Quindi, è essenziale stabilire protocolli per studiare lo sviluppo della beta-cellula che può essere utilizzato ai fini dello screening per derivare la droga e le terapie basate su cellule. Mentre l'indagine sperimentale del mouse sviluppo è essenziale, in vivo gli studi sono laboriosa e che richiede tempo. Cellule coltivate forniscono una piattaforma più conveniente per lo screening; Tuttavia, essi sono in grado di mantenere la diversità cellulare, organizzazione architettonica e interazioni cellulari trovati in vivo. Quindi, è essenziale per sviluppare nuovi strumenti per studiare la fisiologia e l'organogenesi pancreatica.
Cellule epiteliali pancreatiche si sviluppano in stretta associazione con mesenchima fin dall'inizio dell'organogenesi come cellule organizzano e si differenziano nell'organo adulto complesso, fisiologicamente competente. Il mesenchima pancreatico fornisce segnali importanti per lo sviluppo del sistema endocrino, molti dei quali non sono buono capiti ancora, così difficile ricapitolare durante la coltura in vitro . Qui, descriviamo un protocollo alla cultura del mouse complesso tridimensionale, cellulare organoids che conservano mesenchima, chiamato pancreatoids. Il germoglio pancreatico murino e 10.5 è sezionato, dissociato e coltivato in un ambiente senza impalcatura. Questi galleggianti cellule assemblarsi con mesenchima avvolgente il pancreatoid in via di sviluppo e un robusto numero delle beta-cellule endocrine, sviluppando insieme l'acinose e cellule del condotto. Questo sistema può essere utilizzato per studiare le interazioni cellula-cellula cellula determinazione di destino, organizzazione strutturale e morfogenesi, durante l'organogenesi, o per la droga, piccola molecola o screening genetico.

La dissezione attenta degli embrioni del mouse alle e 10.5 dal corno uterino dovrebbe produrre embrioni intatti in PBS per ulteriore dissezione (Figura 1A). Il tratto gastrointestinale può essere rimosso in modo efficiente dall'embrione (Figura 1B), permettendo di discernimento del germoglio pancreatico dorsale alla giunzione dell'intestino e dello stomaco (Figura 1<...

Qui, presentiamo un protocollo per generare insulina esprimendo 3D pancreatoids murino da progenitori pancreatici e 10.5 digalleggiante dissociato e mesenchima associato.

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo pancreatico utilizzando questi pancreatoidi per capire come si formano le cellule endocrine in un ambiente complesso dal punto di vista architettonico e cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i pancreatoidi sviluppano cellule endocrine a causa dell'inclusione del mesenchima circostante. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il pancreas è molto piccolo a e10.5.E la dissezione è fondamentale per la formazione di pancreatoidi per ottenere abbastanza tessuto non contaminante. Per preparare la dissezione, riempire un secchiello del ghiaccio e posizionare un contenitore di soluzione salina tamponata con fosfato nel ghiaccio. Pulisci due pinze a punta fine e le forbici da dissezione con etanolo al 70%.Vicino all'area di dissezione, posizionare un contenitore con almeno tre tubi capillari in borosilicato, un accendino e puntali per pipette filtrati da 1000 microlitri. Successivamente, pipettare almeno un millilitro di 1,25 milligrammi per millilitro di dispasi fredda diluita in acqua sterilizzata nel secondo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti su ghiaccio. Pipet PBS nel primo, terzo e quarto pozzetto della piastra a 12 pozzetti.Inoltre, pipettare un millilitro di tripsina allo 0,05% in un tubo da 1,5 millilitri su ghiaccio. Dopo l'eutanasia e10.5 timed topi gravidi in conformità con le linee guida IACUC, spruzzare l'addome con etanolo al 70% per pulire la regione. Quindi, praticare un'incisione a forma di V nell'area genitale del topo usando forbici e pinze e continuare l'incisione fino al diaframma.Asportare con cura l'utero praticando un'incisione nella parte laterale più alta dell'utero, tirando l'organo verso l'alto lontano dal topo e seguendo questa incisione fino alla regione genitale prima di ripetere sul lato opposto. Posizionare l'utero asportato in una capsula di Petri di 10 centimetri con il PBS freddo. Sotto un microscopio a dissezione ottica, posizionare la capsula di Petri e aprire con cautela il tessuto uterino posizionando due pinze tra ciascun embrione e staccando il tessuto dal sacco vitellino.Trasferire gli embrioni afferrando delicatamente il sacco vitellino con una pinza e mettendoli in una capsula di Petri di 10 centimetri con PBS fresco e freddo. Mettere la capsula di Petri sul ghiaccio. Quindi, posiziona più gocce di PBS sul coperchio della capsula di Petri da 10 centimetri.Utilizzare queste goccioline per trasferire l'embrione durante la dissezione, poiché i tessuti extraembrionali vengono rimossi per garantire la visibilità. Trasferisci un embrione in una goccia di PBS e rimuovilo delicatamente dal sacco vitellino usando una pinza mentre gli embrioni rimanenti rimangono in PBS sul ghiaccio. Rimuovere la testa prima di spostare l'embrione in una nuova goccia di PBS usando una pinza per raccogliere leggermente l'embrione senza danneggiare il tessuto.In una nuova goccia PBS, rimuovi i quattro auricolari degli arti usando una pinza. Posizionare la pinza nell'apertura in cui era presente la gemma dell'arto e strappare delicatamente anteriormente solo il tessuto più esterno. Ruota l'embrione e ripeti in direzione posteriore, fermandoti sulla gemma dell'arto posteriore.A questo punto, il tratto gastrointestinale dovrebbe essere visibile. La regione posteriore del tratto gastrointestinale ha una leggera curvatura; Inserire una pinza dietro questa curva nell'apertura tra il tratto gastrointestinale e la regione spinale sulla parete del corpo. Staccare il tratto gastrointestinale, lavorando lentamente verso l'alto fino a raggiungere la regione più anteriore, dove la regione cardiaca si collega.Nelle fasi successive, è fondamentale evitare il tessuto circostante nella coltura, in modo da non contaminare i pancreatoidi con tessuto non pancreatico. Tuttavia, se non si afferra l'intera gemma pancreatica, il numero e le dimensioni dei pancreatoidi saranno compromessi. Trasferire il tratto gastrointestinale nella gocciolina di PBS fresca.Continuare a rimuovere il tessuto esterno che circonda il tratto gastrointestinale. Una volta rimosso questo tessuto esterno, la gemma pancreatica può essere visualizzata posteriormente alle gemme del fegato, tra lo stomaco e l'intestino. Quindi, prendi una pinza e pizzica delicatamente il tessuto sotto la gemma sporgente nell'intestino e solleva leggermente la gemma pancreatica.Dopo aver pizzicato la regione in cui la gemma si collega all'intestino, la gemma viene separata. Lavare una volta in una nuova bolla PBS prima di trasferire il bocciolo nel primo pozzetto della piastra a 12 pozzetti e raffreddare il PBS con ghiaccio. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le gemme sono state raccolte dagli embrioni e poste nel primo pozzetto della piastra a 12 pozzetti.Quindi, posizionare il piatto a 12 pozzetti sotto il microscopio a dissezione ottica. Conta il numero di gemme pancreatiche sezionate con successo per calcolare successivamente il rapporto di divisione. Inserire un puntale di pipetta filtrato da 1000 microlitri nella pipetta con il tubo capillare collegato.Sterilizzare a fiamma il tubo capillare e creare una curva nel tubo per una maggiore facilità d'uso. Utilizzare il capillare per trasferire le gemme nel secondo pozzetto contenente la soluzione di dispasi fredda per due minuti prima di trasferirle nel terzo pozzetto contenente PBS pulito. Pipet i boccioli su e giù e trasferiscili nel quarto pozzetto contenente PBS pulito.Infine, utilizzando il dispositivo capillare, trasferire le cime nel tubo da 1,5 millilitri con lo 0,05% di tripsina. Posizionare la provetta nell'agitatore preriscaldato a 37 gradi Celsius e agitare a 1.500 giri/min per quattro o cinque minuti. Dopo aver agitato per circa 10 secondi, posizionare immediatamente la provetta nella centrifuga e centrifugare per cinque minuti a 200 g.Rimuovere con cautela tutti i microlitri di soluzione tranne circa 50 per non disturbare le cellule centrifugate. Per ogni gemma raccolta a 400 microlitri di terreno di organogenesi nelle cellule centrifugate, pulsare il vortice tre volte e impiattare 100 microlitri per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a basso attaccamento, dividendo le gemme in un rapporto da uno a quattro. Controlla al microscopio per visualizzare le cellule dissociate che fluttuano liberamente.Quindi posizionare il piatto di coltura in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica su un bilanciere a velocità media. Un'attenta dissezione di embrioni di topo a e10.5 dal corno uterino dovrebbe produrre embrioni non danneggiati in PBS per un'ulteriore dissezione. Il tratto gastrointestinale può essere rimosso in modo efficiente dall'embrione, consentendo il discernimento della gemma pancreatica dorsale alla giunzione tra intestino e stomaco.Nei terreni di organogenesi, queste cellule libere da scaffold fluttuanti si autoassemblano e si organizzano in pancreatoidi tridimensionali che crescono e persistono per almeno 10 giorni in coltura. L'applicazione di un attivatore della proteina chinasi C ad alte concentrazioni altera la morfologia dei pancreatoidi in via di sviluppo, portando a cellule epiteliali scarsamente associate e ad un aumento della ramificazione. Inoltre, l'uso di animali transgenici consente la visualizzazione delle cellule mentre si differenziano in tempo reale.Per valutare l'associazione del tessuto mesenchima pancreatico con le cellule epiteliali pancreatiche, è possibile eseguire l'immunocolorazione per i marcatori di ciascun tessuto. L'immunocolorazione di un marcatore del dotto con un marcatore endocrino e nuclei, rivela la formazione di multi-lineage nei pancreatoidi. Un marcatore mesenchimico co-colorato con un marcatore progenitore pancreatico mostra che il mesenchima avvolge il pancreatoide.Lo sviluppo delle cellule beta è rivelato dalla colorazione del marcatore epiteliale e del marcatore delle cellule beta. Utilizzando l'analisi PCR quantitativa, è possibile valutare i trascritti dei progenitori e delle cellule differenzianti, come i geni progenitori e i marcatori differenziati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora, compreso il tempo di preparazione, se eseguita correttamente.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la dissezione per ottenere tessuto pancreatico da 10,5 topi per generare pancreatoidi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere con cura il tratto gastrointestinale dagli embrioni, altrimenti sarà molto difficile trovare la gemma pancreatica. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come GSIS ed ELISA per rispondere a ulteriori domande, come la quantità di insulina o peptide C prodotta dopo la stimolazione del glucosio.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ci ha aperto la strada per esplorare le conseguenze morfologiche dell'attivazione della PKC utilizzando piccole molecole. Un modo per implementare ulteriormente questo sistema per studiare l'effetto del fattore di trascrizione dell'espressione e persino per eseguire importanti esperimenti di epistasi.

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un tridimensionale test clonogenica che permette pancreatico-come progenitori di differenziarsi in insulino-colonie che esprimono è descritto. Questo metodo si avvale di semi-solidi supporti contenenti fattori di metilcellulosa, Matrigel e di crescita, in cui progenitori singolo proliferare e...

Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

Qui, si descrive un metodo per l'isolamento, la cultura e manipolazione del pancreas embrionali di topo. Ciò rappresenta un...

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

Il metodo di coltura tridimensionale descritto in questo protocollo ricapitola sviluppo pancreas dispersi da progenitori topo pancreas embrionali, compresa la loro notevole espansione, differenziazione e morfogenesi in un organo ramificato. Questo metodo è suscettibile di immagini, interferenze funzionali e manipolazione della nicchia.

In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

Nei saggi di colonie in vitro per rilevare auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule progenitrici isolate dal pancreas di topo adulti sono messo a punto. In questi saggi, progenitori pancreatici danno origine a colonie di cellule nello spazio 3-dimensionale in terreno semisolido contenente metilcellulosa. I protocolli per la gestione di singole cellule e caratterizzazione delle singole colonie sono descritti.

In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas

Questo protocollo dimostra l'isolamento delle isole murine e la semina su un impalcatura decellulare. Isole supportate da ponteggi sono state trapiantate nel pad di grasso epididimo di topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ). Isole sopravvissute al sito di trapianto e invertite la condizione iperglicemica.

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in proteina di pancreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas basano sulla crescita di monostrato di tipo non-Colonia di dissociato singole cellule. Questo metodo è adatto per la produzione di cellule derivate da hPSC omogenee, manipolazione genetica e di screening.

Efficiente generazione di Pancreas/duodeno Homeobox Protein 1+ posteriore del Foregut/pancreatico progenitori da hPSCs nelle culture di adesione

Il presente protocollo descrive un metodo potenziato per aumentare la co-espressione dei fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in monostrati planari. Ciò si ottiene reintegrando la matrice fresca, manipolando la densità cellulare e dissociando le cellule endodermiche.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in precursori di cellule beta pancreatiche in un sistema di coltura 2D

La differenziazione delle cellule staminali in cellule insulari fornisce una soluzione alternativa al trattamento convenzionale del diabete e alla modellizzazione della malattia. Descriviamo un protocollo dettagliato di coltura di cellule staminali che combina un kit di differenziazione commerciale con un metodo precedentemente convalidato per aiutare a produrre isole derivate da cellule staminali secernenti insulina in un piatto.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

Questo articolo presenta un protocollo per la differenziazione diretta e l'analisi funzionale di cellule simili a cellule β. Descriviamo le condizioni e i passaggi di coltura ottimali per le cellule staminali pluripotenti umane prima di generare cellule pancreatiche produttrici di insulina. La differenziazione a sei stadi progredisce dalla formazione definitiva dell'endoderma alle cellule funzionali simili a cellule β che secernono insulina in risposta al glucosio.

Protocollo ottimizzato per la generazione di cellule pancreatiche funzionali secernenti insulina da cellule staminali pluripotenti umane

Forniamo un protocollo minimamente invasivo per il trapianto intramuscolare di isolotti di cellule staminali pancreatiche derivate da cellule staminali umane in topi immunodeficienti per l'impianto in vivo e l'analisi a valle.

Trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane nei topi

Scopri come generare pancreatoidi tridimensionali esprimenti insulina da progenitori pancreatici di topo e10.5. Questo metodo consente di studiare la formazione delle cellule endocrine in un ambiente complesso con mesenchima.

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

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