Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo pancreatico utilizzando questi pancreatoidi per capire come si formano le cellule endocrine in un ambiente complesso dal punto di vista architettonico e cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i pancreatoidi sviluppano cellule endocrine a causa dell'inclusione del mesenchima circostante. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il pancreas è molto piccolo a e10.5.

E la dissezione è fondamentale per la formazione di pancreatoidi per ottenere abbastanza tessuto non contaminante. Per preparare la dissezione, riempire un secchiello del ghiaccio e posizionare un contenitore di soluzione salina tamponata con fosfato nel ghiaccio. Pulisci due pinze a punta fine e le forbici da dissezione con etanolo al 70%.

Vicino all'area di dissezione, posizionare un contenitore con almeno tre tubi capillari in borosilicato, un accendino e puntali per pipette filtrati da 1000 microlitri. Successivamente, pipettare almeno un millilitro di 1,25 milligrammi per millilitro di dispasi fredda diluita in acqua sterilizzata nel secondo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti su ghiaccio. Pipet PBS nel primo, terzo e quarto pozzetto della piastra a 12 pozzetti.

Inoltre, pipettare un millilitro di tripsina allo 0,05% in un tubo da 1,5 millilitri su ghiaccio. Dopo l'eutanasia e10.5 timed topi gravidi in conformità con le linee guida IACUC, spruzzare l'addome con etanolo al 70% per pulire la regione. Quindi, praticare un'incisione a forma di V nell'area genitale del topo usando forbici e pinze e continuare l'incisione fino al diaframma.

Asportare con cura l'utero praticando un'incisione nella parte laterale più alta dell'utero, tirando l'organo verso l'alto lontano dal topo e seguendo questa incisione fino alla regione genitale prima di ripetere sul lato opposto. Posizionare l'utero asportato in una capsula di Petri di 10 centimetri con il PBS freddo. Sotto un microscopio a dissezione ottica, posizionare la capsula di Petri e aprire con cautela il tessuto uterino posizionando due pinze tra ciascun embrione e staccando il tessuto dal sacco vitellino.

Trasferire gli embrioni afferrando delicatamente il sacco vitellino con una pinza e mettendoli in una capsula di Petri di 10 centimetri con PBS fresco e freddo. Mettere la capsula di Petri sul ghiaccio. Quindi, posiziona più gocce di PBS sul coperchio della capsula di Petri da 10 centimetri.

Utilizzare queste goccioline per trasferire l'embrione durante la dissezione, poiché i tessuti extraembrionali vengono rimossi per garantire la visibilità. Trasferisci un embrione in una goccia di PBS e rimuovilo delicatamente dal sacco vitellino usando una pinza mentre gli embrioni rimanenti rimangono in PBS sul ghiaccio. Rimuovere la testa prima di spostare l'embrione in una nuova goccia di PBS usando una pinza per raccogliere leggermente l'embrione senza danneggiare il tessuto.

In una nuova goccia PBS, rimuovi i quattro auricolari degli arti usando una pinza. Posizionare la pinza nell'apertura in cui era presente la gemma dell'arto e strappare delicatamente anteriormente solo il tessuto più esterno. Ruota l'embrione e ripeti in direzione posteriore, fermandoti sulla gemma dell'arto posteriore.

A questo punto, il tratto gastrointestinale dovrebbe essere visibile. La regione posteriore del tratto gastrointestinale ha una leggera curvatura; Inserire una pinza dietro questa curva nell'apertura tra il tratto gastrointestinale e la regione spinale sulla parete del corpo. Staccare il tratto gastrointestinale, lavorando lentamente verso l'alto fino a raggiungere la regione più anteriore, dove la regione cardiaca si collega.

Nelle fasi successive, è fondamentale evitare il tessuto circostante nella coltura, in modo da non contaminare i pancreatoidi con tessuto non pancreatico. Tuttavia, se non si afferra l'intera gemma pancreatica, il numero e le dimensioni dei pancreatoidi saranno compromessi. Trasferire il tratto gastrointestinale nella gocciolina di PBS fresca.

Continuare a rimuovere il tessuto esterno che circonda il tratto gastrointestinale. Una volta rimosso questo tessuto esterno, la gemma pancreatica può essere visualizzata posteriormente alle gemme del fegato, tra lo stomaco e l'intestino. Quindi, prendi una pinza e pizzica delicatamente il tessuto sotto la gemma sporgente nell'intestino e solleva leggermente la gemma pancreatica.

Dopo aver pizzicato la regione in cui la gemma si collega all'intestino, la gemma viene separata. Lavare una volta in una nuova bolla PBS prima di trasferire il bocciolo nel primo pozzetto della piastra a 12 pozzetti e raffreddare il PBS con ghiaccio. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le gemme sono state raccolte dagli embrioni e poste nel primo pozzetto della piastra a 12 pozzetti.

Quindi, posizionare il piatto a 12 pozzetti sotto il microscopio a dissezione ottica. Conta il numero di gemme pancreatiche sezionate con successo per calcolare successivamente il rapporto di divisione. Inserire un puntale di pipetta filtrato da 1000 microlitri nella pipetta con il tubo capillare collegato.

Sterilizzare a fiamma il tubo capillare e creare una curva nel tubo per una maggiore facilità d'uso. Utilizzare il capillare per trasferire le gemme nel secondo pozzetto contenente la soluzione di dispasi fredda per due minuti prima di trasferirle nel terzo pozzetto contenente PBS pulito. Pipet i boccioli su e giù e trasferiscili nel quarto pozzetto contenente PBS pulito.

Infine, utilizzando il dispositivo capillare, trasferire le cime nel tubo da 1,5 millilitri con lo 0,05% di tripsina. Posizionare la provetta nell'agitatore preriscaldato a 37 gradi Celsius e agitare a 1.500 giri/min per quattro o cinque minuti. Dopo aver agitato per circa 10 secondi, posizionare immediatamente la provetta nella centrifuga e centrifugare per cinque minuti a 200 g.

Rimuovere con cautela tutti i microlitri di soluzione tranne circa 50 per non disturbare le cellule centrifugate. Per ogni gemma raccolta a 400 microlitri di terreno di organogenesi nelle cellule centrifugate, pulsare il vortice tre volte e impiattare 100 microlitri per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a basso attaccamento, dividendo le gemme in un rapporto da uno a quattro. Controlla al microscopio per visualizzare le cellule dissociate che fluttuano liberamente.

Quindi posizionare il piatto di coltura in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica su un bilanciere a velocità media. Un'attenta dissezione di embrioni di topo a e10.5 dal corno uterino dovrebbe produrre embrioni non danneggiati in PBS per un'ulteriore dissezione. Il tratto gastrointestinale può essere rimosso in modo efficiente dall'embrione, consentendo il discernimento della gemma pancreatica dorsale alla giunzione tra intestino e stomaco.

Nei terreni di organogenesi, queste cellule libere da scaffold fluttuanti si autoassemblano e si organizzano in pancreatoidi tridimensionali che crescono e persistono per almeno 10 giorni in coltura. L'applicazione di un attivatore della proteina chinasi C ad alte concentrazioni altera la morfologia dei pancreatoidi in via di sviluppo, portando a cellule epiteliali scarsamente associate e ad un aumento della ramificazione. Inoltre, l'uso di animali transgenici consente la visualizzazione delle cellule mentre si differenziano in tempo reale.

Per valutare l'associazione del tessuto mesenchima pancreatico con le cellule epiteliali pancreatiche, è possibile eseguire l'immunocolorazione per i marcatori di ciascun tessuto. L'immunocolorazione di un marcatore del dotto con un marcatore endocrino e nuclei, rivela la formazione di multi-lineage nei pancreatoidi. Un marcatore mesenchimico co-colorato con un marcatore progenitore pancreatico mostra che il mesenchima avvolge il pancreatoide.

Lo sviluppo delle cellule beta è rivelato dalla colorazione del marcatore epiteliale e del marcatore delle cellule beta. Utilizzando l'analisi PCR quantitativa, è possibile valutare i trascritti dei progenitori e delle cellule differenzianti, come i geni progenitori e i marcatori differenziati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora, compreso il tempo di preparazione, se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la dissezione per ottenere tessuto pancreatico da 10,5 topi per generare pancreatoidi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere con cura il tratto gastrointestinale dagli embrioni, altrimenti sarà molto difficile trovare la gemma pancreatica. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come GSIS ed ELISA per rispondere a ulteriori domande, come la quantità di insulina o peptide C prodotta dopo la stimolazione del glucosio.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ci ha aperto la strada per esplorare le conseguenze morfologiche dell'attivazione della PKC utilizzando piccole molecole. Un modo per implementare ulteriormente questo sistema per studiare l'effetto del fattore di trascrizione dell'espressione e persino per eseguire importanti esperimenti di epistasi.