Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

L'obiettivo generale di questa tecnica è studiare l'impegno degli mRNA individuali con i polisomi durante la traduzione. La profilazione dei polisomi è una potente tecnologia per studiare l'interazione dell'mRNA con ribosomi e polisomi. La tecnica è importante per gli studi sulla regolazione della sintesi proteica, l'attivazione della traduzione e la repressione.

Qui il nostro team presenta le tecniche per il frazionamento polisomiale e l'analisi delle frazioni sull'esempio di tre organismi. Parassita Leishmania major, cellule umane coltivate e un tessuto animale. Questo approccio consiste in quattro fasi principali: preparazione del lisato, preparazione del gradiente di saccarosio e ultracentrifugazione, frazionamento dei polisomi e raccolta dei campioni.

Analisi delle frazioni. Le cellule provenienti da diverse fonti vengono raccolte, lavate e lisate in tampone di lisi mediante passaggio attraverso un ago o un omogeneizzatore Dounce. La centrifugazione viene utilizzata per rimuovere i detriti cellulari che chiariscono il lisato.

Un gradiente continuo di saccarosio è formato dalla miscelazione di soluzioni di saccarosio al 10% e al 50% in un creatore di gradienti. Il lisato viene caricato nella parte superiore del gradiente. L'ultracentrifugazione separa gli mrNA associati a un diverso numero di ribosomi.

Che viene monitorato da un rivelatore UV durante il frazionamento, formando spettri assorbenti distinti. Preparazione del lisato. Ci sono alcune differenze nella preparazione del lisato a seconda della fonte.

Dopo la preparazione del lisato, le procedure sono identiche indipendentemente dall'origine del campione. Leishmania major Preparazione di lisato citoplasmatico. Posizionare le cellule di Leishmania major in 30 millilitri di terreno alla densità di 100.000 cellule per millilitro.

Questa fase viene eseguita in una cabina di biosicurezza. Posizionare il pallone con la coltura di Leishmania nell'incubatore e far crescere le cellule a 27 gradi Celsius, fino alla fase logaritmica. Di solito ci vogliono circa due giorni per crescere.

Le cellule principali della Leishmania sono facilmente visibili al microscopio. Aggiungere cicloesimide alla coltura di Leishmania coltivata a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro, per arrestare i ribosomi sugli mRNA tradotti. Rimettere le cellule nell'incubatore per dieci minuti a 27 gradi Celsius.

Al termine del trattamento con cicloesimide, trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri e centrifugarla di 1.800 g per 8 minuti. Scartare il surnatante. Lavare le celle con 30 millilitri di pbs e centrifugare.

Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di pbs. Prelevare un'aliquota di cellule e mescolarla con la soluzione di formaldeide. Quindi contare le cellule con l'emocitometro.

Trasferire il numero desiderato di cellule nella provetta per microfuge. Centrifugare le celle a 1.800 g per 8 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi scartare il surnatante.

Risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di lisi contenente inibitori della proteasi e RNAsina. Passare le cellule attraverso un ago calibro 23 tre volte. Dopo essere passato attraverso l'ago, il lisato diventa trasparente.

Centrifugare a 11, 200 g per dieci minuti a quattro gradi Celsius per chiarificare il lisato. Trasferire il lisato chiarificato in una provetta per microfuge fresca e tenerlo in ghiaccio fino all'ultracentrifugazione con gradiente di saccarosio. Preparazione citoplasmatica di lisato da cellule umane in coltura.

Far crescere le cellule HeLa in una grande piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius, con il 5% di CO2. Aggiungere cicloesimide alle cellule HeLa coltivate alla concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro per arrestare i ribosomi sugli mRNA tradotti. Incubare le cellule per dieci minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2.

Aspirare il terreno e lavare il piatto con ghiaccio due volte con pbs freddo. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi alla piastra e raschiare le cellule. Trasferire le cellule lisate nella provetta per microfuge.

Passare le cellule attraverso un ago calibro 23 tre volte. Centrifugare a 11, 200 g per otto minuti per chiarificare il lisato. Dopo la centrifugazione, spostare le provette sul ghiaccio e trasferire il surnatante nella nuova provetta.

Prendi un'aliquota, diluiscila e misura l'assorbanza a 260 nanometri usando una nano goccia. Se sono presenti più campioni, regolare i lisati alla stessa densità ottica e mantenere i campioni in ghiaccio fino all'ultracentrifugazione con gradiente di saccarosio. Preparazione citoplasmatica del lisato dal testicolo del topo.

Seziona il testicolo del topo. Praticare una piccola incisione nella tunica albugenia e raccogliere i tubuli seminifori del testicolo e trasferirli nel tubo conico contenente cinque millilitri di pbs. Mescolare energicamente il tessuto.

E lasciare che il fazzoletto si depositi sul ghiaccio per cinque minuti. Rimuovere il tampone e lavarlo con pbs altre due volte. Trasferire i tubuli seminiferi in un tubo da due millilitri e centrifugarli a 500 g per un minuto.

Rimuovere il surnatante. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi ai tubuli e utilizzare una pipetta per disgregare il tessuto. Trasferire la sospensione in un omogeneizzatore dounce di piccolo volume.

Rompi il tessuto con sette-otto colpi di pestello di vetro. Trasferire il lisato in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare il campione a 12.000 g a quattro gradi Celsius per otto minuti per eliminare il lisato.

Trasferisci il surnatante in un nuovo tubo e tienilo in ghiaccio. Quindi, procedere con la preparazione del gradiente di saccarosio. Preparazione del gradiente di saccarosio.

Posizionare una provetta per ultracentrifuga nel microblocco e tracciare la linea lungo il livello superiore del blocco. Quindi trasferire la provetta in una griglia stabile. Prendi una siringa da dieci millilitri, con il dispositivo di stratificazione attaccato e riempi la siringa con una soluzione di saccarosio al 10%.

Rilasciarlo delicatamente sul fondo della provetta dell'ultracentrifuga fino a quando la soluzione di saccarosio non raggiunge il segno. Riempire un'altra siringa con una soluzione di saccarosio al 50% e inserire con cautela il dispositivo di stratificazione attraverso lo strato di saccarosio al 10% sul fondo del tubo. Rilasciare delicatamente la soluzione di saccarosio, partendo dal basso fino a raggiungere il segno sul tubo.

Quindi sigillare il tubo con il tappo in dotazione. Per preparare la sfumatura di saccarosio, accendere il dispositivo per la creazione di sfumature. Quindi livellare la piastra utilizzando i pulsanti su o giù e premere fine.

Dopo aver livellato la piastra, premere il grad. Vai all'elenco del menu dei gradienti e seleziona il rotore SW41. Quindi scegli il gradiente di saccarosio desiderato.

Premere l'uso. Posizionare il supporto del tubo di base magnetico sul creatore di gradienti. Quindi trasferire il tubo nel supporto.

È possibile preparare fino a sei pendenze contemporaneamente. Premere Esegui. Il creatore di gradienti ruota i tubi alla velocità e agli angoli del programma, formando un gradiente lineare.

Ci vorranno solo pochi minuti per preparare la sfumatura. Al termine del processo, posizionare la provetta in una griglia. Rimuovere il volume, uguale al volume del campione, dalla parte superiore delle provette per ultracentrifuga con gradienti di saccarosio.

Caricare con cautela 500 microlitri di lisato sopra. Posizionare i tubi nei secchi del rotore e bilanciarli. Centrifugare a 260.000 g per due ore a quattro gradi Celsius.

Frazionamento dei polisomi e raccolta dei campioni. Dopo l'ultracentrifugazione, posizionare le provette nei secchi del rotore sul ghiaccio. Attiva il raccoglitore di frazioni e il frazionatore.

Fare clic su Scansione nel menu del frazionatore. Mettere un rack con le provette di raccolta nel raccoglitore di frazioni. Riempire un serbatoio di risciacquo, sul lato del frazionatore con acqua deionizzata.

Premere il tasto di risciacquo per dieci secondi per risciacquare la pompa. Collegare un adattatore di risciacquo con la siringa piena d'acqua al pistone per la calibrazione. Apri il software del frazionatore sul computer.

Premere calibra. Utilizzare l'impostazione predefinita e premere Ok.Be pronto per iniettare l'acqua dalla siringa. Premere Ok per eseguire la calibrazione.

Inizia immediatamente a iniettare acqua per i prossimi cinque secondi. Apparirà il segno Calibrazione zero completata. Rimuovere un adattatore di risciacquo con la siringa e collegare una punta al pistone del frazionatore.

Aprire la valvola dell'aria in ottone e premere il tasto dell'aria per dieci secondi per asciugare il tubo dell'aria e la cella di flusso. Chiudere la valvola dell'aria. Prendere il tubo sfumato dal secchio del rotore e posizionarlo nella rastrelliera.

Applicare il tappo del supporto del tubo sulla parte superiore del tubo, quindi spostare con cautela il tubo nel supporto del tubo e bloccarlo. Posizionare il supporto sotto il pistone. Spesso, le bande polisomiali possono essere viste a occhio.

Introdurre le impostazioni desiderate per i numeri di frazione e il volume. Assegna un nome al file e premi Ok, quindi vai al pulsante grafico. Nella finestra successiva, premere avvia scansione.

Appariranno le impostazioni e premere Ok.Il raccoglitore si sposterà dalla grondaia alla prima frazione e il pistone si sposterà nel tubo. Quando il pistone raggiungerà la parte superiore del gradiente, rallenterà alla velocità selezionata e le frazioni verranno raccolte. Di solito, raccogliamo 24 frazioni da 500 microlitri ciascuna.

Al termine, il pistone uscirà dal tubo del gradiente. Aprire la valvola dell'aria in ottone. Premere il tasto aria sul frazionatore per recuperare l'ultima frazione.

Alla fine della corsa vedrai il profilo di assorbanza del gradiente. Analisi delle frazioni. Le frazioni ottenute possono essere utilizzate per l'analisi di RNA e proteine.

L'RNA può essere analizzato mediante elettroforesi seguita da Northern Blot o utilizzato per la produzione di cDNA, seguito da una reazione RT-qPCR per analizzare l'associazione dei singoli mRNA con i polisomi. Il sequenziamento di nuova generazione può essere utilizzato per analizzare lo stato traduzionale degli mRNA su scala trascrittomica. Per l'analisi delle proteine delle frazioni polisomiali, le proteine vengono precipitate con acido tricluricedico per concentrarle.

Successivamente le proteine vengono analizzate mediante Western Blotting, o mediante Mass Spec a livello del proteoma. Risultati. Qui presentiamo i risultati del frazionamento e dell'analisi dei polisomi sugli esempi di tre organismi. Leishmania, cellule umane coltivate e tessuto di topo.

Il frazionamento dei polisomi è stato utilizzato per studiare l'associazione dell'mRNA di Sherp e Tubulina con i ribosomi durante la traduzione e la Leishmania major. Il grafico dell'assorbanza per il frazionamento ha una forma distinta con picchi tipici per le subunità ribosomiche 40S e 60S, i monosomi 80S e i polisomi. Le aliquote delle frazioni sono state combinate in tre gruppi.

Pre-polisomi, polisomi leggeri e polisomi pesanti. I livelli relativi di mRNA sono stati studiati mediante una PCR quantitativa in tempo reale. I dati suggeriscono che l'mRNA della tubulina viene tradotto attivamente.

Poiché era per lo più associato a polisomi pesanti e leggeri. Mentre la traduzione dell'mRNA di Sherp è meno attiva. È stato trovato principalmente in associazione con pre-polisomi e polisomi leggeri.

Pertanto, questo esperimento dimostra chiaramente la capacità della tecnica di studiare l'impegno di un singolo mRNA nella traduzione. Questa figura presenta un tipico grafico dell'assorbanza del frazionamento dei polisomi delle cellule HeLa. Le proteine sono state concentrate per precipitazione con acido tricloroacetico al 10%.

La proteina ribosomiale RPS6 a subunità piccola e la proteina ribosomiale a subunità grande RPL11 sono state rilevate mediante Western Blot. La loro distribuzione era ben correlata con i picchi distinti, sullo spettro dell'assorbanza. Su questa figura, presentiamo un esempio di rilevazione di RNA ribosomiali mediante elettroforesi in polisomi frazionati dal testicolo del topo. Conclusioni.

La profilazione polisomiale è una tecnica versatile che può essere utilizzata per analizzare lo stato traduzionale di singoli mRNA, esaminare le proteine associate ai ribosomi e studiare la regolazione traduzionale in diversi organismi modello in diverse condizioni.