Name: Gene candidato test negli studi clinici di coorte con genotipizzazione multiplex e spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Scopri la genotipizzazione multiplex per l'analisi di geni candidati nelle malattie complesse usando la spettrometria di massa. Questo metodo efficiente e conveniente facilita studi clinici di coorte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

<ol><li>Aronson, S. J., Rehm, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+foundation+for+genomics+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Building the foundation for genomics in precision medicine.</a> Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).</li>
<li>Ball, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+GWAS%3A+power%2C+sample+size%2C+and+data+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome-Wide+Association+Studies+and+Genomic+Prediction%22%5BJournal%5D)">Designing a GWAS: power, sample size, and data structure.</a> Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).</li>
<li>Kwon, J. M., Goate, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+candidate+gene+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+research+and+health%22%5BJournal%5D)">The candidate gene approach.</a> Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).</li>
<li>Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+genotyping+using+single+base+primer+extension+coupled+with+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+%28MassARRAY%29%5BTitle%5D)+AND+%22Single+Nucleotide+Polymorphisms%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY).</a> Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).</li>
<li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+screening+and+diagnostic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+pharmaceutical+design%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research.</a> Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li>
<li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry%3A+an+emerging+technology+for+microbial+identification+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis.</a> Frontiers in microbiology. 6, 791(2015).</li>
<li>Cricca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genotyping+of+high-risk+Human+Papillomavirus+by+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method.</a> New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).</li>
<li>Ashley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Variation+at+the+Th2+Immune+Gene+IL13+is+Associated+with+IgE-mediated+Paediatric+Food+Allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy.</a> Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).</li>
<li>Bousman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+NRG1+and+DAOA+genetic+variation+on+transition+to+psychosis+in+individuals+at+ultra-high+risk+for+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis.</a> Translational psychiatry. 3 (4), e251(2013).</li>
<li>Moffatt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale%2C+consortium-based+genomewide+association+study+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.</a> New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).</li>
<li>Granada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+plasma+total+IgE+concentrations+in+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).</li>
<li>Oeth, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/290120569_iPLEX_Assay_Increased_Plexing_Efficiency_and_Flexibility_for_MassARRAY_System_Through_Single_Base_Primer_Extension_with_Mass-Modified_Terminators">iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators.</a> Sequenom application note. 27, (2005).</li>
<li>Ellis, J. A., Ong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MassARRAY+System+for+Targeted+SNP+Genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Genotyping%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping.</a> Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).</li>
<li>Johnson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP%3A+A+web-based+tool+for+identification+and+annotation+of+proxy+SNPs+using+HapMap%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap.</a> Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, dimostriamo che il metodo di genotipizzazione multiplex utilizzando la spettrometria di massa. I risultati rappresentativi sono stati generati usando la PCR abbinata a spettrometria di massa4 con chimica analisi elencati nella Tabella materiali13MALDI-TOF. Con questa piattaforma, abbiamo generato un totale di 11.295 genotipi su 1.255 individui per 9 SNPs all'interno di 40 h in laboratorio.
Vi illustriamo l'utilità della tecn...

Nella malattia umana complessa, varianti genetiche contribuiscono alla suscettibilità di malattia e quantificare queste varianti possono essere utili per la patogenesi di comprensione, identificare gruppi di pazienti ad alto rischio e trattamento risponditori. Infatti, la promessa della medicina di precisione dipende che utilizzano informazioni genomiche per identificare sottogruppi di pazienti1. Purtroppo, all'interno dello spazio di biologia della malattia complessa, dove i fenotipi di malattia sono sostenuti dalla sostanziale eterogeneità genetica, bassa penetranza ed espressività variabile, coorte dimensioni requisiti per approcci di genoma identificare romanzo i candidati sono spesso eccessivamente grande2. In alternativa, un approccio del gene candidato mirata comincia con un'ipotesi aprioristicamente su specifici geni/pathways in eziologia di malattia3. Strumenti di analisi del percorso sono comunemente utilizzati per studiare la patofisiologia di loci un target identificati, generando numerose vie di candidato di essere esplorato. Qui dimostriamo un approccio di genotipizzazione multiplex che consente per l'indagine di decine o centinaia di SNPs con un saggio, adatto a studi di coorte umano4. Questo approccio è relativamente alta attraverso-metta, permettendo a centinaia di migliaia di campioni di DNA per essere genotipizzati per studi di romanzo scoperta e studio delle specifiche vie. I metodi descritti qui sono utili per identificare gli alleli di rischio e le loro associazioni con caratteristiche cliniche in modo relativamente rapido e poco costoso. Questa piattaforma è stata estremamente vantaggiosa per screening e diagnostica fini5,6e più recentemente, per l'infezione microbica7 e8di papillomavirus umano.
Questo protocollo inizia con la selezione di un set di geni per le indagini, i. e., le regioni di destinazione, in genere determinate attraverso ricerche di letteratura o aprioristicamente ipotesi per il coinvolgimento nel processo di malattia; o forse selezionata per la replica come le più importanti associazioni di uno studio di associazione genome-wide (GWA) scoperta. Dal set di gene, il ricercatore selezionerà una raffinata lista di tag SNPs. Vale a dire la squilibrio (LD), o la correlazione tra varianti nella regione viene utilizzato per identificare un rappresentante 'modifica SNP' per un gruppo di SNPs in alto LD, conosciuto come un aplotipo. Il LD alta della regione significa che gli SNPs sono spesso ereditati insieme tale che genotyping uno SNP è sufficiente per rappresentare la variazione a tutti gli SNPs nell'aplotipo. In alternativa, se in seguito su un elenco definitivo di SNPs da molte regioni, ad es., replica per uno studio GWA, questo processo può essere inutile. Per la genotipizzazione multiplex, un'analisi quindi devono essere progettata intorno a questi obiettivi tale che i primer di amplificazione sono di massa differenti a quelle dei primer extension e prodotti per produrre interpretabile spettri di massa. Questi parametri sono facilmente implementati da uno strumento di progettazione di test di genotipizzazione multiplex. I primer forward e reverse da questo progetto servirà per mirare i marcatori di interesse e per amplificare la sequenza contenente il SNP. I primers di estensione allegare direttamente prossimale per gli SNPs e una base di 'terminator' singola, Ultima modifica di massa, che è complementare al SNP è aggiunto. La base di terminator impedisce l'ulteriore estensione del DNA. La massa-modifica della base consente di frammenti diversi di un'unica base per essere rilevato mediante spettrometria di massa. La piastra che contiene la chimica di genotipizzazione viene quindi applicata a un chip per la misura su una piattaforma di spettrometria di massa. Dopo l'applicazione di adeguati controlli di qualità per le chiamate di genotipizzazione grezzi rilevate dal sistema, i dati possono essere esportati e utilizzati per l'analisi statistica per verificare l'associazione con i fenotipi di malattia.

<table><tbody><tr><td>DNA genomico</td><td>-</td><td>-</td><td>1 &mu; L a una concentrazione di 5-10 ng/&mu; L</td></tr><tr><td>Primer: amplificazione ed estensione diretta e inversa</td><td>IDT</td> <td>-</td> <td>vedi sezione 1.2.1 del manoscritto sulla progettazione di primer</td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>Ad esempio, l'acqua Milli-Q&nbsp;</td><td>-</td><td>deionizzato con 18,2 M&Omega;. Kit</td></tr> di <tr><td>reagenti per genotipizzazione. iPLEX Gold Set di reagenti per la chimica&nbsp;</td><td>Agena Bioscience</td><td>#10148-2</td><td>include tutti i reagenti per le reazioni in 2.2.1, 2.3.1 e 2.4.2 , chip e</td></tr><tr><td>piastre PCR in resina (384 pozzetti)</td><td>Abgene</td><td>#ABGAB-1384</td><td>Per il sistema MassARRAY le piastre di Abgene sono compatibili</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td>a singolo e a 8 canali</td></tr><tr><td>Centrifuga&nbsp;</td><td></td><td></td><td>compatibile con piastre a 384 pozzetti</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td></td><td></td><td>compatibile con i programmi PCR come descritto nei punti 2.2.4, 2.3.2 e 2.4.3</td></tr><tr><td>Piastra in resina punzonata&nbsp;</td><td>Agena Bioscience</td><td></td><td>6mg, rotatore per piastre a 384 pozzetti</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore MassARRAY 4 Sistema</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>MALDI-TOF (desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice &ndash; tempo di volo) Spettrometro di massa.</td></tr><tr><td>RS1000 Nanodispenser</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay Design Suite</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>Strumento utilizzato per progettare i saggi di genotipizzazione multiplex</td></tr><tr><td>Hot Start Taq</td><td></td><td></td><td>DNA polimerasi enzima&nbsp;</td></tr><tr><td>Resina&nbsp;</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>Fornito con kit iPLEX</td></tr></tbody></table>

gene candidato test negli studi clinici di coorte con genotipizzazione multiplex e spettrometria di massa

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Malattie complesse sono spesso sostenuti dalla più comuni varianti genetiche che contribuiscono alla suscettibilità di malattia. Qui, descriviamo un approccio di polimorfismo (SNP) di singolo nucleotide conveniente tag usando un'analisi di genotipizzazione multiplex con spettrometria di massa, per studiare gene via associazioni in coorti cliniche. Studiamo il luogo del candidato allergia alimentare Interleukin13 (IL13) come esempio. Questo metodo, in modo efficiente, massimizza la copertura approfittando di squilibrio condivisa (LD) all'interno di una regione. Selezionato LD SNPs sono quindi progettati in un'analisi multiplex, consentendo fino a 40 diversi SNPs essere analizzati simultaneamente, aumentando la redditività. Reazione a catena della polimerasi (PCR) viene utilizzata per amplificare i loci di destinazione, seguiti dall'estensione di singolo nucleotide, e gli ampliconi sono quindi valutati con matrix-assisted laser desorption/ionizzazione-tempo di spettrometria di massa flight(MALDI-TOF). L'uscita raw viene analizzata con il genotipo di chiamare un software, utilizzando le definizioni di controllo di qualità rigoroso e cut-off, e genotipi di alta probabilità sono determinati e output per l'analisi dei dati.

Con il protocollo descritto in precedenza, abbiamo genotipizzati tag SNPs attraverso il gene immune Th2 IL13 in una coorte di cibo allergia casi e controlli9. Abbiamo applicato l'analisi di regressione logistica, regolato per l'ascendenza e altri potenziali covariate verificare se le varianti genetiche all'interno della regione di interesse aumentato rischio di allergia alimentare. Tabella 10 9 dimostra che una vari...

Identificazione di varianti genetiche che contribuiscono alla malattia umana complessa permette di identificare nuovi meccanismi. Qui, dimostriamo un approccio di genotipizzazione multisala di geni candidati o analisi dei percorsi gene che massimizza la copertura a basso costo ed è favorevole agli studi di coorte.

Gene candidato test negli studi clinici di coorte con genotipizzazione multiplex e spettrometria di massa

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della diagnostica clinica e della genetica, come il rilevamento di marcatori genetici associati agli esiti della malattia, incluso il virus del papilloma umano. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo diagnostico mirato ed efficiente in termini di tempo. Per iniziare questa procedura, ricostituire tutti i primer liofilizzati ordinati con acqua di grado molecolare.Estrarre i primer in avanti e indietro per ogni saggio multiplex in una miscela di primer standard, in modo tale che contenga ciascun primer a una concentrazione di zero virgola cinque millimolari. Successivamente, preparare una miscela master per la PCR come indicato nel protocollo di testo. Aggiungere quattro microlitri di questa miscela a ciascun pozzetto di una piastra PCR a 384 pozzetti, insieme a un microlitro di DNA genomico a una concentrazione compresa tra cinque e 10 nanogrammi per microlitro.Coprire la piastra con un coperchio e centrifugare per 200 volte G per un minuto a temperatura ambiente. Quindi eseguire la PCR come indicato nel protocollo di testo. Caricare un microlitro di prodotto PCR con tre microlitri di t

candidate-gene-testing-clinical-cohort-studies-with-multiplexed

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Associazioni di genetica spesso rimangono inspiegabili a livello funzionale. Questo metodo si propone di valutare l'effetto del fenotipo-marcatori genetici associati sull'espressione genica analizzando cellule eterozigoti per SNP trascritte. La tecnologia permette la misura precisa di MALDI-TOF spettrometria di massa per quantificare allele-specifici prodotti primer extension.

Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica

Un protocollo è descritto che utilizza saggi di Illumina Infinium effettuare genotipizzazione su larga scala. Questi test possono genotipo affidabile milioni di SNPs su centinaia di singoli campioni di DNA in tre giorni. Una volta generata, questi genotipi possono essere usate per controllare le associazioni con una varietà di malattie o fenotipi differenti.

Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

Descriviamo la preparazione di librerie di DNA codici a barre e la successiva base di ibridazione-esone cattura per la rilevazione di mutazioni tumorali associate chiave in campioni tumorali clinici di massively parallel sequencing "prossima generazione". Mirato esone sequenziamento offre i vantaggi di elevata produttività, basso costo, e la copertura sequenza profondo, ottenendo così elevata sensibilità per la rilevazione delle mutazioni a bassa frequenza.

Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel

Viene descritto un sistema integrato per il sequenziamento mirato di nuova generazione di campioni oncologici. Questo sistema multipiattaforma è ottimizzato per biopsie tumorali di bassa qualità e bassa quantità, accoglie bassi input di DNA, include controlli multivariante ben caratterizzati e presenta un nuovo chiamante di varianti informato da misure quantitative di controllo di qualità pre-analitiche.

Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

Presentiamo un piano strategico e un protocollo per identificare le varianti genetiche non codificanti che influenzano il legame del DNA con il fattore di trascrizione (TF). Viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) e il saggio di precipitazione di affinità del DNA (DAPA) del legame del DNA TF genotipo-dipendente.

Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

Analisi di segnale-rumore dell'amminoacido-livello determina la prevalenza della variabilità genetica in una posizione determinata dell'amminoacido normalizzata alla variazione genetica di sfondo di una determinata popolazione. Questo consente per l'identificazione della variante "hotspot" all'interno di una sequenza della proteina (segnale) che si erge sopra la frequenza delle varianti rare trovate in una popolazione (rumore).

Determinazione del rischio di patogenicità variante usando l'analisi di segnale-rumore dell'amminoacido-livello di variazione genetica

Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Questo articolo descrive in dettaglio l'uso di un kit di preparazione della libreria a catena di reazione a catena multiplea Vengono descritte entrambe le fasi di analisi wet-bench e dei dati.

Rilevamento oncogenico della fusione genica utilizzando la reazione della catena di polimerasi multiplex ancorata seguita dal sequenziamento di nuova generazione

Il protocollo presenta le procedure generali in laboratorio richieste nei test genetici preimpianto per l'aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori. Qui presentiamo i passaggi dettagliati dell'amplificazione dell'intero genoma, della selezione dei frammenti di DNA, della costruzione della libreria, della preparazione del modello e del flusso di lavoro del sequenziamento con risultati rappresentativi.

Test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori

Abbiamo sviluppato un approccio oncogenomico comparativo cross-species utilizzando analisi genomiche e screening genomici funzionali per identificare e confrontare bersagli terapeutici nei tumori che insorgono in modelli murini geneticamente modificati e il corrispondente tipo di tumore umano.

Profilazione genetica e screening dell'abbandono su scala genomica per identificare bersagli terapeutici in modelli murini di tumore maligno della guaina nervosa periferica

Scopri la genotipizzazione multiplex per l'analisi di geni candidati nelle malattie complesse usando la spettrometria di massa. Questo metodo efficiente e conveniente facilita studi clinici di coorte.

Gene candidato test negli studi clinici di coorte con genotipizzazione multiplex e spettrometria di massa

Esplora altri video