Gene candidato test negli studi clinici di coorte con genotipizzazione multiplex e spettrometria di massa
21 giugno 2018
Identificazione di varianti genetiche che contribuiscono alla malattia umana complessa permette di identificare nuovi meccanismi. Qui, dimostriamo un approccio di genotipizzazione multisala di geni candidati o analisi dei percorsi gene che massimizza la copertura a basso costo ed è favorevole agli studi di coorte.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della diagnostica clinica e della genetica, come il rilevamento di marcatori genetici associati agli esiti della malattia, incluso il virus del papilloma umano. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo diagnostico mirato ed efficiente in termini di tempo. Per iniziare questa procedura, ricostituire tutti i primer liofilizzati ordinati con acqua di grado molecolare.
Estrarre i primer in avanti e indietro per ogni saggio multiplex in una miscela di primer standard, in modo tale che contenga ciascun primer a una concentrazione di zero virgola cinque millimolari. Successivamente, preparare una miscela master per la PCR come indicato nel protocollo di testo. Aggiungere quattro microlitri di questa miscela a ciascun pozzetto di una piastra PCR a 384 pozzetti, insieme a un microlitro di DNA genomico a una concentrazione compresa tra cinque e 10 nanogrammi per microlitro.
Coprire la piastra con un coperchio e centrifugare per 200 volte G per un minuto a temperatura ambiente. Quindi eseguire la PCR come indicato nel protocollo di testo. Caricare un microlitro di prodotto PCR con tre microlitri di tampone di caricamento su un gel di agarosio al 2%.
Far funzionare a 100 volt per 45 minuti per garantire che l'amplificazione del DNA abbia avuto successo. Successivamente, preparare una master mix SAP come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere due microlitri della master mix SAP appena preparata a ciascun pozzetto della piastra PCR precedentemente eseguita.
Centrifugare brevemente a 1.000 volte G per un minuto. E poi rimettere la piastra nel termociclatore. Far funzionare il termociclatore a 37 gradi Celsius per 40 minuti.
E poi a 85 gradi Celsius per cinque minuti per inattivare l'enzima. Dopo aver calcolato il fattore di diluizione per ciascun primer, combinare i volumi determinati di ciascuno per formare un pool di primer. Aggiungere acqua se necessario per diluire questa piscina.
Assemblare la master mix di estensione per il saggio ad alto plex o per il test a basso plex, come indicato nel protocollo di testo. Aggiungere due microlitri di extension master mix a ciascun pozzetto della piastra, portando il volume totale in ciascun pozzetto fino a nove microlitri. Centrifugare brevemente a 1.000 volte G per un minuto, quindi rimettere la piastra nel termociclatore.
Successivamente, aggiungere 16 microlitri di acqua deionizzata a ciascun pozzetto, portando il volume totale fino a 25 microlitri per pozzetto. Applicare sei milligrammi di resina in modo uniforme su un'intera lastra di resina punzonata. Lascia asciugare la resina per 20 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, applicare la resina sulla piastra di reazione. Utilizzando un mixer a sospensione, ruotare la piastra a bassa velocità per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, centrifugare la piastra a 3, 200 volte G per cinque minuti per evitare di applicare la resina al chip dello spettro di massa.
Caricare il layout di esempio della lastra nell'interfaccia software del sistema. Utilizzando un sistema di erogazione, applicare la miscela di analita di genotipizzazione dalla piastra al chip di genotipizzazione. Caricare il chip nel sistema MALDI-TOF per generare gli spettri di massa dalla miscela di analiti e interpretarlo utilizzando l'interfaccia software della piattaforma.
In questo studio, la genotipizzazione multiplex viene eseguita utilizzando la spettrometria di massa. I dati SNP rappresentativi vengono generati e analizzati per il gene candidato IL13 in una coorte clinica di scoperta fenotipizzata per l'allergia alimentare. Una variante, rs1295686, è associata a un'allergia alimentare comprovata.
Questa associazione è confermata in una coorte di replicazione utilizzando l'approccio di genotipizzazione multiplex dimostrato in questo protocollo. Una meta-analisi dei risultati delle due coorti fornisce una forte evidenza dell'associazione tra IL13 e FA. Durante il tentativo di questa procedura, è importante non contaminare campioni o reagenti. È inoltre importante preparare una miscela master aggiuntiva del 10% per ogni PCR al fine di tenere conto di eventuali errori di pipettaggio.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR in tempo reale per rispondere a ulteriori domande, ad esempio se l'espressione genica è correlata con i marcatori genetici associati alla malattia identificati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della diagnostica clinica e della genetica per esplorare le associazioni di malattie nelle coorti di pazienti. Non dimenticare che quando si lavora con i reagenti di genotipizzazione e il sistema MALDI-TOF può essere pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e camice da laboratorio.
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Panoramica
Questo studio presenta un approccio di genotipizzazione multiplex per l'analisi di geni candidati associati a malattie umane complesse. Il metodo è economico ed adatto a studi basati su coorti, migliorando il rilevamento di marcatori genetici associati agli esiti delle malattie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Genetica
- Diagnostica Clinica
- Rilevamento di Patogeni
Sfondo
- L'identificazione di varianti genetiche contribuisce a comprendere i meccanismi delle malattie.
- Metodi economicamente vantaggiosi sono fondamentali per studi su larga scala.
- Il genotipaggio multiplex può migliorare l'efficienza diagnostica.
- Il virus del papilloma umano è un esempio di bersaglio per il rilevamento di marcatori genetici.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo di genotipizzazione multiplex per l'analisi di geni candidati.
- Massimizzare la copertura riducendo al minimo i costi.
- Facilitare studi basati su coorti in genetica.
Metodi Utilizzati
- Ricostituzione dei primer liofilizzati con acqua di grado molecolare.
- Preparazione di una miscela madre di primer a una concentrazione di 0,5 millimolare.
- Preparazione della miscela master per PCR secondo il protocollo indicato.
- Utilizzo di una piastra PCR a 384 pozzetti per l'analisi del DNA genomico.
Risultati principali
- Il metodo ha dimostrato efficienza nel rilevamento di marcatori genetici.
- L'economicità è stata convalidata attraverso l'applicazione pratica.
- L'efficienza temporale è stata osservata nel processo diagnostico.
- Applicazione riuscita al rilevamento del virus del papilloma umano.
Conclusioni
- L'approccio di genotipizzazione multiplex è uno strumento prezioso in genetica.
- Fornisce un quadro di riferimento per futuri studi sulle malattie complesse.
- Ulteriori ricerche potrebbero ampliarne le applicazioni nella diagnostica clinica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Il genotipaggio multiplex con spettrometria di massa consente un'analisi ad alto rendimento ed economicamente efficiente di varianti genetiche in coorti cliniche, supportando la validazione di bersagli nella ricerca su malattie complesse. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva collegando loci candidati come IL13 a risultati fenotipici come l'allergia alimentare attraverso studi di associazione statisticamente robusti. Tale metodica colloca il screening genetico come strumento di scoperta scalabile per ridurre i rischi associati a ipotesi terapeutiche nelle fasi iniziali dei processi di ricerca e sviluppo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche testando le associazioni tra varianti genetiche e fenotipi di malattia in coorti clinicamente rilevanti.
- Valore operativo: Consente l'analisi simultanea di fino a 40 SNP per saggio, aumentando l'efficienza nella validazione di bersagli a livello di pathway.
- Valore predittivo: Contribuisce a ridurre i rischi legati a IL13 come bersaglio terapeutico mediante la replicazione e la meta-analisi delle associazioni genotipo-fenotipo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Utilizza il disequilibrio di associazione per massimizzare la copertura genomica con una selezione minima di SNP, migliorando l'efficienza nella progettazione dei saggi.
- Valore operativo: Il rilevamento MALDI-TOF fornisce dati di genotipizzazione quantitativi e ad alta risoluzione, adatti per pipeline di analisi automatizzate.
- Scalabilità: Il formato PCR in piastre da 384 pozzetti consente un'elevata capacità di elaborazione dei campioni, ideale per campagne di screening su coorti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega i risultati genetici ottenuti in coorti umane a percorsi di validazione funzionale, sostenendo la selezione di bersagli allineati ai biomarcatori.
- Avanzamento ponderato rispetto al rischio: La replicazione in coorti indipendenti rafforza la fiducia nel passaggio dalla scoperta all'investimento preclinico.
- Approfondimento meccanicistico: Permette studi successivi (ad esempio, correlazione con l'espressione genica) per chiarire i meccanismi biologici alla base delle associazioni genetiche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dallo screening genetico all'identificazione di composti promettenti, fornendo coorti geneticamente stratificate per la validazione successiva dei bersagli e lo screening di composti.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi genetiche in coorti cliniche fenotipizzate per chiarire i percorsi associati alla malattia e prioritizzare i bersagli.
- Screening: Genera dati di genotipo standardizzati e riproducibili che consentono una stratificazione affidabile dei campioni per saggi funzionali.
- Analisi: Fornisce chiamate di genotipo ad alta affidabilità con soglie di controllo qualità, supportando il confronto statistico tra condizioni e coorti.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati genetici umani alla validazione preclinica identificando varianti con forte associazione fenotipica.
- Riutilizzo aziendale: La progettazione di saggi multiplex è adattabile a diversi geni e malattie, sostenendo investimenti a livello di piattaforma nell'infrastruttura di genotipizzazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo attraverso associazioni genetiche supportate statisticamente in popolazioni clinicamente rilevanti.
- Valore operativo: Riduce il costo per campione mediante multiplexing e semplifica il flusso di lavoro integrando PCR, estensione e rilevamento MALDI-TOF.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze genetiche umane che riducono i rischi nella selezione degli obiettivi nelle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione degli obiettivi adeguata al rischio, basata sulla replicabilità e sull'entità dell'effetto negli studi di coorte.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di saggi genetici, nell'ottimizzazione della PCR e nell'interpretazione dei dati MALDI-TOF.
- È subordinato all'accesso a sistemi di spettrometria di massa con capacità di multiplex e a software di genotipizzazione validati.
- Necessita di protocolli standardizzati per la manipolazione dei campioni e il controllo qualità per garantire la riproducibilità tra diversi siti o lotti.
- L'adattamento a nuovi bersagli richiede la selezione di SNP basata sull'equilibrio di associazione (LD) e la verifica della compatibilità dei primer per il multiplexing.
- I limiti pratici includono la sensibilità alla qualità del DNA del campione e la necessità di una manipolazione accurata dei reagenti per evitare contaminazioni.
