Un modello In Vitro per studiare l'effetto della terapia fotodinamica 5-aminolevulinico-mediata su Staphylococcus aureus Biofilm
16 aprile 2018
Questo manoscritto descrive un protocollo per studiare l'effetto antimicrobico della terapia fotodinamica mediata da acido 5-aminolevulinico (ALA-PDT) su un biofilm di Staphylococcus aureus . Questo protocollo può essere usato per sviluppare un modello in vitro per studiare il trattamento di biofilm batterici con PDT in futuro.
L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare l'effetto antimicrobico dell'acido cinque-aminolevulinico o della terapia fotodinamica mediata da ALA su un biofilm di stafilococco aureo. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo del biofilm batterico su come la riparazione cellulare fotodinamica potrebbe essere utilizzata come trattamento alternativo per il controllo delle infezioni da biofilm. Un vantaggio di questa procedura è che ha il potenziale per essere utilizzata per altri batteri con una regolazione minima.
Per generare un biofilm in una piastra a 96 pozzetti, inoculare prima uno a meno 80 gradi Celsius ThOD Staphylococcus aureus USA trecento in tre biofilm formando colture di ceppi clinici in singole provette a fondo tondo da 14 millilitri contenenti cinque millilitri di brodo di soia triptonico, o TSB, medium, in un incubatore a 37 gradi Celsius con agitazione durante la notte. Quando le colture hanno raggiunto la fase stazionaria, centrifugare le cellule batteriche e risospendere i pellet e il PBS a una concentrazione di due volte 10 per la nona unità formante colonia per millilitro. Diluire queste sospensioni batteriche in un rapporto da uno a 200 e TSB con un mezzo integrato con zero virgola cinque per cento di glucosio e seminare 200 microlitri di cellule batteriche per pozzetto in tre pozzetti per ceppo per gruppo sperimentale in una micropiastra a 96 pozzetti trattata con coltura cellulare di polistirene per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius, con ossigeno, senza agitare.
Il giorno successivo, lavare delicatamente i pozzetti tre volte con PBS senza disturbare i biofilm. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di ALA appena preparato negli appositi pozzetti sperimentali e posizionare la piastra a 25 gradi Celsius per un'ora al riparo dalla luce. Quindi irradiare la lastra con un diodo a emissione di luce a un'intensità luminosa di 100 milliwatt per centimetro quadrato per un'ora.
Per contare il numero di batteri vitali per gruppo alla fine del trattamento di fototerapia, lavare delicatamente ogni pozzetto tre volte con PBS per rimuovere eventuali cellule non aderenti. Quindi utilizzare una punta di pipetta per raschiare i batteri aderenti dal fondo di ciascun pozzetto. Estrarre le cellule di ciascun gruppo in una provetta Eppendorf per condizione sperimentale e pellettare le cellule mediante centrifugazione.
Risospendere i pellet in un millilitro di enzima pancreatina allo 0,25% e PBS per un'incubazione di 90 minuti a 37 gradi Celsius, seguita da un'altra centrifugazione. Risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS ed effettuare da una a 10 diluizioni seriali di ciascun gruppo, aggiungendo cinque microlitri di campione diluito in serie su singole piastre di agar di soia triptone. Quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 16 ore e contare il numero di colonie batteriche per gruppo.
Per valutare i biofilm mediante microscopia a scansione laser confocale, generare e irradiare i biofilm come dimostrato. Lavare i biofilm irradiati con PBS e colorare le cellule vive e morte con un millilitro di colorante fluorescente verde fluorescente permeabile alla membrana delle cellule procariotiche e un millilitro di un micromolare di ioduro di propidio, rispettivamente. Dopo 20 minuti, rimuovere la macchia in eccesso e visualizzare i biofilm mediante microscopia a scansione laser confocale sotto un obiettivo a immersione in olio 63 volte 1,4 NA.
La vitalità dei batteri del biofilm diminuisce dopo il doppio trattamento con fototerapia ALA rispetto alla vitalità batterica del biofilm di controllo singolo o non trattato e a tutti e quattro i ceppi testati. La visualizzazione dei biofilm mediante microscopia confocale a scansione laser conferma questo risultato, con la maggior parte delle cellule positive per lo ioduro di propidio osservate nel gruppo di doppio trattamento con fototerapia ALA. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che l'intera manipolazione dei batteri trattati con ALA deve essere eseguita al buio e il biofilm del materiale deve essere maneggiato delicatamente per evitare di disturbare il biofilm formato.
Questo messaggio può essere applicato ai ricercatori nel campo delle infezioni batteriche per esplorare l'effetto antimicrobico della terapia fotodinamica sul biofilm batterico in vitro.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive un protocollo per studiare l'effetto antimicrobico della terapia fotodinamica mediata dall'acido 5-aminolevulinico (ALA-PDT) su un biofilm di Staphylococcus aureus. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo dei biofilm batterici riguardo trattamenti alternativi per il controllo delle infezioni da biofilm.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Terapia Fotodinamica
- Ricerca sui Biofilm
Sfondo
- Staphylococcus aureus è un patogeno comune associato a infezioni da biofilm.
- La terapia fotodinamica (PDT) è un trattamento che utilizza composti attivati dalla luce per uccidere i batteri.
- L'acido 5-aminolevulinico (ALA) è un precursore nella sintesi di fotosensibilizzatori utilizzati nella PDT.
- Questo studio mira a sviluppare un modello in vitro per testare l'ALA-PDT su biofilm batterici.
Scopo dello studio
- Valutare l'effetto antimicrobico della PDT mediata da ALA su biofilm di Staphylococcus aureus.
- Esplorare il potenziale della PDT come trattamento alternativo per le infezioni da biofilm.
- Stabilire un protocollo che possa essere adattato ad altri ceppi batterici.
Metodi Utilizzati
- Innoculazione di Staphylococcus aureus in brodo di triptone soia (TSB) per formare biofilm.
- Incubazione delle colture a 37 gradi Celsius per raggiungere la fase stazionaria.
- Centrifugazione e risospensione delle cellule batteriche in PBS.
- Seeding delle cellule batteriche in una piastra microtitolazione a 96 pozzetti per il trattamento con PDT.
Risultati principali
- Il protocollo genera con successo biofilm adatti per testare la PDT con ALA.
- La PDT con ALA ha dimostrato effetti antimicrobici potenziali contro i biofilm di Staphylococcus aureus.
- Il metodo può essere adattato per altre ceppi batterici con minimi aggiustamenti.
- Sono necessari ulteriori studi per ottimizzare le condizioni di trattamento.
Conclusioni
- La PDT con ALA è un approccio promettente per il trattamento dei biofilm batterici.
- Questo studio fornisce le basi per future ricerche sulla terapia fotodinamica.
- Comprendere i meccanismi della PDT può portare a strategie terapeutiche migliorate per le infezioni correlate ai biofilm.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello in vitro consente una valutazione meccanicistica della terapia fotodinamica (PDT) per le infezioni associate a biofilm, una sfida crescente nello sviluppo di agenti antimicrobici. Quantificando le unità formanti colonie e visualizzando la vitalità mediante microscopia confocale, il saggio fornisce letture quantitative e riproducibili per ridurre i rischi associati ai candidati PDT fin dalle fasi iniziali della scoperta. La piattaforma supporta la validazione degli obiettivi e l'identificazione di composti promettenti per strategie anti-biofilm, particolarmente rilevanti per Staphylococcus aureus e altri patogeni formatori di biofilm.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica l'ipotesi terapeutica dell'efficacia della PDT con ALA contro i biofilm di S. aureus mediante la riduzione delle UFC e la colorazione della vitalità.
- Valore operativo: Permette la validazione del bersaglio funzionale collegando l'attivazione del fotosensibilizzatore ai meccanismi di uccisione batterica in un modello di biofilm controllato.
- Valore predittivo: Supporta decisioni precliniche di proseguimento o interruzione dello sviluppo dimostrando effetti antimicrobici dipendenti dalla dose e dal tempo in condizioni standardizzate.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera biofilm maturi e riproducibili di S. aureus in formato a 96 pozzetti, adatti allo screening ad alto rendimento di composti per la terapia fotodinamica.
- Output quantitativo: Fornisce conteggi di UFC e dati di microscopia confocale come letture indipendenti per la valutazione della potenza del composto e della capacità di penetrazione nel biofilm.
- Riutilizzo della piattaforma: Adattabile ad altri ceppi batterici e fotosensibilizzatori con minimi aggiustamenti del protocollo, consentendo ampie applicazioni nello screening di agenti anti-infettivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la patologia: Modella infezioni da biofilm di S. aureus clinicamente rilevanti, collegando risultati in vitro alla validazione preclinica di agenti anti-infettivi basati sulla terapia fotodinamica.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce il meccanismo della terapia fotodinamica mediante colorazione vitale/di morte, riducendo l'ambiguità nei percorsi di eradicazione del biofilm.
- Continuità traslazionale: Supporta le decisioni di avanzamento fornendo dati riproducibili sull'inibizione del biofilm in più ceppi e replicati sperimentali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta di agenti antibatterici, dalla validazione del bersaglio fino all'ottimizzazione del composto leader e ai test di efficacia preclinica, in particolare per le modalità mirate ai biofilm.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi meccanicistiche relative alla distruzione del biofilm indotta dalla PDT e alla perdita di vitalità batterica in un modello fisiologicamente rilevante.
- Screening: Permette la valutazione standardizzata di fotosensibilizzatori e parametri di dose luminosa per l'attività anti-biofilm.
- Analisi: Fornisce metriche di riduzione delle UFC e di vitalità basate sulla fluorescenza per confrontare le condizioni di trattamento e guidare le relazioni struttura-attività.
- Ricerca traslazionale: Collega l'inibizione del biofilm in vitro a modelli di efficacia preclinica attraverso endpoint quantificabili e riproducibili.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma modulare di PDT su biofilm applicabile a diversi bersagli patogeni e chemiotipi di fotosensibilizzatori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nelle interazioni tra PDT e biofilm attraverso la visualizzazione diretta e la quantificazione dell'uccisione batterica.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro standardizzato e protetto dalla luce, con fasi definite di incubazione, irradiazione e lettura dei risultati, per garantire la riproducibilità tra laboratori.
- Valore strategico: Migliora la certezza decisionale nella selezione di candidati alla PDT fornendo dati precoci di efficacia in un modello di biofilm clinicamente rilevante.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei programmi di PDT adeguata al rischio, identificando composti con dimostrata capacità di penetrazione nei biofilm e attività antimicrobica.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche microbiologiche, nella coltura di biofilm e nei protocolli di sicurezza fotobiologica.
- È dipendente da attrezzature per l'esposizione controllata alla luce (ad esempio, misuratore di irraggiamento a LED) e da microscopia a fluorescenza o lettore di piastre per i risultati in termini di UFC e acquisizione di immagini.
- Necessita della standardizzazione della preparazione dell'ALA, dei tempi di incubazione e della somministrazione della luce tra i diversi gruppi sperimentali per garantire la riproducibilità.
- L'adattamento ad altri ceppi batterici potrebbe richiedere l'ottimizzazione delle condizioni di formazione del biofilm e dell'efficienza di assorbimento del fotosensibilizzatore.
- Limite pratico: la suscettibilità del biofilm può variare in base alla fase di crescita e alla composizione della matrice, richiedendo controlli accurati per studi comparativi.
