Un modello In Vitro per studiare l'effetto della terapia fotodinamica 5-aminolevulinico-mediata su Staphylococcus aureus Biofilm

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare l'effetto antimicrobico dell'acido cinque-aminolevulinico o della terapia fotodinamica mediata da ALA su un biofilm di stafilococco aureo. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo del biofilm batterico su come la riparazione cellulare fotodinamica potrebbe essere utilizzata come trattamento alternativo per il controllo delle infezioni da biofilm. Un vantaggio di questa procedura è che ha il potenziale per essere utilizzata per altri batteri con una regolazione minima.

Per generare un biofilm in una piastra a 96 pozzetti, inoculare prima uno a meno 80 gradi Celsius ThOD Staphylococcus aureus USA trecento in tre biofilm formando colture di ceppi clinici in singole provette a fondo tondo da 14 millilitri contenenti cinque millilitri di brodo di soia triptonico, o TSB, medium, in un incubatore a 37 gradi Celsius con agitazione durante la notte. Quando le colture hanno raggiunto la fase stazionaria, centrifugare le cellule batteriche e risospendere i pellet e il PBS a una concentrazione di due volte 10 per la nona unità formante colonia per millilitro. Diluire queste sospensioni batteriche in un rapporto da uno a 200 e TSB con un mezzo integrato con zero virgola cinque per cento di glucosio e seminare 200 microlitri di cellule batteriche per pozzetto in tre pozzetti per ceppo per gruppo sperimentale in una micropiastra a 96 pozzetti trattata con coltura cellulare di polistirene per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius, con ossigeno, senza agitare.

Il giorno successivo, lavare delicatamente i pozzetti tre volte con PBS senza disturbare i biofilm. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di ALA appena preparato negli appositi pozzetti sperimentali e posizionare la piastra a 25 gradi Celsius per un'ora al riparo dalla luce. Quindi irradiare la lastra con un diodo a emissione di luce a un'intensità luminosa di 100 milliwatt per centimetro quadrato per un'ora.

Per contare il numero di batteri vitali per gruppo alla fine del trattamento di fototerapia, lavare delicatamente ogni pozzetto tre volte con PBS per rimuovere eventuali cellule non aderenti. Quindi utilizzare una punta di pipetta per raschiare i batteri aderenti dal fondo di ciascun pozzetto. Estrarre le cellule di ciascun gruppo in una provetta Eppendorf per condizione sperimentale e pellettare le cellule mediante centrifugazione.

Risospendere i pellet in un millilitro di enzima pancreatina allo 0,25% e PBS per un'incubazione di 90 minuti a 37 gradi Celsius, seguita da un'altra centrifugazione. Risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS ed effettuare da una a 10 diluizioni seriali di ciascun gruppo, aggiungendo cinque microlitri di campione diluito in serie su singole piastre di agar di soia triptone. Quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 16 ore e contare il numero di colonie batteriche per gruppo.

Per valutare i biofilm mediante microscopia a scansione laser confocale, generare e irradiare i biofilm come dimostrato. Lavare i biofilm irradiati con PBS e colorare le cellule vive e morte con un millilitro di colorante fluorescente verde fluorescente permeabile alla membrana delle cellule procariotiche e un millilitro di un micromolare di ioduro di propidio, rispettivamente. Dopo 20 minuti, rimuovere la macchia in eccesso e visualizzare i biofilm mediante microscopia a scansione laser confocale sotto un obiettivo a immersione in olio 63 volte 1,4 NA.

La vitalità dei batteri del biofilm diminuisce dopo il doppio trattamento con fototerapia ALA rispetto alla vitalità batterica del biofilm di controllo singolo o non trattato e a tutti e quattro i ceppi testati. La visualizzazione dei biofilm mediante microscopia confocale a scansione laser conferma questo risultato, con la maggior parte delle cellule positive per lo ioduro di propidio osservate nel gruppo di doppio trattamento con fototerapia ALA. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che l'intera manipolazione dei batteri trattati con ALA deve essere eseguita al buio e il biofilm del materiale deve essere maneggiato delicatamente per evitare di disturbare il biofilm formato.

Questo messaggio può essere applicato ai ricercatori nel campo delle infezioni batteriche per esplorare l'effetto antimicrobico della terapia fotodinamica sul biofilm batterico in vitro.