Name: Interazioni piante-microrganismi: Risposta trascrizionale di Bacillus Mycoides di essudati di patate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Scopri l'analisi trascrizionale di Bacillus mycoides esposto agli essudati radicali di patata. Questo metodo identifica geni batterici chiave nelle interazioni pianta-microrganismo per applicazioni agricole.

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Ringraziamo Jakob Viel per i suoi utili commenti e suggerimenti. Ringraziamo anche Anne de Jong per il suo aiuto nell'analisi bioinformatica. Yanglei Yi e Zhibo Li sono supportati dal Consiglio di borsa di studio Cina (CSC). Ringraziamo NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) per il loro sostegno finanziario all'OPK.

1. patate in condizioni sterili di germinazione
<ol><li>Sciacquare la superficie di patate con acqua sterile. Fare il bagno la patata in etanolo al 70% e poi in 3% di ipoclorito di sodio, per 5 minuti ciascuno. Risciacquare con acqua sterile per rimuovere qualsiasi residuo di ipoclorito di sodio.</li>
	<li>Preparare i materiali necessari per germinare e crescere di tuberi di patata; sterilizzare i vasi di plastica, cesti di attecchimento, vermiculite e acqua in autoclave a 121 ° C per 20 min. Nota: Assicurarsi che tutti i materiali utilizzati sono autoclavabili. In caso contrario, utilizzare altri metodi di sterilizzazione.</li>
	<li>Mettere la patata di superficie-sterilizzato nel cesto attecchimento e questo posto in una pentola in autoclave con vermiculite umida.</li>
	<li>Mantenere il piatto in una camera climatica a 24 ° C per tre settimane. Impostarlo su cicli di 16 h di luce (120 µmol m-2s-1) e 8 ore di buio. Per evitare contaminazioni microbiche, è possibile utilizzare una casella di fibra di vetro di grandi dimensioni per coprire la pentola.</li>
</ol>2. raccolta di essudati di patate
<ol><li>Quando i germogli germoglio, trasferimento il cestello con la patata intera in un becher sterilizzato riempito con 150 mL di acqua deionizzata in autoclave, con la patata tuberi posizionati appena sopra la superficie dell'acqua e le radici immerse nell'acqua (Vedi Figura 1). Tenere la piantina della camera climatica e utilizzare le stesse impostazioni come prima [24 ° C; cicli di 16 h di luce (120 µmol m-2s-1), 8 h delle tenebre].</li>
	<li>Dal secondo giorno, raccogliere l'acqua contenente gli essudati e riempire il becher con acqua deionizzata sterile. Eseguire il campionamento ogni giorno fino al settimo giorno dopo il trasferimento il semenzale.</li>
	<li>Conservare ogni campione separatamente a 4 ° C. Per ogni campione, diffondere 100 µ l su una Luria-Bertani (LB; tryptone di 1%, 0,5% di Estratto di lievito, 0.5% NaCl) piastra di agar per verificare contaminazioni microbiche. Scartare i campioni contaminati.</li>
	<li>Combinare i campioni raccolti di una piantina e concentrarle di liofilizzazione li a-40 ° C ad un volume finale di 150 mL.</li>
</ol>3. aumento dei batteri
<ol><li>Inoculare un ceppo di b. mycoides da uno stock di glicerolo di-80 ° C su una piastra di agar LB ed incubare la piastra a 30 ° C durante la notte.</li>
	<li>Inoculare un terreno liquido LB con una singola Colonia dalla piastra e far crescere la cultura in un incubatore d'agitazione a 200 giri/min durante la notte a 30 ° C.</li>
</ol>4. trattamento e campionamento dei batteri
<ol><li>Per confrontare la curva di crescita dei batteri trattati con essudati radicali di un controllo negativo, preparare una serie di recipienti contenenti 50 mL di terreno liquido LB. Aggiungere 0,5 mL di coltura batterica durante la notte per tutte le beute e aggiungere 0%, 5%, 10%, o essudato radice 15% (v/v) o acqua deionizzata sterile al medium, rispettivamente.</li>
	<li>Utilizzare una lingua con acqua deionizzata invece di essudati radicali come controllo. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) ogni 1h in seguito. Generare una curva di crescita tracciando i valori di600 OD rispetto al tempo. Nota: Abbiamo visto che il 10% degli essudati radice non ha influito la crescita di b. mycoides (Vedi Figura 2); Questo rapporto è stato usato per esperimenti di RNA-seq.</li>
	<li>Diluire una cultura b. mycoides pernottamento con 90 mL di pre-riscaldato LB medium per l'iniziale OD600 di ~ 0.05 in un matraccio da 300 mL. Aggiungere 10 mL di essudati radicali alla cultura e incubare a 30 ° C per 1 h.</li>
	<li>Utilizzare un trattamento di 10 mL di acqua deionizzata sterile come un controllo. Raccogliere le cellule dalla coltura mediante centrifugazione a 9.000 x g per 2 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e immediatamente congelare il pellet in azoto liquido, quindi conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
</ol>5. isolamento di RNA
Nota: Prima di iniziare l'isolamento, preparare il banco da lavoro, scaffali e pipette di pulirli con una soluzione di decontaminazione di RNAsi (Vedi Tabella materiali). Indossare guanti in ogni momento e assicurarsi che tutti i tubi, suggerimenti e soluzioni sono RNAsi-libera. Tenere sempre i campioni su ghiaccio quando possibile.
<ol><li>Aggiungere 0,1% (v/v) di pirocarbonato dietilico (DEPC) per acqua ultrapura (100 µ l di DEPC per 100 mL di soluzione), mescolare bene e tenerlo a temperatura ambiente durante la notte. Sterilizzare in autoclave la miscela per inattivare il DEPC dopo trattamento durante la notte. Utilizzare questa acqua ultrapura trattata con DEPC per preparare il buffer di TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] e una soluzione di 10% SDS (w/v).</li>
	<li>Scongelare il pellet cellulare sul ghiaccio e sospendere ciascuno in 400 µ l di tampone di TE (DEPC). Trasferire le sospensioni in provette 2 mL tappo a vite.</li>
	<li>Premix 300 µ l di cloroformio-alcool isoamilico (24:1 v/v) e 300 µ l di fenolo (acido fenolo, grado di RNA) e lasciar riposare per 5 min. Prendere 500 µ l di fase organica superiore per aggiungere a cellule del sedimento. Quindi aggiungere 50 µ l di 10% SDS e 0,5 g di perle di vetro (0,5 µm) nella provetta.</li>
	<li>Chiudere saldamente il tappo e inserire il tubo in un omogeneizzatore del branello-mulino (Vedi Tabella materiali). Eseguire un'omogeneizzazione di impulso di s 3 × 45 con un intervallo di 1 min sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare i campioni per 10 min a 11.000 x g (4 ° C) e trasferire la fase superiore in una nuova provetta.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di cloroformio-alcool isoamilico (24:1) per la fase superiore dal passaggio 5.5 e centrifugare la miscela per 5 min a 11.000 x g (4 ° C). Nota: I passaggi seguenti sono stati modificati da istruzioni del fabbricante, di un isolamento di RNA basati sui filtri di vetro commerciale fibra kit (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Trasferire 500 µ l della fase superiore in una nuova provetta, aggiungere 2 volumi (1 mL) di un buffer di lisi/associazione e mescolare pipettando su e giù.</li>
	<li>Combinare i tubi filtro e raccolta (dal kit di isolamento del RNA) e dispensare la miscela dal punto 5.7 al tubo filtro. Centrifugare le provette per 15 s a 8.000 x g e scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Preparare 1,5 mL microcentrifuga con 100 µ l di tampone di DNasi, 10 µ l di dnasi I e 5 µ l di un inibitore di RNAsi (Vedi Tabella materiali). Aggiungere il mix di soluzione preparata sul filtro del tubo filtro e incubare per 20-30 minuti a 15-25 ° C.</li>
	<li>Eseguire la procedura di lavaggio secondo le istruzioni del fabbricante. Utilizzare 50 µ l di un tampone di eluizione per eluire il RNA.</li>
	<li>Salvare il RNA eluito a-80 ° C e mettere una pellicola di plastica paraffina intorno ad esso. Allo stesso tempo, è possibile trasferire pochi microlitri di campione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per eseguire un controllo di qualità.</li>
</ol>6. sequenziamento e controllo di qualità RNA
<ol><li>Verifica il RNA con uno spettrofotometro di microvolume. Nota: Il rapporto di assorbanza a 260/280 dovrebbe essere sopra 1.8, e rapporti a 260/230 dovrebbero essere sopra almeno 1.8, preferibilmente sopra 2.0.</li>
	<li>Esegui il RNA purificato in uno strumento di elettroforesi automatizzata utilizzando l'analisi del RNA di raccomandare kit (Vedi Tabella materiali); il numero di integrità di RNA (RIN) deve essere almeno superiore a 7 per procedere.</li>
	<li>Utilizzare un importo complessivo di 3 µ g di RNA per campione per generare librerie con una preparazione di RNA-Seq libreria kit (Vedi Tabella materiali) seguendo le raccomandazioni del produttore. Nota: Le preparazioni di libreria sono state sequenziate su una piattaforma di sequenziamento ad alta produttività e fine accoppiato letture sono state generate.</li>
</ol>7. analisi dei dati utilizzando il Web-Based Pipeline T-REx
<ol><li>Eseguire un filtro di qualità usando il FASTX-Toolkit versione 0.0.13 (Phred punteggi di qualità di > 20). Tagliare le letture di RNA-Seq crude delle sequenze di adattatore con lo strumento Trimmomatic. Nota: Tutte le analisi a valle erano basate su dati puliti con alta qualità.</li>
	<li>Scaricare il database di genoma di b. mycoides ATCC 6462 NCBI (adesione NCBI Nr.: CP009692.1) e usarlo come un genoma di riferimento per il mapping la pulito letture utilizzando Bowtie2/2.2.3.</li>
	<li>Uso HTSeq v0.6.1 per contare il numero di letture mappato ogni gene e le letture al kilobase di trascrizione per letture mappate milioni (RPKM) di ciascun gene basato sulla lunghezza del gene e letture conteggio mappato a questo gene.</li>
	<li>Per l'analisi dei dati tramite la pipeline di T-REx, utilizzare la tabella RPKM come input, nonché tre file descrittivi: (i) un fascicolo di fattori per descrivere l'esperimento in fattori, (ii) un fascicolo di contrasti per definire quali fattori saranno confrontati per espressione genica differenziale e (iii) un file di classe per descrivere gruppi di geni di interesse. Nota: I file descrittivi sono formato in. txt. Esempi possono essere trovati sul sito del T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Istruzioni precise per l'analisi dei dati utilizzando il T-REx può essere trovato in una precedente pubblicazione di de Jong et al. 14.</li>
</ol>

<ol><li>Haichar, F. eZ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%3A+Multidisciplinary+Journal+of+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4395/6/1/19">Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation.</a> Agronomy Journal. 6 (1), 19(2016).</li>
<li>Mark, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+bacterial+responses+to+root+exudates+identifies+genes+involved+in+microbe-plant+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).</li>
<li>Fan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiling+of+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+in+response+to+maize+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 116(2012).</li>
<li>Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807170100102X">Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization.</a> Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).</li>
<li>Lambert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clover+root+exudate+produces+male-biased+sex+ratios+and+accelerates+male+metamorphic+timing+in+wood+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs.</a> Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).</li>
<li>Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.4141/CJSS08021">Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa).</a> Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).</li>
<li>Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139396001266">Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability.</a> Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).</li>
<li>Rovira, A. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02859887">Plant root exudates.</a> Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).</li>
<li>Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0885576503904437">Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).</li>
<li>Peng, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s41348-017-0110-z">Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides.</a> Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).</li>
<li>Ambrosini, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/aab.12245/abstract">Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser.</a> Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).</li>
<li>de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REx%3A+transcriptome+analysis+webserver+for+RNA-seq+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data.</a> BMC Genomics. 16 (1), 663(2015).</li>
<li>Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomics+of+Bacillus+mycoides+strains+in+response+to+potato-root+exudates+reveals+different+genetic+adaptation+of+endophytic+and+soil+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1487(2017).</li>
<li>Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNASwift%3A+a+rapid%2C+versatile+RNA+extraction+method+free+from+phenol+and+chloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform.</a> Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).</li>
<li>Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-samtools%3A+Ruby+bindings+for+SAMtools%2C+a+library+for+accessing+BAM+files+containing+high-throughput+sequence+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+for+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments.</a> Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6(2012).</li>
<li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+the+Swiss-army+tool+for+genome+feature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).</li>
<li>Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGS-trex%3A+next+generation+sequencing+transcriptome+profile+explorer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer.</a> BMC Bioinformatics. 14 (7), S10(2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Interazioni piante-microrganismi sono stati supposti per essere determinato da un equilibrio finemente sintonizzato tra batteri e piante. Tali interazioni sono molto complesse e difficili da studiare in un sistema naturale, che comprende diverse specie microbiche, potenzialmente funge da consorzi. Questo articolo descrive un protocollo semplificato per studiare la risposta batterica di essudati in condizioni ben controllate. Il profilo di trascrittoma di rizobatteri, sopra l'esposizione di essudati radicali, fornisce inf...

Piante possono essudato fino al 20% del carbonio fissato durante la fotosintesi attraverso le radici nella rizosfera1, vale a dire, la zona stretta del terreno vicino alle radici. A causa di una maggiore disponibilità dei nutrienti, la rizosfera è un habitat adatto per diversi microrganismi, inclusi batteri promuovere crescita di pianta. Gli essudati contengono una gamma di composti inorganici come ioni, acidi inorganici, ossigeno e acqua. Tuttavia, la maggior parte degli essudati radice è formata da materiali organici, che possono essere suddivisi in composti a basso peso molecolare e ad alto peso molecolare, composti. I composti a basso peso molecolare includono gli aminoacidi, acidi organici, zuccheri, composti fenolici, acidi grassi e una matrice di metaboliti secondari. I composti ad alto peso molecolare costituiti da mucillagini e proteine2,3. Microrganismi della rizosfera possono utilizzare alcuni di questi composti come fonte di energia per la crescita e lo sviluppo. Gli essudati giocano un ruolo importante nel plasmare la comunità di rizobatterica, poiché i composti pianta-prodotta in essudati possono influenzare il comportamento dei batteri associati rizosfera, influenzando l'espressione di specifici geni.
Comprensione della risposta batterica alla essudati è un passo fondamentale nel decifrare i meccanismi di interazione pianta-microbo. Come la risposta batterica alle interazioni piante-microrganismi è il prodotto dell'espressione genica, possono essere studiato mediante analisi del trascrittoma. Utilizzando questo metodo, gli studi precedenti identificati diversi importanti geni coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi. In Pseudomonas aeruginosa, geni coinvolti nel metabolismo, chemiotassi e tipo di secrezione di II sono stati indicati per rispondere a barbabietola da zucchero radice essudati4. Ventilatore et al. 5 ha studiato la profilazione di trascrittomica di b. amyloliquefaciens FZB42 in risposta a mais essudati. I risultati ottenuti mostrano che, dei geni fortemente indotti dagli essudati, diversi gruppi sono coinvolti nelle vie metaboliche relative all'utilizzazione dei nutrienti, chemiotassi, motilità e non-ribosomal sintesi di peptidi antimicrobici e polichetidi.
La precisione di questi studi si basa sulla raccolta di essudati radicali. Anche se diversi metodi sono descritti la raccolta di essudati radicali per scopi diversi, richiedono strumenti sofisticati o non vengono eseguiti in condizioni ben controllate6,7,8. Inoltre, inibendo la rizosfera microrganismi possono influenzare composizione principale dell'essudato che interessano le permeabilità della membrana cellulare di pianta e danneggiare i tessuti della radice, particolarmente nel caso di consorzi di microrganismi9. Quando si esamina la risposta microbica di essudati radicali, è importante utilizzare condizioni ben definite al fine di evitare l'alterazione dei composti da altri microrganismi10. Inoltre, RNA di alta qualità è necessario per RNA-seq basati su studi di trascrittoma. Tuttavia, quando si tratta di ceppi non modello-batteriche, i protocolli standard o kit commerciali di solito hanno una bassa efficienza a causa di fattori sconosciuti o proprietà speciale di crescita.
Il protocollo descritto qui è stato verificato utilizzando b. mycoides, che è un batterio gram-positivo, sporigeni del phylum Firmicute. È onnipresente nella rizosfera di varie specie vegetali. Diverse proprietà di promuovere crescita pianta sono state segnalate per questa specie, tra cui l'induzione di resistenza sistematica (ISR) nella barbabietola da zucchero11, inibizione del attenuante-fuori patogeno Pythium per cetriolo12, così come azoto fissazione del girasole rizosfera13. Tuttavia, i meccanismi molecolari della sua interazione con una pianta ospite non sono ben studiati.
L'obiettivo degli esperimenti presentati qui è quello di studiare la risposta di trascrittomica di endosphere-isolato b. mycoides di essudati di patata. In breve, il protocollo prevede i passaggi seguenti: in primo luogo, raccogliere essudati di patata in condizioni sterili. Quindi, estrarre RNA di alta qualità da cellule batteriche trattate con essudati. Il passo finale è l'analisi dei dati utilizzando il web-based T-REx pipeline14. Questo protocollo è stato usato per identificare i geni di b. mycoides che mostrano un cambiamento nei livelli di espressione al contatto con essudati radicali- e quindi potrebbero giocare un ruolo importante nelle interazioni piante-microrganismi.

<table><tbody><tr><td>ipoclorito di sodio</td><td>Sigma</td><td> CAS: 7681-52-9&nbsp;</td><td>10-15%&nbsp; di cloro attivo</td></tr><tr><td>Incubatore di brodo</td><td></td><td></td><td></td>Luria-Bertani (LB)</tr><tr><td></td><td>Spettrofotometro New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific Genesys</td><td>20</td><td></td></tr> perle <tr><td>di vetro di azoto</td><td></td><td></td><td></td>liquido</tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0.5 &; m</td></tr><tr><td>Provetta da 2,0 ml con tappo</td><td></td><td></td> a vite <td>Senza RNasi</td></tr><tr><td>1,5 ml e provetta</td><td></td><td></td> Eppendorf da 2,0 ml <td>Senza RNasi</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore per mulino di perline</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td>Centrifuga Mini_beadbeater</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato di dietil (DEPC)</td><td>sigma</td><td>CAS: 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>sigma</td><td>CAS: 151-21-3&nbsp;</td><td>Soluzione al 10% preparata con acqua MQ trattata con DEPC</td></tr><tr><td>tampone</td><td></td><td></td> TE <td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td></tr><tr><td>fenolo</td><td>Sigma</td><td>RNA grado</td>cloroformio-alcol isoamilico di grado Sigma<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>preparare 24:1 di cloroformio:alcol isoamilico, conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di decontaminazione con RNasi</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNase-Zap</td></tr><tr><td>Strumento automatizzato per elettroforesi Bioanalizzatore</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro per microvolumi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td>Kit di analisi della qualità <td>dell'RNA Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kit Agilent</td><td>RNA 6000 Nano.</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RiboLock</td><td></td></tr><tr><td>Kit di preparazione della libreria di RNA direzionale</td><td>NEB</td><td>Ultra</td><td>per Illumina</td></tr></tbody></table>

interazioni piante-microrganismi: risposta trascrizionale di bacillus mycoides di essudati di patate

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Batteri benefici associati pianta giocano un ruolo importante nel promuovere la crescita e prevenire la malattia in piante. L'applicazione della pianta dipromozione rhizobacteria (PGPR) come agenti di biocontrollo e concime biologico è diventato una valida alternativa all'uso di fertilizzanti convenzionali e può aumentare la produttività delle colture a basso costo. Interazioni piante-microrganismi dipendono da segnali di pianta-secreto di host e una reazione hereon dai loro batteri associati. Tuttavia, i meccanismi molecolari di batteri benefici come rispondono a loro associati pianta-derivati segnali completamente non sono capiti. Valutazione della risposta di trascrittomica di batteri di essudati radicali è un approccio potente per determinare l'espressione di gene batterico e regolamento alle condizioni rizosferici. Tale conoscenza è necessaria comprendere i meccanismi coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per studiare la risposta di trascrittomica di b. mycoides EC18, uno sforzo isolato dalla endosphere di patata, di essudati di patata. Con l'aiuto di recente tecnologia di sequenziamento ad alta velocità, questo protocollo può essere eseguito in diverse settimane e produrre grandi set di dati. In primo luogo, che raccogliamo gli essudati in condizioni sterili, dopo di che vengono aggiunti al b. mycoides culture. il RNA da queste culture è isolato usando un metodo di fenolo/cloroformio, combinato con un kit commerciale e sottoposti a controllo di qualità di uno strumento automatizzato di elettroforesi. Dopo l'ordinamento, l'analisi dei dati viene eseguita con la pipeline di T-REx basata sul web e viene identificato un gruppo di geni differenzialmente espressi. Questo metodo è uno strumento utile per facilitare nuove scoperte sui geni batterici coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi.

Pianta-collegato microrganismi possono influenzare positivamente la crescita delle piante e la salute. Tuttavia, i meccanismi delle complesse interazioni tra piante e loro simbionti microbici non sono completamente capiti. Essudati giocano un ruolo importante nella regolazione del comportamento e dell'attività rizobatterica, e generalmente è postulato che la colonizzazione microbica delle radici si avvia con l'attrazione di microbi di essudati radicali. Lo scopo di questo lavoro era di st...

L'obiettivo del protocollo presentato qui è quello di studiare la risposta di trascrittomica di endosphere-isolato Bacillus mycoides di essudati di patata. Questo metodo facilita l'identificazione di importanti geni batterici coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi ed è in linea di principio applicabile ad altri endofiti e piante, con piccoli aggiustamenti.

Interazioni piante-microrganismi: Risposta trascrizionale di Bacillus Mycoides di essudati di patate

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione pianta-microbi. È possibile, ad esempio, identificare geni importanti da ceppi batterici che sono stati isolati dall'endosfera o dalla rizosfera durante l'interazione dei batteri con la pianta. È un metodo versatile che può essere utilizzato anche per studi su altri batteri con piante.Il vantaggio principale di questa tecnica è che in un periodo relativamente breve è possibile identificare un gran numero di geni batterici che sono importanti durante le interazioni pianta-microbi. Per iniziare questa procedura, sciacquare la superficie della patata con acqua sterile. Bagnare la patata in etanolo al 70% per cinque minuti e poi in ipoclorito di sodio al 3% per altri cinque minuti.Successivamente, sciacquarlo nuovamente con acqua sterile per rimuovere eventuali residui di ipoclorito di sodio. Successivamente, prepara i materiali necessari per la germinazione e la coltivazione dei tuberi di patata. Sterilizzare i vasi di plastica, i cestini per l'attecchimento, la vermiculite e l'acqua in autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti.Successivamente, mettere la patata sterilizzata in superficie nel cestello

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Fonte: Yi, Y., et al. Interazione pianta-microbi: risposta trascrizionale di Bacillus mycoides agli essudati delle radici di patata. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra la preparazione e il trattamento delle colture di Bacillus mycoides per studiare le interazioni pianta-microbi. Delinea i passaggi dalla striatura di una coltura stock e dall'incubazione in mezzo liquido all'esposizione dei batteri agli essudati delle radici delle piante sotto agitazione. Il processo culmina nella raccolta e...

Trattamento dei batteri con essudati radicali delle piante per emulare le interazioni pianta-microbi in vitro

L'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono test funzionali di routine per l'espressione ectopica transitoria dei geni nelle piante. Questi metodi sono test efficienti nelle strategie di effettioromica (rapida resistenza e scoperta del gene dell'avirulenza) e cruciali per la moderna ricerca nella patologia vegetale molecolare. Soddisfano la domanda di solide analisi funzionali ad alta produttività negli impianti.

Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

Il sistema di cocultivazione idroponico descritto supporta piante intatte con schermi a maglie metalliche e cocultivala con batteri. I tessuti vegetali, i batteri e le molecole secrete possono quindi essere raccolte separatamente per analisi a valle, consentendo contemporaneamente le risposte molecolari di entrambi gli host vegetali e dei microbi o dei microbiomi interattivi.

Un sistema di co-coltivazione idroponica per l&#39;analisi simultanea e sistematica delle interazioni molecolari e della segnalazione delle piante / microbe

Qui, presentiamo due protocolli per trasformare piante di patate. La trasformazione di Agrobacterium tumefaciens conduce ad una pianta transgenica completa mentre l' Agrobacterium rhizogenes produce radici transgeniche pelosi in un tiro di tipo selvatico che può essere auto-propagato. Individuiamo quindi l'attività del promotore di GUS colorazione nelle radici trasformate.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-mediata trasformazione di patate e l'attività del promotore di un Gene di suberina da GUS Staining

Il metodo presentato crea tessuto vegetale naturale danneggiato erbivoro attraverso l'applicazione di larve di sexta Manduca a foglie staccate di patate. Il tessuto vegetale è stato analisi per l'espressione di sei omologhi del fattore di trascrizione coinvolti nelle prime risposte all'erbivoro degli insetti.

Secondo i saggi foglia distaccati per semplificare gli studi sull'espressione genica nelle patate durante l'infestazione da mawing Insect Manduca sexta

Presentiamo un protocollo dettagliato per il sistema di silenziamento dei microRNA (VbMS) basato sul virus della patata X (PVX) per caratterizzare funzionalmente i microRNA endogeni (miRNA) nella patata. Le molecole mimiche bersaglio (TM) di miRNA di interesse sono integrate nel vettore PVX ed espresse transitoriamente in patata per silenziare il miRNA bersaglio o la famiglia di miRNA.

Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.

Questo protocollo presenta un riepilogo dettagliato delle strategie per inoculare le radici delle piante con microbi trasmessi dal suolo. Esemplificato per i funghi Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, vengono descritti tre diversi sistemi di infezione delle radici. Vengono evidenziate le potenziali applicazioni e le possibili analisi a valle e vengono discussi vantaggi o svantaggi per ciascun sistema.

Strategie di inoculazione per infettare le radici delle piante con microrganismi trasmessi dal suolo

A causa dell'opacità del suolo, le interazioni tra i suoi microbi costituenti non possono essere facilmente visualizzate con risoluzione cellulare. Qui vengono presentati due strumenti microfluidici, che offrono nuove opportunità per studiare le interazioni fungo-microbiche. I dispositivi sono versatili e semplici da usare, consentendo un elevato controllo spaziotemporale e immagini ad alta risoluzione a livello cellulare.

Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare

Presentiamo un protocollo per un sistema sperimentale semiidroponico a base di vetro che supporta la crescita di una varietà di piante filogeneticamente distinte con o senza microbi. Il sistema è compatibile con diversi mezzi di crescita e consente il campionamento non distruttivo dell'essudato radicale per l'analisi a valle.

Un sistema versatile di barattoli di vetro per la profilatura semiidroponica dell'essudato radicale

Il protocollo descrive l'infezione delle radici di Solanum tuberosum con nematodi parassiti delle piante in condizioni di serra in vivo e radici transgeniche in vitro di patate per l'analisi istochimica della struttura radicale attraverso la microscopia ottica.

Infezione in vivo e in vitro delle radici della patata con nematodi parassiti delle piante per la valutazione dei cambiamenti strutturali indotti

Scopri l'analisi trascrizionale di Bacillus mycoides esposto agli essudati radicali di patata. Questo metodo identifica geni batterici chiave nelle interazioni pianta-microrganismo per applicazioni agricole.

Interazioni piante-microrganismi: Risposta trascrizionale di Bacillus Mycoides di essudati di patate

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