Interazioni piante-microrganismi: Risposta trascrizionale di Bacillus Mycoides di essudati di patate

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione pianta-microbi. È possibile, ad esempio, identificare geni importanti da ceppi batterici che sono stati isolati dall'endosfera o dalla rizosfera durante l'interazione dei batteri con la pianta. È un metodo versatile che può essere utilizzato anche per studi su altri batteri con piante.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che in un periodo relativamente breve è possibile identificare un gran numero di geni batterici che sono importanti durante le interazioni pianta-microbi. Per iniziare questa procedura, sciacquare la superficie della patata con acqua sterile. Bagnare la patata in etanolo al 70% per cinque minuti e poi in ipoclorito di sodio al 3% per altri cinque minuti.

Successivamente, sciacquarlo nuovamente con acqua sterile per rimuovere eventuali residui di ipoclorito di sodio. Successivamente, prepara i materiali necessari per la germinazione e la coltivazione dei tuberi di patata. Sterilizzare i vasi di plastica, i cestini per l'attecchimento, la vermiculite e l'acqua in autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti.

Successivamente, mettere la patata sterilizzata in superficie nel cestello per l'attecchimento e metterla in un vaso autoclavato contenente vermiculite umida. Usa una grande scatola in fibra di vetro per coprire il vaso per evitare contaminazioni microbiche. Tenete il vaso in una camera climatica a 24 gradi Celsius per tre settimane, e impostatelo su cicli di 16 ore di luce e 8 ore di buio.

Per raccogliere gli essudati delle radici di patata, quando i germogli germogliano, trasferisci il cestello con la patata intera in un becher sterilizzato riempito con 150 millilitri di acqua deionizzata autoclavata con i tuberi di patata posti appena sopra la superficie dell'acqua e le radici immerse nell'acqua. Conserva la piantina nella camera climatica e usa le stesse impostazioni di prima. Dal secondo giorno in poi, raccogliere l'acqua contenente gli essudati e riempire il becher con acqua sterile e deionizzata.

Quindi conservare ogni campione separatamente a quattro gradi Celsius. Per ogni campione, distribuire 100 microlitri su una piastra di agar Luria-Bertani per verificare la presenza di contaminazioni microbiche. Eliminare i campioni contaminati.

Combina i campioni raccolti di una piantina. Quindi trasferire gli essudati di radice combinati in tubi da 50 millilitri. Congelare i tubi contenenti essudati radicali a meno 80 gradi Celsius.

Concentrarli liofilizzandoli a meno 40 gradi Celsius fino a un volume finale di 150 millilitri. Per far crescere i batteri, striare un ceppo di B. mycoides da una scorta di glicerolo a meno 80 gradi Celsius su una piastra di agar LB e incubare la piastra a 30 gradi Celsius durante la notte. Quindi inoculare il terreno liquido LB con una singola colonia dalla piastra e far crescere la coltura in un incubatore agitatore a 200 giri/min durante la notte a 30 gradi Celsius.

Per trattare e campionare i batteri, diluire una coltura di B.mycoides durante la notte con 90 millilitri di terreno LB preriscaldato fino all'OD600 iniziale di zero virgola zero cinque in un pallone da 300 millilitri. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di essudati radicali alla coltura e utilizzare un trattamento con acqua sterile e deionizzata da 10 millilitri come controllo. Quindi incubarli a 30 gradi Celsius per un'ora.

Dopo un'ora, trasferire la coltura in provette da centrifuga da 50 millilitri. Raccogliere le cellule dalla coltura mediante centrifugazione a 9.000 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, scartare il supernatente e congelare immediatamente il pellet in azoto liquido.

Quindi conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per isolare l'RNA, scongelare i pellet cellulari sul ghiaccio e sospendere ciascuno di essi in 400 microlitri di tampone TE. Quindi trasferire le sospensioni nei tubi con tappo a vite da due millilitri.

Aggiungi zero virgola cinque grammi di perle di vetro nel tubo. Quindi chiudere bene i tappi e posizionare i tubi in un omogeneizzatore per macina perline. Eseguire un'omogeneizzazione degli impulsi di 45 secondi tre volte, con un intervallo di un minuto sul ghiaccio.

Successivamente, centrifugare i campioni per 10 minuti a 11.000 volte G e trasferire la fase superiore di ciascun campione in una nuova provetta. Aggiungere 500 microlitri di cloroformio: alcol isoamilico alla fase superiore e centrifugare la miscela per cinque minuti a 11.000 volte G.Quindi trasferire 500 microlitri della fase superiore in una provetta fresca. Aggiungere un millilitro di tampone legante la lisi e mescolarlo pipettandolo su e giù.

Quindi, preparare provette da microcentrifuga da cinque millilitri con 100 microlitri di tampone DNasi, 10 microlitri di DNasi I e cinque microlitri di un inibitore della RNasi. Aggiungere la miscela di soluzione preparata sul filtro dei tubi del filtro e incubarli per 20-30 minuti a 15-25 gradi Celsius. Successivamente, eseguire le fasi di lavaggio secondo le istruzioni del produttore e aggiungere 50 microlitri di tampone di elusione al tubo.

Dopo la centrifugazione, eluire l'RNA. Trasferire alcuni microlitri del campione in una provetta da microcentrifuga da cinque millilitri per eseguire un controllo di qualità. Infine, copri l'RNA eluso con una pellicola di paraffina di plastica e mantienilo a meno 80 gradi Celsius.

Dopo la raccolta, gli essudati radicali sono stati aggiunti alla coltura di B. mycoides con un rapporto del 10% e l'RNA totale batterico è stato isolato. L'RNA è stato quindi sottoposto a un controllo di qualità da parte di uno strumento di elettroforesi automatizzato. Questi grafici rappresentano l'RNA isolato da B.mycoides trattato con gli essudati radicali e questi grafici rappresentano l'RNA isolato dal gruppo di controllo.

Tutti i campioni hanno ottenuto un valore RIN superiore a nove, con due bande chiare corrispondenti alle subunità di RNA 16S e 23S, dimostrando che l'RNA di alta qualità è stato ottenuto con questo protocollo. Dopo la preparazione della libreria, le letture dell'estremità della coppia sono state ottenute con una piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento. Le letture grezze dell'RNA-seq sono state tagliate dalle sequenze dell'adattatore e mappate rispetto alla sequenza del genoma di riferimento.

L'analisi domiciliare del trascritto è stata eseguita con la pipeline T-REx e qui è mostrato il grafico dell'intensità del rapporto di tutti i geni differenzialmente espressi. Dopo che il gene potenzialmente importante è stato identificato, è possibile eseguire altri metodi in vivo come la fusione GFP del promotore, cue-pews-air e l'ibridazione fluorescente in situ per rispondere a ulteriori domande come il tempo di espressione riservata di alcuni geni durante l'interazione con la pianta ospite.