Name: Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Impara a produrre topi transgenici con elevata efficienza utilizzando vettori lentivirali e iniezione nello spazio perivitellino. Questo metodo semplice consente screening rapido in vivo per studi di funzione genica.

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Ringraziamo Magali Dumont e Rolando Meloni per lettura critica del manoscritto e la iVector e Phenoparc ICM core per l'assistenza tecnica nella produzione del vettore lentivirale e animale alloggiamento rispettivamente. Questo lavoro è stato supportato dal Translationnelles Institut Hospitalo-Universitaire de neuroscienze de Parigi, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. ha ricevuto finanziamenti per l'associazione de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) e un comune JDRF / INSERM grant.

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<li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+mice+carrying+human+cytokine+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li>
<li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li>
<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse%2C+rat%2C+rabbit%2C+and+pig+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li>
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<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
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<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
<li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).</li>
<li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741(2010).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
<li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD%2Fscid+background%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li>
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<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+generation+of+high-titer%2C+pantropic+retroviral+vectors%3A+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li>
<li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li>
<li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li>
<li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413(2010).</li>
<li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV%29+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+%28i-PITT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274(2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li>
<li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li>
<li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li>
<li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

L'iniezione di perivitellino di vettori lentivirali in ovociti fecondati qui descritti ha provocato la produzione di embrioni transgenici che ha reso più del 70% degli embrioni transgenici rispetto al numero totale di embrioni raccolti. Questo risultato è coerenza con i rapporti precedenti ed esemplifica la specificità della procedura2,7,10,11,12. Quando si co...

Il lavoro pionieristico di Gordon et nel 1980 hanno mostrato che dopo l'impianto in pseudopregnant topi, l'iniezione di DNA del plasmide nel maschio pronuclei di ovociti fecondati può produrre la produzione di animali transgenici che integrano la plasmide DNA1. La dimostrazione che possono essere generati mammiferi transgenici ha avuto un enorme impatto sulle scienze della vita globale, aprendo la strada a nuovi campi di ricerca sia per le scienze di base e traslazionale scienze biomediche. Negli ultimi quattro decenni, microiniezione di DNA è diventata una pratica di routine. Anche se è stati prodotti un numero enorme di topi transgenici, il metodo standard non è pienamente utilizzabile per tutti i ceppi di topi e richiede molto tempo reincroci2,3. Sua applicazione ad altre specie rimane impegnativo4 e il rendimento generale di integrazione del transgene è limitato a qualche percentuale di animali nati5. Inoltre, l'efficacia dell'integrazione del transgene rappresenta il fattore limitante che spiega la scarsa resa dei pronuclei iniezione di DNA. A questo proposito, vettori virali integranti sono gli strumenti più efficienti per carico e integrano transgeni e così potrebbero fornire nuovi mezzi per aumentare significativamente la resa di integrazione, l'unica limitazione è che la dimensione del transgene che non può superare i 10 kb6 .
Vettori lentivirali pseudo-tipizzati con la proteina di busta del Virus della stomatite vescicolare (VSV) sono strumenti di trasferimento del gene PANTROPICO e altamente integrativa e possono essere utilizzati per trasdurre ovociti fecondati7. La zona pellucida che circonda gli ovociti è una barriera naturale virus e deve essere passato per consentire di trasduzione con i vettori lentivirali. Gli animali transgenici sono stati generati da transducing ovociti fecondati dopo micro-foratura o la rimozione della zona pellucida8,9. Tuttavia, iniezione sotto la zona pellucida nello spazio perivitellino sembra essere il metodo più semplice di trasdurre le uova fecondate come inizialmente descritto da Lois e colleghi7.
L'iniezione di perivitellino di vettori lentivirali permette rendimenti elevati nella produzione di animali transgenici che sono sopra il 70% degli animali nati. Tale rendimento è oltre 10 volte superiore rispetto al rendimento migliore che può essere raggiunto utilizzando standard pronuclei DNA iniezione7,10,11. In questo contesto, una singola sessione di iniezioni genererà almeno 50 transgenici fondatori (F0). Il gran numero di fondatori è, pertanto, compatibile con fenotipizzazione del transgene effetto possono essere effettuata direttamente su F0 topi senza la necessità di generare linee di topi transgenici. Questo vantaggio permette per screening rapido dell'effetto del transgene ed è stato adattato da eseguire in vivo guadagno e la perdita della funzione studia in settimane. Inoltre, elementi regolatori del DNA possono anche essere rapidamente schermati per mappa esaltatori e DNA motivi vincolati dalla trascrizione fattori11,12. Con iniezioni di pronuclei, transgeni integrano solitamente come più copie di un unico locus. Con vettori lentivirali, integrazione si verifica in luoghi multipli come una singola copia per locus10,13. Pertanto, la molteplicità di loci integrati è probabilmente associati alla penetranza di altissima espressione osservata nei fondatori transgenici, che rende più robusto il nuovo modello generato.
Cosa importante, quando si utilizza pronuclei iniezione del DNA, visualizzazione dei pronuclei durante la procedura è assolutamente necessaria. Questa limitazione tecnica impedisce l'utilizzo di ovociti fecondati provenienti da una grande varietà di ceppi di topi. Di conseguenza, la produzione di un modello transgenico in uno specifico ceppo per cui pronuclei sono invisibili richiede la produzione di animali in un ceppo permissivo seguita da almeno 10 successive reincroci per trasferire il transgene nel topo desiderata ceppo. Con le iniezioni di vettore lentivirale, spazio perivitellino è sempre visibile e l'iniezione non richiede competenze altamente specifiche. Ad esempio, topi transgenici NOD/SCID che non sono appropriati per l'iniezione di pronuclei sono stati ottenuti con il vettore virale iniezioni14.
Qui, un protocollo completo viene visualizzato per consentire la semplice produzione di topi transgenici con iniezioni di vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un embrione di fase di una cella. Controllata sia con l'espressione del transgene onnipresente o promotori specifici delle cellule è descritto in dettaglio.
La spina dorsale di vettori lentivirali di ΔU3 pTrip è stata utilizzata in questo studio15. Questo vettore permette per la produzione di vettori lentivirali difettoso di replica in cui la sequenza di U3 è stato parzialmente eliminata per rimuovere l'attività del promotore U3 e generare un self-inattivazione di vettore (SIN)16. Scorte di vettore lentivirale sono state prodotte da transitori di transfezione delle cellule HEK 293T con il p8.91 incapsulamento plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G codifica la stomatite vescicolare (VSV) virus glicoproteina-G17e il ΔU3 di pTRIP vettore ricombinante. La procedura dettagliata di produzione viene fornita come metodi supplementari.
Produzione delle scorte di vettore lentivirale alto titolo viene eseguita in condizioni di biosicurezza livello II (BSL-2). Questo è vero per la maggior parte dei transgeni ad eccezione di oncogeni che devono essere prodotti in BSL-3. Di conseguenza, la produzione in condizioni di BSL-2 per la maggior parte dei casi è sufficiente. Inoltre, l'uso e la produzione sono solitamente disconnesso per la maggior parte delle agenzie di regolamentazione nazionale, a che fare con organismi geneticamente modificati (OGM). Quantità limitate di vettori lentivirali di peccato incompetenti di replica (sotto 2 µ g di proteina del capside p24) può essere utilizzato in condizioni di BSL-1 come descritto dall'Agenzia francese OGM in accordo con le raccomandazioni dell'Unione europea.

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 100 mm</td><td>Dutsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 pozzetti Piastra Nunc</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>Piastra IVF</td></tr><tr><td>M2 media</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 media</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filtro per siringa</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>Enzima ialuronidasi 30mg</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>embrione di topo testato</td></tr><tr><td>Insulina serynge</td><td>VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>Pinza curva</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Forbici curve</td><td>Moria</td><td>MC26</td><td></td></tr><tr><td>Gruppi di tubi aspiratore per pipette microcapillari calibrate</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>GC 100-10</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette orizzontale</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>Hoffman è richiesta</td></tr> <tr><td>l'illuminazione a contrasto a modulazioneMicromanipolatore</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram aria</td><td></td></tr><tr><td>Controllore di tenuta pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>embrione di topo testato</td></tr><tr><td>Microiniettore</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>Può essere utilizzato per iniettare DNA o vettori virali Dumont</td></tr><tr><td># 5 pinze</td><td>Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>vannas micro forbici</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>centravet</td><td>ISO005</td><td>ISO-VET 100% 250ml</td></tr><tr><td>ocrygel</td><td>centravet</td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>Povidone iodure</td><td>centravet</td><td>VET001</td><td>vetedine 120ml</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>centravet</td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Trizma cloridrato</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>proteinasi in polvere</td></tr><tr><td>K</td><td>Sigma</td><td>P2308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>kit oneTaq</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Striscia di 8 provette PCR</td><td>4titude</td><td>4ti-0781</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore a 96 pozzetti</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Veriti</td></tr><tr><td>Genomic DNA mini kit</td><td>invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Master mix</td><td>Roche</td><td>4887352001</td><td>SYBR Green&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra multipozzetto 384</td><td>Roche</td><td>5217555001</td><td></td></tr><tr><td>strumento qPCR 384 pozzetti</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Per quasi 40 anni, pronuclei iniezione di DNA rappresenta il metodo standard per generare topi transgenici con integrazione casuale dei transgeni. Una procedura di routine è largamente utilizzata in tutto il mondo e il suo limite principale risiede nella scarsa efficacia di integrazione del transgene, risultante in una bassa resa di animali fondatore. Solo qualche punto percentuale di animali nati dopo l'impianto di iniezione ovociti fecondati hanno integrato il transgene. Al contrario, vettori lentivirali sono potenti strumenti per il trasferimento genico integrativa e il loro utilizzo di trasdurre ovociti fecondati permette una produzione altamente efficiente del fondatore topi transgenici con un rendimento medio superiore al 70%. Inoltre, tutto lo sforzo del mouse può essere utilizzato per la produzione di animali transgenici e la penetranza di espressione del transgene è estremamente elevata, superiore all'80% con vettori lentivirali transgenesi mediata rispetto alla microiniezione di DNA. La dimensione del frammento del DNA che può essere carico di vettore lentivirale è limitata a 10 kb e rappresenta la maggiore limitazione di questo metodo. Utilizzando un semplice e facile da eseguire la procedura di iniezione sotto la zona pellucida degli ovociti fecondati, più di 50 animali fondatore possono essere prodotto in una singola sessione di microiniezione. Tale metodo è altamente adattato per eseguire, direttamente in animali fondatore, rapido guadagno e la perdita di studi di funzione o di regioni di DNA genomiche di schermo per la loro capacità di controllare e regolare espressione genica in vivo.

Gli animali transgenici sono stati generati utilizzando il protocollo presentato qui. Rappresentante risultati sia onnipresente ed espressione del transgene specifico tipo cella sono illustrati.
Espressione costitutiva di transgeni
Onnipresenti promotori sono strumenti di ricerca di base per esprimere transgeni in maniera duratura ed efficiente. Tali p...

Qui, presentiamo un protocollo per promuovere l'integrazione del transgene e produzione di topi transgenici fondatore con alta efficacia mediante una semplice iniezione di un vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un ovocita fecondato.

Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Questo metodo consente un rapido screening in vivo nei topi, dell'effetto di un transgene, ed è specificamente adattato per eseguire studi di guadagno o perdita di funzione, nonché una risposta e una mappatura del movente del DNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'uso pronostico di animali transgenici è superiore al 70% del neonato e può essere applicato a qualsiasi ceppi di topi, compresi gli animali transgenici. Dopo aver eutanasiato i topi, raccogliere gli ovidotti.Per iniziare l'intervento chirurgico, utilizzare le forbici per fare una grande incisione orizzontale nella cavità addominale. Quindi, individuare l'ovidotto tra l'utero e l'ovaio. Successivamente, utilizzare le forcep curve per rimuovere il mesometrio e la membrana con i vasi sanguigni prominenti.Quindi, separare l'ovidotto dall'ovaio e sezionare l'ovidotto dall'ovaio. Quindi, tirare sull'ovidotto e tagliare lontano dall'utero. Trasferire tutti gli ovidotti raccolti su mezzo M2 a temperatura ambiente.Quando si maneggiano gli ovidotti, fare attenzione a evitare di toccare l'ampulla gonfia carica di uova fecondate. Quindi, aggiungere una goccia di 100 microliter di soluzione di lavoro di ialuronidasi a un piatto di 10 centimetri. Quindi trasferire i due ovidotti in esso, per rimuovere le cellule cumuli dalle uova.Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare un paio di siringhe per insulina per fissare l'ovidotto mentre si strappa l'ampulla e si disperdono le uova fecondate. Quindi, utilizzare una pipetta di vetro preparata con tubi e un bocchino per aspirare tutte le uova. Utilizzando questo strumento, trasferirli tra sei gocce di mezzo M2 per lavare via le cellule cumuli circostanti.Quindi, trasferire le uova lavate in un pozzo di 10 millimetri, in un piatto di quattro po ', riempito con preriscaldato con M16. Quindi, trasferire il piatto in un'incubatrice umidificata di 37 gradi Celsius. In preparazione, centrifugare la sospensione vettoriale lentivirale preparata a 160 g per due minuti, per pellettare i detriti spesso presenti in stock lentivirale.In un armadio di sicurezza di classe due, trasferire i supernatanti in un nuovo tubo da 0,5 millilitri. Quindi, caricare un microlitro di supernatante, in una pipetta di iniezione. Quindi, attaccare la pipetta di iniezione al micromanipulato lato destro.E attaccare la pipetta di tenuta al micromanipolatore laterale sinistro. Ora, erogare otto microlitri di mezzo M2 al centro dello scivolo depressionario. E coprire con olio di parafina leggera per evitare l'evaporazione.Quindi, posiziona 20 uova nelle posizioni poco profonde nella goccia senza creare bolle. Assicurarsi quindi che la punta della pipetta di iniezione sia aperta. In caso meno, toccare la pipetta di iniezione con la pipetta di tenuta per aprirla.Quindi, impostare il microiniettore per iniezioni di 20 secondi. Ora, usando la pipetta di tenuta e la pressione manuale aspirare un uovo fecondato che contiene due pronuclei e due corpi polari. Quindi, utilizzando la pipetta di iniezione iniettare lo spazio perivitellino dell'uovo.Non toccare la membrana plasmatica. Regolare la pressione in modo che lo spazio perivitellino sia riempito con la soluzione. La pressione non deve superare i 600 etto pascal.Immediatamente dopo aver iniettato le 20 uova, trasferire il lotto in un bagno di mezzo M16 preriscaldato. E incubarli per almeno 30 minuti prima di impiantarli. 16 ore dopo aver accoppiato femmine normali a maschi con vasectomie, verificare la presenza di spine di copulazione.Usa queste femmine per l'impianto. Successivamente, realizzare pipette di impianto con diametro interno di circa 150 micron. E con punte lucidate a fiamma lunghe dai quattro ai cinque millimetri.Caricare una pipetta con olio di parafine leggero testato e testato in embrione appena sopra il punto della spalla. Quindi, aspirare una piccola bolla d'aria e caricare ulteriormente la pipetta con mezzo M2. Quindi, aspira una seconda bolla d'aria.Ora, disegna gli embrioni nella pipetta uno dietro l'altro, riducendo al minimo il volume di mezzo tra gli embrioni. Finire, aspirando una piccola goccia di olio di parafina larga solo un embrione. La preparazione della pipetta di reimpianto è fondamentale e richiede molta pratica.Le uova nella pipetta devono essere allineate praticamente senza mezzo tra di loro. Successivamente, dopo aver anestetizzato il topo e confermato l'anestesia con un dito del piedi pizzicare Radersi da due strisce di capelli di due, due centimetri lungo il midollo spinale a livello dell'ultima costola. Ora, posizionare il mouse su un tappetino riscaldante su un campo sterile e drappeggiarlo, lasciando una finestra sulla pelle esposta.Quindi, sanificare la pelle esposta con scrub alternati di iodoprovidone e 70% di etanolo. Per l'impianto, prima fare un'incisione trasversale di un centimetro, quindi far scorrere la pelle lateralmente fino a quando l'ovaio di colore arancione è visibile attraverso la parete del corpo. Quindi, fai un'incisione di cinque millimetri con le forbici fini e raccogli il cuscinetto grasso con un morsetto bulldog atraumatico.Una volta afferrato il tampone, estrarre l'ovaio, l'ovidotto e la parte superiore dell'utero. Successivamente, individuare l'ampolla e fare un'emisezione con forbice di vannas, sul segmento dell'ovidotto che collega l'ovaio all'ampolla. Quindi, introdurre la pipetta dell'embrione di trasferimento ed espellere le uova.Fermarsi alla prima bolla d'aria dopo che le uova sono state rilasciate. Avere i materiali richiesti pronti a ripetere la procedura sul secondo ovidotto. E una volta completato, chiudi la pelle con clip ferita.Immediatamente dopo aver chiuso la pelle, iniettare per via intraperitoneaica e posizionare l'animale nella camera di recupero con un elemento riscaldante a 39 gradi Celsius. Monitorare fino a quando non è completamente sveglio. Gli animali transgenici sono stati generati utilizzando il metodo presentato.Un alto vettore lentivirale titer sono stati prodotti utilizzando un potenziatore di base da 2,3 chili per Neurogenin-3 per guidare l'eGFP. O come controllo, un frammento del cromosoma sei per guidare l'eGFP. L'integrazione negli embrioni ha avuto abbastanza successo.Dagli embrioni, il germoglio pancreatico è stato sessato e immunosocitato per cercare l'espressione localizzata di eGFP. Oltre il 90% dei vettori, con l'esaltatore Neurogenin-3, ha espresso eGFP nelle cellule che esprimono Neurog3. Tuttavia, nessuno dei vettori di controllo integrati ha espresso eGFP nella gemma pancreatica.I siti di integrazione transgene sono stati valutati mediante PCR quantitativa, utilizzando il gene CDX2 come controllo. Il numero medio di siti di integrazione era di circa 20 utilizzando il costrutto Neurogenin-3, o 10 usando il costrutto di controllo. Curiosamente, il titer di trasduzione virale usato per il costrutto Neurogenin-3, era circa il doppio del vettore di controllo.Suggerire una relazione tra il titer di trasduzione e il numero di integrazioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare un gran numero di embrioni transgenici fondatori utilizzando l'iniezione di perivitellina di vettori lentivirali ad alta efficacia. Una volta padroneggiata, questa tecnica può produrre fino a 50 animali fondatori entro un solo giorno dalla microiniezione, se eseguita correttamente.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'iniezione di DNA pronucleare del titer, al fine di stabilire linee di topo transgeniche. Non dimenticare che lavorare con vettori lentivirali è soggetto all'autorizzazione del tuo comitato OGM locale. Questi vettori possono essere estremamente pericolosi e la precauzione dovrebbe sempre essere presa durante l'esecuzione di questa procedura.

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