Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire l'accesso agli occhi embrionali di pollo in un contesto in vitro per consentire uno studio approfondito dei complessi percorsi di sviluppo nell'embrione. Nel pollo embrionale, lo studio dell'occhio è spesso difficile, a causa dello sviluppo delle palpebre, del movimento dell'embrione e della crescita di tessuti extra embrionali. Composti come farmaci e inibitori possono anche avere effetti letali sull'embrione, rendendo difficile l'uso di questi composti per modulare i percorsi genici.

I progressi nella coltura dei tessuti in vitro hanno permesso agli scienziati di isolare questi tessuti ed eliminare molte di queste barriere. Il nostro protocollo è vantaggioso in quanto ci permette di studiare l'occhio nel suo insieme, compresi tutti i tessuti che hanno il potenziale di interagire durante lo sviluppo, come la retina neurale e l'epitelio pigmentato retinico. Inizia con l'autoclavaggio dei materiali per assicurarti che tutte le soluzioni e le attrezzature siano sterili prima della procedura.

Per fare ciò, sterilizzare in autoclave due litri di acqua distillata e un litro di soluzione fisiologica per pulcini, insieme a una scatola di fazzoletti, carta da filtro semiporosa, rete metallica, contenitori per l'acqua e pipette di vetro usa e getta. Sterilizzare accuratamente i ripiani e la porta dell'incubatrice utilizzando etanolo al 70%, quindi riempire i contenitori con acqua distillata in autoclave e preriscaldare l'incubatrice a 37 gradi Celsius. Preriscaldare il mezzo nutritivo, insieme a un tubo dell'antibiotico penicillina streptomicina nell'incubatrice.

Stendere un tovagliolo di carta sullo spazio di lavoro e sterilizzare con etanolo al 70%. Sterilizzare tutte le pinze e le forbici. Con la testa del pollo in soluzione salina di pollo autoclavata, taglia in due la testa del pulcino nella linea mediana, lasciando intatto un po' di tessuto intorno a ciascun occhio.

Il tessuto extra aiuterà l'occhio a mantenere una certa tensione nella coltura, oltre ad aiutare l'assorbimento dei nutrienti in tutto l'occhio e impedire all'occhio di scivolare via dalla carta da filtro. Questi tessuti fungono anche da punti di riferimento per l'orientamento dell'occhio nelle analisi successive. Lasciare il tessuto sezionato in soluzione salina di pollo a temperatura ambiente mentre si prepara la coltura.

Prepara il piatto di coltura. Posizionare due piastre di Petri da 35 millimetri all'interno di una piastra di Petri da 100 millimetri. Posizionare una rete metallica in ogni piattino.

Posiziona la mezza testa con l'occhiello su un pezzo di carta da filtro, inclinandola leggermente per assicurarti che l'occhio non scivoli via dalla carta. Trasferire il fazzoletto e la carta da filtro nella piccola capsula di Petri in cima al palco in rete metallica. Ripetere con l'altra metà della testa dello stesso embrione.

Aggiungere il terreno di coltura a ciascuna delle due piccole piastre di Petri. Portare il supporto al livello della carta velina. Non immergere il fazzoletto nel substrato.

Aggiungere 50 microlitri della soluzione madre antibiotica penicillina streptomicina al mezzo nutritivo in ogni piatto per prevenire l'infezione batterica. Metti un pezzo di tessuto sottile piegato sul bordo interno della capsula di Petri più grande e inumidiscila con acqua distillata. Incubare la coltura nell'incubatrice buia a 37 gradi Celsius per un massimo di quattro giorni.

Dopo la coltura, rimuovere il fazzoletto dalla carta da filtro e fissarlo al 4% di paraformaldeide. La prima colonna mostra un occhio HH34, che rappresenta l'occhio di pulcino embrionale all'inizio della coltura. La seconda colonna mostra un occhio di pulcino embrionale coltivato per quattro giorni, a partire da HH34.

La terza colonna mostra un occhio di HH38, che corrisponde a quattro giorni di sviluppo in-ovo oltre HH34. I pannelli da A a F non sono colorati, mentre i pannelli da G a I sono colorati per l'enzima fosfatasi alcalina. La riga superiore, pannelli da A a C, mostra che l'occhio continua a svilupparsi in tutta la cultura, evidenziato dalla comparsa di boccioli di piume e dalla crescita delle palpebre, indicata da frecce in ogni pannello.

La fila centrale, pannelli da D a F, mostra che le papille congiuntivali iniziano a degenerare in coltura. La riga inferiore, pannelli da G a I, mostra che il modello spazio-temporale dell'induzione dell'ossicino sclerale viene mantenuto in coltura, fungendo da esempio di un percorso di sviluppo che può essere studiato utilizzando questo metodo. Questo protocollo consente ai tessuti di mantenere gli aspetti spaziali e temporali chiave dello sviluppo per tutta la durata della coltura.

Questo protocollo rappresenta un progresso chiave nella coltura di interi organi sensoriali, fornendo una metodologia alternativa per lo studio degli intricati percorsi di sviluppo coinvolti.