Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca neuroscientifica, come la caratterizzazione della neuropopolazione o l'identificazione di fonti e bersagli dei sistemi di trasmissione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di determinare il profilo di espressione di un insieme preselezionato di geni da una singola cellula in modo rapido e semplice. Quindi questo metodo può fornire informazioni sul topo della diversità casuale.

Può essere applicato anche ad altri tipi di cellule, come gli astrociti e in molti modelli animali. Questa dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di arresto e di aspirazione possono essere difficili da apprendere perché i dati richiedono una quantità di citoplasma per essere analizzati. Prima del sezionamento, preparare un kit di dissezione contenente forbici chirurgiche, forbici per iride fine, due spatole, pinze, un disco di filtro di carta e colla cianoacrilica.

Quindi saturare la soluzione di taglio a freddo ghiacciato con carbogyn e raffreddare la camera di taglio a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Quindi, rimuovi il cuoio capelluto dell'animale e apri il cranio. Estrarre il cervello con cura e metterlo in un piccolo bicchiere riempito con una soluzione di taglio a freddo ghiacciata carbogenata.

Successivamente, rimuovere la camera di taglio da meno 20 gradi Celsius e rimuovere l'umidità con un tovagliolo di carta. Seziona attentamente il cervello per isolare la regione di interesse. Incollarlo sulla camera di taglio e aggiungere la soluzione di taglio carboginata a freddo ghiacciato.

Con l'aiuto di un vibratone, sezionare fette spesse 300 micrometri. Trasferire le fette in una camera di riposo riempita con soluzione di taglio ossigenata a temperatura ambiente e lasciarle riposare per almeno 30 minuti. Per la RT-PCR su singola cellula e la caratterizzazione mirata delle cellule, limitare la registrazione di tutte le cellule a non più di 20 minuti al fine di preservare l'mRNAsi.

Al termine della registrazione preparare una provetta PCR da 500 microlitri riempita con due microlitri di miscela 5xRT e 0,5 microlitri di 20xDTT. Giralo e conservalo sul ghiaccio. Quindi raccogliere il citoplasma della cellula applicando una leggera pressione negativa.

Monitorare e controllare l'ingresso della cellula nella pipetta mantenendo una chiusura ermetica ed evitare di raccogliere il nucleo se si considerano alcuni geni. Nel caso del gene, è essenziale evitare la raccolta del nucleo e includere una serie di primer volti ad amplificare il gDNA per prepararsi alla contaminazione generale. Se il nucleo si avvicina alla punta della pipetta, rilasciare la pressione negativa e allontanare la pipetta.

Assicurarsi che la chiusura ermetica sia preservata e riavviare la raccolta del citoplasma nella nuova posizione della pipetta. Successivamente, estrarre delicatamente la pipetta per formare un cerotto esterno verso l'esterno per limitare la contaminazione da parte dei detriti extracellulari e favorire la chiusura della membrana cellulare per la successiva analisi istochimica. Tenete presente che le protuberanze, i micro-manipolatori, la tastiera o il mouse del computer, sono fonti di contaminazione da rnasi caricate di protoni.

Se sono stati toccati durante la registrazione, cambiare i guanti. Successivamente, collegare la pipetta all'espulsore ed espellere il suo contenuto nella provetta per PCR applicando una pressione positiva. Rompere la punta della pipetta nella provetta PCR per facilitare la raccolta del suo contenuto.

Quindi, centrifugare brevemente la provetta, aggiungere 0,5 microlitri di inibitore dell'RNAsi e 0,5 microlitri di RTAsi. Mescolare delicatamente, centrifugare di nuovo e incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, gira il tubo e conservalo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un massimo di diversi mesi.

Fino all'analisi PCR e all'esecuzione della prima fase di amplificazione. Per convalidare la PCR, miscelare e diluire una coppia di primer, aggiungere un micromolare con la pipetta dedicata all'RTPCR a singola cellula. Impostare il termociclatore per tre minuti a 95 gradi Celsius, eseguire 40 cicli seguiti da un ultimo passaggio di allungamento a 72 gradi Celsius per cinque minuti.

Per ridurre al minimo la formazione di dimeri di primer, eseguire un avviamento a caldo posizionando le provette PCR nel termociclatore preriscaldato a 95 gradi Celsius. Dopo 30 secondi, espellere rapidamente 20 microlitri della miscela di primer sopra l'olio. Una volta convalidata la coppia di primer, testarla con il protocollo multiplex.

Mescolare e diluire il primer esterno insieme a un micromolare. Conservare la miscela di primer multiplex a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per un massimo di diverse settimane. Successivamente, prepara un pre-mix e mettilo sul ghiaccio.

Muovi la provetta per PCR, girala e aggiungi due gocce di olio minerale. Dopo tre minuti a 95 gradi Celsius, eseguire 20 cicli di PCR. Eseguire un avviamento a caldo come descritto con 20 microlitri di miscela di primer multiplex.

Quindi, preparare un numero di provette per PCR identico al numero di geni da analizzare. Preparare una premiscela utilizzando un microlitro del primo prodotto PCR per gene come modello. Regolare tutti i volumi in base al numero di geni da analizzare e considerare l'utilizzo del 10% di volume extra per compensare gli errori di pipettaggio.

Agitare delicatamente, girare la provetta e versare 80 microlitri di premiscela in ciascuna provetta per PCR. Aggiungere due gocce di olio minerale per provetta senza toccare la parete o il tappo delle provette. Eseguire 35 cicli di PCR, quindi eseguire un avvio a caldo espellendo 20 microlitri di miscela di primer interna.

Analizzare i secondi progetti di PCR mediante elettroforesi su gel di aragosio. Un neurone piramidale di cinque strati è stato identificato visivamente dal suo grande soma e da un dendrite apicale prominente. La registrazione con cella di trazione ha rivelato le tipiche proprietà elettrofisiologiche dei neuroni spike regolari del quinto strato con una bassa resistenza all'input, potenziali d'azione di lunga durata e un pronunciato adattamento alla frequenza di picco.

L'analisi molecolare di questo neurone ha rivelato l'espressione di vGluT1, confermando il suo fenotipo glutamitergico. Questo neurone esprimeva anche somatostatina e l'ATP1-alfa-1 e tre subunità degli ATPA sodio-potassio. La marcatura con biocitina dei neuroni registrati, ha confermato una morfologia piramidale.

Come previsto dai neuroni glutamitergici, l'analisi molecolare di 26 cellule piramidali di quinto strato, ha rivelato l'espressione di vGluT1 ma di nessuno dei due GAD. Una volta che la tecnica può essere eseguita entro due giorni, se è preformata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare molta attenzione per evitare contaminazioni.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sondare l'espressione di 10 geni contemporaneamente da singole cellule caratterizzate da grumi di patch secondo fette di cervello, dopo la raccolta del citoplasma, la trascrizione inversa e la PCR hot-start. Non dimenticare che lavorare con il bromuro di etidio può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario sempre prendere precauzioni come indossare guanti e camici da laboratorio.