Indagando Teliospore germinazione utilizzando analisi Microrespiration e Microdissection

L'obiettivo generale delle procedure qui presentate è identificare le fasi di germinazione delle spore in modo da poter valutare i livelli di trascrizione genica. L'analisi di questi cambiamenti fornirà ulteriori conoscenze su una fase critica nella dispersione della malattia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle transizioni durante la germinazione delle teliospore che sono collegate a cambiamenti nei livelli di trascrizione genica e quindi riflettono i cambiamenti nel controllo dell'espressione genica.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che identifica le transizioni nel livello di respirazione che non corrispondono a interruttori morfologici visibili e consente l'isolamento fisico delle teliospore in fasi distinte della germinazione. Questa tecnica ha implicazioni per il controllo della diffusione dei patogeni, perché ci permette di identificare le transizioni chiave nella germinazione delle spore che, se alterate, potrebbero bloccare la diffusione della malattia. Inizia questa procedura con l'infezione da pannocchia, la raccolta di teliospore, nonché la vitalità e il test di germinazione delle teliospore, come descritto nel protocollo di testo.

Per indurre la germinazione, pesare prima una quantità uguale di teliospore per ogni esperimento di respirazione. In una cabina di biosicurezza, aggiungere le teliospore a una camera di respirazione autoclavata. Riempi la camera con brodo di destrosio di patate, integrato con streptomicina solfato e kanamicina solfato.

Pipettare su e giù per creare una sospensione di teliospore. Posizionare il coperchio della camera nella camera per creare una chiusura ermetica. Per ottenere la misurazione OCR, posizionare prima la camera nel rack della camera all'interno di un bagno d'acqua.

Quindi, posizionare la sonda di ossigeno all'interno dell'apertura della camera. Monitora i punti dati che appaiono in tempo reale sul programma della velocità di tracciamento del sensore. Lasciare stabilizzare la sonda per circa tre minuti dopo che la sonda è stata posizionata nella camera.

Fare clic su Misura per misurare i livelli di ossigeno in modo continuo per sei ore con misurazioni registrate a intervalli di due secondi. Interrompere la misurazione e ripetere questi passaggi per ogni campione da analizzare prima di esportare i dati in Microsoft Excel ed eseguire l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. Mettere circa 10 milligrammi di teliospore umatus in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Sospendere le teliospore in 500 microlitri di PDB integrato con streptomicina solfato. Pipettare delicatamente per mescolare fino a quando non ci sono grumi di teliospore nel terreno. Trasferire la sospensione di teliospore in un pallone di Erlin Meyer da 250 millilitri autoclavato, contenente PDB, integrato con streptomicina solfato.

Incubare il pallone per una notte a 28 gradi Celsius, agitando a 90 giri/min. Preparare una capsula di Petri pipettando da quattro a cinque gocce da cinque microlitri di acqua distillata sulla parte superiore della capsula di Petri. Quindi, pipettare tre goccioline da due microlitri di soluzione di stabilizzazione dell'RNA sulla piastra di Petri da utilizzare per la raccolta del campione.

Pipettare anche 30 goccioline da cinque microlitri di teliospore in germinazione sulla capsula di Petri. Aggiungere 15 millilitri di olio minerale alla capsula di Petri. Assicurarsi che tutte le goccioline siano coperte da olio prima di procedere.

Successivamente, preparare un microcapillare con un diametro intermedio di 15 micron, una flangia di un millimetro, una lunghezza di 55 millilitri e un angolo di punta di 20 gradi. Posizionarlo nel supporto microcapillare e immergerlo nell'olio minerale, dove l'azione capillare consentirà all'olio minerale di entrare nel microcapillare. Rilasciare la pressione nel microcapillare prima di portarla alla goccia d'acqua.

Aspirare per preparare il microcapillare con acqua. Utilizzando i controlli del micromanipolatore, spostare il microcapillare preparato su una delle goccioline di germinazione e penetrare nella gocciolina. Abbassare il microcapillare e portare la bocca del microcapillare fino a una teliospora germinante nella fase di germinazione di interesse.

Aspirare lentamente per catturare il teliosporo in germinazione. Interrompere l'aspirazione una volta che la teliospora è entrata nel microcapillare. Ripetere fino a quando non ci sono circa cinque teliospore nel microcapillare.

Sollevare il microcapillare con il micromanipolatore e portarlo alla gocciolina di raccolta della soluzione di stabilizzazione dell'RNA. Penetrare la gocciolina e iniettare le teliospore nella gocciolina. Ripetere questi passaggi fino a quando non sono state catturate circa 1.000 teliospore.

Per recuperare la gocciolina di raccolta, pipettare la gocciolina di raccolta e trasferirla nel coperchio della provetta microcenterfuge libera da 2,0 millilitri del DNA di un RNA. Applicare con cura l'olio minerale con la pipetta, senza disturbare la gocciolina di raccolta. Le teliospore possono ora essere utilizzate per applicazioni a valle come l'isolamento dell'RNA.

Questo grafico illustra un risultato tipico della valutazione dei cambiamenti del livello di ossigeno nelle sospensioni di teliospore indotte a germinare. Rispetto alle teliospore non indotte, la separazione che indica l'inizio della respirazione avviene a circa 30 minuti. Considerando che ci vogliono circa 15 minuti per impostare e trasportare il campione alla sonda di ossigeno, questo tempo è in realtà di 45 minuti.

Qui sono mostrate le cinque fasi della germinazione delle teliospore. Nella prima fase, le teliospore sono indotte a germogliare ma non mostrano alcun segno morfologico di germinazione. Le teliospore del secondo stadio mostrano un promicelio emerso con una lunghezza inferiore al diametro del teliosporo.

Nella terza fase la lunghezza del promicelio è maggiore del diametro del teliosporo. Il quarto stadio è caratterizzato da promiceli con basidiospore attaccate. E nella quinta fase, ci sono basidiospore in erba.

Qui, vengono mostrate le teliospore che germinano in modo asincrono e il microcapillare è posizionato vicino a un teliosporo di stadio tre. La teliospora di stadio tre viene quindi aspirata nel microcapillare e trasferita in una goccia di soluzione di raccolta. Una volta padroneggiata, questa tecnica di microdissezione può essere utilizzata per isolare 1.000 teliospore specifiche in sei o sette ore.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di fare pause frequenti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare fisicamente le spore in fasi morfologicamente distinte della germinazione. E identificare i tempi di inizio della respirazione.

In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà, a causa della necessità di mantenere la sterilità. E la necessità di pazienza e di isolare i tipi di cellule mediante microdissezione. Lo sviluppo di questa tecnica apre la strada ai patologi delle piante fungine per esplorare gli aspetti morfologici e molecolari della germinazione nei funghi devastanti che minacciano la sicurezza alimentare globale.

Sebbene questa tecnica si applichi a noi ligomatici, potrebbe essere utilizzata anche in molti altri agenti patogeni devastanti delle colture agricole che si traducono in perdite di miliardi di dollari all'anno. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'isolamento dell'RNA per rispondere a ulteriori domande, ad esempio, qual è il profilo e la tempistica del cambiamento del livello di trascrizione?