Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche
16 settembre 2018
Procedure sperimentali per l'estrazione successiva di tessuti linfatici per testare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi sono descritti dopo il trattamento di un nanomateriale immunostimulating.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di familiarizzare con la tecnica unica richiesta per isolare il linfonodo mediastino dai topi. L'operazione è stata condotta dopo aver iniettato materiale immunostimolante su sei diverse vie nei topi. In questo studio, abbiamo usato una nuova classe di materiali che formano strutture di dimensioni nanometriche.
I tensioattivi sono costituiti da gruppo testa idrofila e coda idrofobica. Questi formano micelle sferiche o altra struttura secondaria a causa della separazione dei microfagi. Abbiamo utilizzato questa proprietà per una bio macromolecola che è il DNA.
L'anfifilo del DNA, mostrato qui, come nucleotidi regolari come A, C, G, T, ha blocchi idrofili mentre le nucleobase neuro-cellulari modificate lipidiche agiscono come unità idrofobiche. L'oligo modificato è stato sintetizzato dal sintetizzatore DNA in ottogrammi su larga scala. Negli equi-media i DNA lipidici anfifili formano spontaneamente micelle sferiche di dimensioni nanometriche.
Quando si forma la micelle, il DNA rimane mono-filamento come vettore vuoto con circa 10 nanometri di diametro. Per dotare il vettore di immuno-stimolante, è semplice estendere la sequenza del DNA con recettore a pedaggio nove coadiuvanti vale a dire eCpG. Dna lipidico e base eCpG qui quindi la superficie esterna della micella viene degradata con sequenza CpG.
Quindi chiamiamo questa nanoparticcella immuno-stimolante come INP. Per determinare il modo corretto degli INP per la risposta immunitaria abbiamo iniettato INP ai topi in 64 vie di iniezione e di conseguenza è stato analizzato un tessuto linfonodo adeguato. Per istruzioni di iniezione più dettagliate si prega di trovare un articolo JOB pubblicato da Charles River nel 2012.
Il vantaggio principale di questo video è mostrare visivamente come ottenere il linfonodo mediastino. Il video mostra esplicitamente la posizione del linfonodo mediastino che molte persone trovano difficoltà nell'isolare gli organi. Tutti gli esperimenti sono stati condotti sotto le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee presso lo Shanghai Public Health Clinical Center, o University of Ulsan College of Medicine.
Questa parte mostrerà la posizione specifica di organi o tessuti, che sono cruciali per l'analisi immunologica. Milza e due linfonodi saranno isolati. Prima di tutto, i topi sono stati sacrificati dall'eutanasia per inalazione di anidride carbonica e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza come segue la guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
D'ora in poi troviamo gli organi e li isoliamo. Per prima cosa, fissare correttamente il mouse sulla scrivania operativa con quattro perni sul palmo del mouse. Sterilizzare l'area di dissezione con alcol.
Sezionare la copertura esterna del fondo dell'addome del topo con una forbice di grandi dimensioni. Utilizzare le pin per aprire entrambi i lati dell'attacco e fissarlo con i perni sul tavolo operatorio. La posizione del linfonodo inguinale è esposta trovando la congiunzione del vaso che scende verso la gamba sinistra.
La forma del vaso sembra la lettera dell'alfabeto inclinato Y.Scopri lo strato con le forcep e tiralo dalla pelle. Tagliare il peritoneo con forbice più piccola per esporre gli organi interni. Spostare l'intestino a destra usando le forcep e quindi avvolgere la milza sagomata, che mostra sul lato sinistro, superiore sinistro dell'addome.
È necessaria un'ulteriore attenzione durante la procedura poiché la milza è facile da interrompere. Infine il punto chiave di questo video: raccolta del linfonodo mediastino. Si trova sotto il lato superiore del polmone, che è difficile da vedere a causa delle sue piccole dimensioni e della posizione un po 'nascosta.
Esporre attentamente l'area utilizzando piccole forbici e forcep. Tagliare entrambi i lati delle nervature e anche il diaframma. Ritagliare le costole tagliate sopra il petto.
Durante la procedura evitare di danneggiare il cuore e i vasi sanguigni poiché potrebbe accecare il sito, trovando il linfonodo mediastinico traslucido. Se per caso il vaso sanguigno scoppia, pulire delicatamente il sangue con una garza. Afferrare il lato sinistro del polmone e girarlo dolcemente dall'altra parte per vedere sotto il polmone.
Tirare su il linfonodo mediastino usando le forcep. Dopo aver raccolto il linfonodo mediastino, assicurarsi di rimuovere perfettamente tutto il grasso e il sangue che circondano il linfonodo poiché il tessuto indesiderato può influenzare l'analisi. Infine, tutti gli organi isolati su una piastra di Petri piena di media.
Totale 0,1 per 10 alla sesta cellule sono state analizzate su questa citometria del flusso. In base al getter di forza e alle dimensioni, la popolazione di leucociti getter fu recinta e le cellule furono escluse dalla colorazione scura. 24 ore dopo l'iniezione in INP per 64 vie di iniezione, milza, linfonodo inguinale e linfonodo mediastinico sono stati raccolti e analizzati l'attivazione CC per citometria del flusso.
Sulla base della strategia della citometria del flusso, la popolazione DC è stata definita come cellule positive cd11C e negative di lignaggio nel leucocita vivo. In particolare, l'iniezione intranasale di INP ha promosso aumenti significativi nell'espressione CD40, 80, 86 nel linfonodo mediastino rispetto al PBS per il controllo. Pertanto, questi dati hanno suggerito che l'iniezione intranasale di INP può essere utilizzata come coadiuvante mucoso per il miglioramento dell'immunità nel polmone.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una procedura per l'isolamento dei linfonodi mediastinici da topi a seguito dell'iniezione di un nanomateriale immunostimolante. La tecnica si concentra sull'estrazione dei tessuti linfatici al fine di valutare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Nanotecnologia
Contesto
- Comprendere l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi è fondamentale per la ricerca immunologica.
- I materiali immunostimolanti possono potenziare le risposte immunitarie.
- Le strutture su scala nanometrica possiedono proprietà uniche che possono essere sfruttate in applicazioni biologiche.
- Le tecniche di isolamento sono essenziali per lo studio di specifici tipi di cellule immunitarie.
Scopo dello studio
- Abituare i ricercatori alla tecnica di isolamento dei linfonodi mediastici.
- Valutare gli effetti di una nuova classe di nanomateriali immunostimolanti.
- Studiare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi dopo il trattamento.
Metodi Utilizzati
- Iniezione di materiale immunostimolante mediante sei diverse vie nei topi.
- Isolamento dei linfonodi mediastinici mediante tecniche chirurgiche specifiche.
- Utilizzo di surfattanti per formare strutture di dimensioni nanometriche.
- Applicazione del DNA come biomacromolecola nello studio.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di tessuti linfatici da topi.
- Attivazione delle cellule dendritiche linfoidi osservata dopo il trattamento.
- Dimostrazione dell'efficacia del nanomateriale immunostimolante.
- Informazioni sul ruolo delle strutture di dimensioni nanometriche nelle risposte immunologiche.
Conclusioni
- La tecnica per isolare i linfonodi mediastinici è efficace e riproducibile.
- I nanomateriali immunostimolanti possono influenzare in modo significativo l'attivazione delle cellule immunitarie.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare il potenziale completo di questi materiali nell'immunologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Una valutazione precisa degli agenti immunostimolanti richiede metodi robusti per l'estrazione e l'analisi dei tessuti linfoidi al fine di valutare l'attivazione delle cellule dendritiche in relazione alle diverse vie di somministrazione. Questo flusso di lavoro consente ai team biofarmaceutici di confrontare i profili di attivazione immunitaria di nuovi agenti basati su nanoparticelle, supportando una previsione affidabile nelle fasi iniziali della scoperta di immunoterapie e vaccini. L'approccio fornisce informazioni dirette per le decisioni relative alla via di somministrazione e alla selezione di candidati immunomodulatori all'interno del portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette l'analisi dei meccanismi di attivazione immunitaria quantificando le risposte delle cellule dendritiche nei tessuti linfoidi.
- Supporta la riduzione del rischio biologico confrontando i profili di attivazione dopo somministrazioni per diverse vie.
- Facilita la validazione funzionale del bersaglio per candidati nanoparticellati immunostimolanti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce protocolli standardizzati di estrazione dei tessuti e di citometria a flusso per un'analisi riproducibile delle cellule immunitarie.
- Fornisce letture quantitative di marcatori di attivazione delle cellule dendritiche (CD40, CD80, CD86) per lo sviluppo di saggi.
- Consente lo screening delle vie di somministrazione per ottimizzare i profili di immunogenicità.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati sull'attivazione immunitaria a strategie di somministrazione dipendenti dalla via per la ricerca traslazionale su vaccini e immunoterapie.
- Permette una continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo un monitoraggio diretto a livello tissutale della risposta immunitaria.
- Fornisce indicazioni per la progressione dei candidati con profili favorevoli di attivazione e sicurezza, adeguata al rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta dell'immunoterapia, dalla validazione precoce del bersaglio fino alla selezione del candidato preclinico, consentendo un confronto diretto dell'attivazione immunitaria tra diverse vie di somministrazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di immunostimolazione e sull'attivazione specifica per tessuto.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili di citometria a flusso per il confronto tra diverse vie di somministrazione.
- Analisi: Fornisce dati sull'attivazione delle cellule dendritiche basati su marcatori per guidare il ranking dei candidati.
- Ricerca traslazionale: Collega l'attivazione immunitaria dipendente dalla via di somministrazione a strategie precliniche di somministrazione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile per l'estrazione e l'analisi dei tessuti finalizzato alla valutazione di immunostimolanti nanoparticellati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riguardo al meccanismo e alla scelta della via di somministrazione dell'immunostimolante.
- Valore operativo: Standardizza l'estrazione dei tessuti e la citometria a flusso per un profilo immunitario riproducibile.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione per i candidati immunomodulatori basate sull'attivazione immunitaria quantitativa.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati in base al rischio, selezionando quelli con profili ottimali di attivazione e somministrazione.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella dissezione di modelli murini ed estrazione di tessuti linfoidi, in particolare per i linfonodi mediastinici.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per citometria a flusso e infrastrutture analitiche per il profilo delle cellule immunitarie.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nelle procedure di gestione dei tessuti e nelle strategie di gating per garantire la riproducibilità.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi modelli animali o tessuti bersaglio.
- Una preparazione accurata dei tessuti è fondamentale per evitare contaminazioni e garantire un'analisi precisa delle cellule immunitarie.
