Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche
September 16th, 2018
Procedure sperimentali per l'estrazione successiva di tessuti linfatici per testare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi sono descritti dopo il trattamento di un nanomateriale immunostimulating.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di familiarizzare con la tecnica unica richiesta per isolare il linfonodo mediastino dai topi. L'operazione è stata condotta dopo aver iniettato materiale immunostimolante su sei diverse vie nei topi. In questo studio, abbiamo usato una nuova classe di materiali che formano strutture di dimensioni nanometriche.
I tensioattivi sono costituiti da gruppo testa idrofila e coda idrofobica. Questi formano micelle sferiche o altra struttura secondaria a causa della separazione dei microfagi. Abbiamo utilizzato questa proprietà per una bio macromolecola che è il DNA.
L'anfifilo del DNA, mostrato qui, come nucleotidi regolari come A, C, G, T, ha blocchi idrofili mentre le nucleobase neuro-cellulari modificate lipidiche agiscono come unità idrofobiche. L'oligo modificato è stato sintetizzato dal sintetizzatore DNA in ottogrammi su larga scala. Negli equi-media i DNA lipidici anfifili formano spontaneamente micelle sferiche di dimensioni nanometriche.
Quando si forma la micelle, il DNA rimane mono-filamento come vettore vuoto con circa 10 nanometri di diametro. Per dotare il vettore di immuno-stimolante, è semplice estendere la sequenza del DNA con recettore a pedaggio nove coadiuvanti vale a dire eCpG. Dna lipidico e base eCpG qui quindi la superficie esterna della micella viene degradata con sequenza CpG.
Quindi chiamiamo questa nanoparticcella immuno-stimolante come INP. Per determinare il modo corretto degli INP per la risposta immunitaria abbiamo iniettato INP ai topi in 64 vie di iniezione e di conseguenza è stato analizzato un tessuto linfonodo adeguato. Per istruzioni di iniezione più dettagliate si prega di trovare un articolo JOB pubblicato da Charles River nel 2012.
Il vantaggio principale di questo video è mostrare visivamente come ottenere il linfonodo mediastino. Il video mostra esplicitamente la posizione del linfonodo mediastino che molte persone trovano difficoltà nell'isolare gli organi. Tutti gli esperimenti sono stati condotti sotto le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee presso lo Shanghai Public Health Clinical Center, o University of Ulsan College of Medicine.
Questa parte mostrerà la posizione specifica di organi o tessuti, che sono cruciali per l'analisi immunologica. Milza e due linfonodi saranno isolati. Prima di tutto, i topi sono stati sacrificati dall'eutanasia per inalazione di anidride carbonica e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza come segue la guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
D'ora in poi troviamo gli organi e li isoliamo. Per prima cosa, fissare correttamente il mouse sulla scrivania operativa con quattro perni sul palmo del mouse. Sterilizzare l'area di dissezione con alcol.
Sezionare la copertura esterna del fondo dell'addome del topo con una forbice di grandi dimensioni. Utilizzare le pin per aprire entrambi i lati dell'attacco e fissarlo con i perni sul tavolo operatorio. La posizione del linfonodo inguinale è esposta trovando la congiunzione del vaso che scende verso la gamba sinistra.
La forma del vaso sembra la lettera dell'alfabeto inclinato Y.Scopri lo strato con le forcep e tiralo dalla pelle. Tagliare il peritoneo con forbice più piccola per esporre gli organi interni. Spostare l'intestino a destra usando le forcep e quindi avvolgere la milza sagomata, che mostra sul lato sinistro, superiore sinistro dell'addome.
È necessaria un'ulteriore attenzione durante la procedura poiché la milza è facile da interrompere. Infine il punto chiave di questo video: raccolta del linfonodo mediastino. Si trova sotto il lato superiore del polmone, che è difficile da vedere a causa delle sue piccole dimensioni e della posizione un po 'nascosta.
Esporre attentamente l'area utilizzando piccole forbici e forcep. Tagliare entrambi i lati delle nervature e anche il diaframma. Ritagliare le costole tagliate sopra il petto.
Durante la procedura evitare di danneggiare il cuore e i vasi sanguigni poiché potrebbe accecare il sito, trovando il linfonodo mediastinico traslucido. Se per caso il vaso sanguigno scoppia, pulire delicatamente il sangue con una garza. Afferrare il lato sinistro del polmone e girarlo dolcemente dall'altra parte per vedere sotto il polmone.
Tirare su il linfonodo mediastino usando le forcep. Dopo aver raccolto il linfonodo mediastino, assicurarsi di rimuovere perfettamente tutto il grasso e il sangue che circondano il linfonodo poiché il tessuto indesiderato può influenzare l'analisi. Infine, tutti gli organi isolati su una piastra di Petri piena di media.
Totale 0,1 per 10 alla sesta cellule sono state analizzate su questa citometria del flusso. In base al getter di forza e alle dimensioni, la popolazione di leucociti getter fu recinta e le cellule furono escluse dalla colorazione scura. 24 ore dopo l'iniezione in INP per 64 vie di iniezione, milza, linfonodo inguinale e linfonodo mediastinico sono stati raccolti e analizzati l'attivazione CC per citometria del flusso.
Sulla base della strategia della citometria del flusso, la popolazione DC è stata definita come cellule positive cd11C e negative di lignaggio nel leucocita vivo. In particolare, l'iniezione intranasale di INP ha promosso aumenti significativi nell'espressione CD40, 80, 86 nel linfonodo mediastino rispetto al PBS per il controllo. Pertanto, questi dati hanno suggerito che l'iniezione intranasale di INP può essere utilizzata come coadiuvante mucoso per il miglioramento dell'immunità nel polmone.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo articolo descrive una procedura per isolare i linfonodi mediastinici dai topi dopo l'iniezione di un nanomateriale immunostimolante. La tecnica si concentra sull'estrazione dei tessuti linfatici per valutare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Nanotecnologia
Sfondo
- Comprendere l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi è cruciale per la ricerca immunologica.
- I materiali immunostimolanti possono migliorare le risposte immunitarie.
- Le strutture di dimensioni nanometriche hanno proprietà uniche che possono essere utilizzate in applicazioni biologiche.
- Le tecniche di isolamento sono essenziali per studiare tipi specifici di cellule immunitarie.
Obiettivo dello studio
- Far familiarizzare i ricercatori con la tecnica di isolamento dei linfonodi mediastinici.
- Valutare gli effetti di una nuova classe di nanomateriale immunostimolante.
- Investigare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi dopo il trattamento.
Metodi utilizzati
- Iniezione di materiale immunostimolante tramite sei diverse vie nei topi.
- Isolamento dei linfonodi mediastinici utilizzando tecniche chirurgiche specifiche.
- Utilizzo di tensioattivi per formare strutture di dimensioni nanometriche.
- Applicazione del DNA come bio macromolecola nello studio.
Risultati principali
- Isolamento con successo dei tessuti linfatici dai topi.
- Attivazione delle cellule dendritiche linfoidi osservata dopo il trattamento.
- Dimostrazione dell'efficacia del nanomateriale immunostimolante.
- Approfondimenti sul ruolo delle strutture di dimensioni nanometriche nelle risposte immunitarie.
Conclusioni
- La tecnica per isolare i linfonodi mediastinici è efficace e riproducibile.
- I nanomateriali immunostimolanti possono influenzare significativamente l'attivazione delle cellule immunitarie.
- Ulteriori ricerche sono necessarie per esplorare appieno il potenziale di questi materiali in immunologia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Precise evaluation of immunostimulatory agents requires robust methods for extracting and analyzing lymphoid tissues to assess dendritic cell activation across administration routes. This workflow enables biopharma teams to compare immune activation profiles of novel nanoparticle-based agents, supporting predictive confidence in early immunotherapy and vaccine discovery. The approach directly informs route-of-administration decisions and portfolio triage for immunomodulatory candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune activation mechanisms by quantifying dendritic cell responses in lymphoid tissues.
- Supports biological de-risking by comparing activation signatures across multiple administration routes.
- Facilitates functional target validation for immunostimulatory nanoparticle candidates.
Screening & Assay Development
- Provides standardized tissue extraction and flow cytometry protocols for reproducible immune cell analysis.
- Delivers quantitative readouts of dendritic cell activation markers (CD40, CD80, CD86) for assay development.
- Enables screening of administration routes to optimize immunogenicity profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune activation data with route-dependent delivery strategies for translational vaccine and immunotherapy research.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct tissue-level immune monitoring.
- Informs risk-adjusted advancement of candidates with favorable activation and safety profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the immunotherapy discovery continuum from early target validation through preclinical candidate selection, enabling direct comparison of immune activation across administration routes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immunostimulant mechanism and tissue-specific activation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative flow cytometry outputs for cross-route comparison.
- Analytics: Delivers marker-based dendritic cell activation data to inform candidate ranking.
- Translational Research: Connects route-dependent immune activation to preclinical delivery strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue extraction and analysis workflow for nanoparticle immunostimulant evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immunostimulant mechanism and route selection.
- Operational Value: Standardizes tissue extraction and flow cytometry for reproducible immune profiling.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for immunomodulatory candidates based on quantitative immune activation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates with optimal activation and delivery profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and lymphoid tissue extraction, especially for mediastinal lymph nodes.
- Needs access to flow cytometry instrumentation and analytical infrastructure for immune cell profiling.
- Demands cross-team standardization of tissue handling and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different animal models or tissue targets.
- Careful tissue preparation is critical to avoid contamination and ensure accurate immune cell analysis.
