Name: Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Impara l'isolamento dei linfonodi mediastinici nei topi per valutare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi dopo l'iniezione di nanomateriali immunostimolanti. Questa tecnica chirurgica consente analisi precise del sistema immunitario.

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Questa ricerca è stata supportata dal programma di Creative materiali scoperta attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro pianificazione (NRF-2017M3D1A1039421) e dal programma di biotecnologie Marine finanziato dalla Ministero degli oceani e pesca, Repubblica di Corea e una borsa di studio (20150220).

Tutte le procedure sperimentali tra cui isolamento di manipolazione, sacrificio e organo animale sono state eseguite in stretta conformità con le regole del Comitato uso presso centro clinico di salute pubblica di Shanghai e Asan Medical Center e International Animal Care. Il protocollo di studio è stato approvato dai rispettivi comitati di etica di animale esperimenti presso Shanghai Public Health Clinical Center (numero di protocollo del Mouse: SYXK-2010-0098) e Asan Medical Center (2016-02-168).
1. preparazione del materiale
Nota: Un nano-adiuvante, INP, composto da un elemento portante del lipido-DNA auto-assemblati, vale a dire U4T, e oligonucleotidi contenenti CpG-motivo, eCpG, è stato impiegato nello studio corrente per verificare la route di iniezione appropriato per immunoterapia e vaccinazione nei topi2 . D'importanza, altri potenziali molecole terapeutiche quali antigeni, anticorpi e agenti ausiliari possono essere sostituiti per INP e testato utilizzando la stessa metodologia descritta di seguito.
<ol><li>INP formulazione2,4,7<ol>
<li>Tempri U4T (160 µM, elemento portante) con eCpG (80 µM, contenente una sequenza di TLR9 agonista) in presenza di 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4) e MgCl2 (2 mM). Il volume standard per ricottura è tra 50 e 110 µ l in un tubo PCR. Riscaldare la miscela a 95 ° C per 10 min e poi lentamente raffreddare (1 ° C/16 min) a 25 ° C utilizzando un termociclatore. Il protocollo di ricottura richiede circa 2 h. Attenzione: Il liquido che contiene U4T è molto schiumoso e deve essere maneggiato con attenzione.</li>
		<li>Rendere le aliquote della preparazione INP; 50-µ l utilizzare 50 µ l del materiale per ogni iniezione. Nota: Nel caso di 100 µ l per iniezione, ripetere il passaggio 1.1 con corretto calcolo degli ingredienti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. generale animale procedure
Nota: Metodi alternativi per la gestione del mouse possono essere utilizzati a seconda delle esigenze di laboratorio e protocolli approvati animale8. Il tipo di topi usati è 6-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6.
<ol><li>Elenco dei materiali<ol>
<li>Preparare il liquido anestetico (isoflurano), macchina dell'anestetico, camera di inalazione di anidride carbonica (CO2), garza sterile, forcipe, dispositivo di ritenuta del mouse, guanti, forcipe uncinato, forbici per dissezione 1-inch, forbici per dissezione 2 pollici, alcool per sterilizzazione e siringa da insulina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inhalant anestesia Nota: L'anestesia è obbligatoria per grassatore intranasale, sottocutanea e iniezioni endovenose di topi9. Una camera di induzione con un serbatoio di ossigeno e macchina vaporizzatore collegato è utilizzata per questa procedura.<ol>
<li>Metti l'animale nella camera di induzione e assicurarsi di chiudere ermeticamente il coperchio.</li>
		<li>L'ossigeno a 1 L/min di flusso e impostare il vaporizzatore ad un livello di induzione del 4% per l'isoflurano.</li>
		<li>Variare il tempo di esposizione di animali nella camera a seconda del peso dell'animale; Tuttavia, più di 10 s di esposizione e monitoraggio ogni 5 min è necessaria per l'anestesia10. Nota: Nessun riflesso pedale indica successo anestesia.</li>
		<li>Spegnere l'induttore di isoflurano e flusso di 1 L/min di ossigeno per evitare l'esposizione del personale a gas isoflurano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sacrificio<ol>
<li>Preparare una camera per CO2 inalazione sacrificio secondo il NIH "linee guida per l'eutanasia di roditori utilizzando anidride carbonica"11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risposta di gag di test per confermare che l'animale è completamente sacrificato.<ol>
<li>Verificare che il mouse correttamente è sacrificato pizzicare la punta del suo piede e non confermando nessuna risposta di bavaglio. Se c'è una risposta, ripetere il punto 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disinfezione<ol>
<li>Disinfettare tutte le superfici utilizzate per iniezioni o dissezioni con alcool spray e garze sterilizzate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deposito di organo<ol>
<li>Utilizzare pinze per rimuovere tutti i grasso e sangue che circonda gli organi raccolti. Conservare questi tessuti raccolti singolarmente in una capsula Petri riempito con 3 mL di PBS. Il contenitore e media può differire a seconda dei requisiti di procedura successiva.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. iniezione rotte
<ol><li>Utilizzare i metodi di sei iniezione per indagare le risposte immunitarie di iniezione-dipendente: orale, intranasale, sottocutanea, zampa, intraperitoneale ed endovenosa8,12,13.</li>
</ol>4. isolamento dei linfonodi e milza
Nota: Utilizzare topi magri giovani e sani (6 settimane) per queste procedure perché i grassi che si accumulano in genere intorno i linfonodi in più vecchi topi sono difficili da rimuovere e possono impedire la corretta visualizzazione dell'organo.
<ol><li>Passaggi di pre-raccolta Nota: Questa sezione descrive la raccolta di post-iniezione di iLN, milza e mLN dai topi per l'analisi di stimolazione immune. Fare riferimento ai punti 2.3-2.5 per il sacrificio, gag risposta e metodi di disinfezione.<ol>
<li>Appuntare le membra del mouse alla scheda di schiuma chirurgica e sterilizzare il lato ventrale del mouse con etanolo al 70%.</li>
		<li>Scegliere un percorso di 2 cm sopra la zona genitale e uso agganciato forcipe per sollevare il coperchio di pelle esterna come una tenda. Fare un taglio di circa 1 cm in questa posizione e far scorrere le forbici (2 pollici) sotto la pelle, ulteriori tagli di dissezione.</li>
		<li>Per il tegumento, tagliato verticalmente attraverso la pelle esterna con entrambe le braccia delle forbici (2 pollici). Esporre gli organi interni, ricoperti di peritoneo.</li>
		<li>Appuntare lo strato esterno della pelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento del linfonodo inguinal (iLN)
	<ol>
<li>Individuare il iLN sul lato sinistro del piedino che segue la congiunzione del vaso sanguigno andando giù la gamba sinistra, che appare come una lettera inclinata 'Y'. Nota: Per i topi per via sottocutanea iniettati, scegliere un iLN sullo stesso lato del punto di iniezione.</li>
		<li>Scoprire lo strato con due pinze per strappare lo strato lipidico coperto e raccolto il iLN giallo pallido (forma di fagiolo, 2 mm). Per il trattamento successivo e lo stoccaggio del tessuto, vedi punto 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento della milza 14<ol>
<li>Fare una tenda al centro del peritoneo utilizzando agganciato forcipe in una mano e utilizzare piccole sottili forbici (1 pollice) con l'altra mano per tagliare il peritoneo.</li>
		<li>Forcipe di uso agganciato nella mano sinistra per afferrare l'intestino e capovolgerla per individuare rossa fagiolo-come milza (lunghezza di circa 14 mm) attaccata sul lato superiore sinistro dell'addome del mouse.</li>
		<li>Estrarre delicatamente la milza con un altro set di pinze nella mano destra mentre si toglie altri organi con il forcipe uncinato. Seguire il passaggio 2.6 per memorizzare la milza. Nota: Cura è necessaria quando la milza, la raccolta come è un organo molle facilmente danneggiato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento del linfonodo mediastinico (mLN) Nota: Il mLN è situato a circa 1 cm sotto le costole ed è coperto da altri organi quali il cuore ed i polmoni. A causa della sua posizione e le dimensioni ridotte, è importante esporre con attenzione la zona circostante utilizzando pinze e le forbici (1 pollici).<ol>
<li>Tagliare il diaframma e staccarlo dalle costole. Tenere il corpo delle costole con il forcipe e poi tagliare la parte sinistra e destra delle costole con le forbici (1 pollici). Appuntare le costole taglio sopra la spalla del mouse sul diritto di esporre il cuore ed i polmoni. Nota: fare attenzione per non tagliare qualsiasi dei vasi sanguigni intorno al cuore e polmoni, come la fuoriuscita di sangue, lo rende molto difficile individuare il minuscolo mLN traslucido. Se sono tagliati in vasi sanguigni, delicatamente di assorbire il sangue nella zona con una garza.</li>
		<li>Utilizzando forcipe uncinato nella mano destra, capovolgere il cuore ed i polmoni delicatamente verso destra fino a quando la spina dorsale è esposto. Utilizzare un paio di pinze regolari nella mano sinistra per rimuovere il iLN con il forcipe uncinato nella mano destra per aiutare con questa raccolta.</li>
		<li>Afferrare i polmoni e capovolgerli fino a quando la spina dorsale è ampiamente esposto. Il mLN (un traslucido struttura a forma di fagiolo di circa 2 mm di dimensione) si trova tra i polmoni e la colonna vertebrale.</li>
		<li>Utilizzare il forcipe uncinato per esporre l'area intorno il mLN e le altre pinze per estrarre il tessuto. Nota: Il mLN è circondato da numerosi altri tessuti che devono essere tolte con cautela con il forcipe prima del raccolto.</li>
		<li>Vedere il punto 2.7 per istruzioni a immagazzinare il raccolto mLN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. preparazione dei campioni per citometria a flusso
Nota: Per l'attivazione delle DC in raccolte iLN, milza e mLN di analisi, sospensioni unicellulari di questi tessuti sono macchiate con anticorpi coniugati fluorescenza come DC-specifici marcatori e molecole costimolatorie istocompatibilità complesse molecole e analizzati tramite flusso cytometry.
<ol><li>
Preparazione di sospensioni unicellulari: milza
	<ol>
<li>Aggiungere 5 mL di terreno di coltura fresco (CM) nella piastra di coltura di 6 mm e mettere i campioni sul ghiaccio.</li>
		<li>Rimuovere i tessuti circostanti di sangue e grasso e posizionare il tessuto nel coperchio della piastra di coltura.</li>
		<li>Tagliare i tessuti in piccoli frammenti (< 1 mm) con forbici curve. Sospendere i frammenti in PBS seguita da filatura giù il tessuto utilizzando una centrifuga a 646 × g per 5 min e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Sospendere i campioni ancora in 3 mL di CM e digerire i frammenti con 200 µ l di soluzione di 2% siero bovino fetale (FBS) completato con collagenasi IV per 20 min.</li>
		<li>Agitare delicatamente e incubare il campione a 37 ° C per 1 h. filtro tessuti digeriti attraverso rete di nylon (100 nm) e la loro rotazione verso il basso. Lavare le singole cellule in 5 mL di PBS e rimuovere il surnatante mediante centrifugazione.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 5 mL di soluzione di isolamento delle cellule. Ri-caricare un altro strato di 5 mL di soluzione di isolamento di cellule chiare per formare uno stack strato dopo strato acquoso.</li>
		<li>Centrifugare la preparazione delle cellule a 2012 × g per 10 min. Ottieni il surnatante, che è la frazione più leggera di densità (< 1,077 g/cm3), per analisi di citometria a flusso successivo.</li>
		<li>Contare il numero di cellule con un emocitometro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di sospensioni unicellulari: linfonodo
	<ol>
<li>Seguire il passo 5.1.1-5.1.2.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di CM usando una pipetta da 10 mL per sospendere le cellule pipettando 3 - 4 volte. Dopo la sospensione del accuratamente le celle, utilizzare maglia di nylon sterile per filtrare le celle per la raccolta in una provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Gira le cellule giù a 646 ×g per 7 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere un ulteriore 5 mL di CM nel dispensare 10 mL di meglio sospendere le cellule pipettando.</li>
		<li>Lavate con PBS e contare il numero di cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di citometria a flusso
	<ol>
<li>Aliquota di 0,5-1 × 106 celle in ogni cella di fluorescenza-attivato l'ordinamento tubo (FACS).</li>
		<li>Centrifugare a 646 × g a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 5 µ l di ogni diluito fluorescenza-coniugato anticorpo preparazione alle celle per risospendere il pellet cellulare e vortexare. Nota: È importante proteggere il pellet cellulare da esposizione alla luce per quanto possibile, perché gli anticorpi fluorescente contrassegnati sono sensibili alla luce. Generare un mix master anticorpo e sempre aggiungere blocco Fc.</li>
		<li>Preparare il tampone di FACS usando 100 µ l di PBS, 1% di FBS regolari inattivati e 0,1% di sodio azide.</li>
		<li>Collocare il campione nel tubo a 4 ° C per 30 min. Sciacquare le cellule con 2-4 mL di FACS buffer e centrifugare il campione a 1700 rpm per 7 min a 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 500 µ l di tampone di FACS al buio. Analizzare le cellule tramite flusso cytometry.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Preparation+of+dodecynyl+modified+DNA+nanoparticles+with+unmethylated+CpG+adjuvant+and+ovalbumin+for+immunostimulation%22">Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation</a>. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).</li>
<li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li>
<li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li>
<li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.7b00440">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li>
<li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li>
<li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li>
<li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://staff.unimelb.edu.au/__data/assets/pdf_file/0009/1974339/STANDARD-Anaesthesia-for-mice-and-rats-FINAL.pdf">General anesthesia of mice and rats</a>. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22">Guidelines for the Euthanasia of Animals</a>. , Veterinary Record. (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10215/compound-administration-iii">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nri1669">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Molti progressi nella nanotecnologia e immunologia sono stati raggiunti attraverso ricerca terapeutica della somministrazione di farmaci e immunostimolazione. Un'attenta selezione del metodo di iniezione è conosciuta per essere importante per immunostimolazione, che era l'obiettivo del presente studio.
Itinerari di iniezione differenti sono stati valutati per un naturalmente non tossici e biodegradabile basati sul DNA materiale, INP (immunostimulatory delle nanoparticelle), per determinare qua...

Progressi in immunologia e nanomateriali hanno portato ad un'abbondanza di nuove strategie terapeutiche potenziali per applicazioni nel campo della biomedicina, tra cui immunostimolazione e consegna della droga. Ottimizzazione della via di somministrazione è un aspetto fondamentale che influenzano l'efficacia degli agenti immunostimulatory. Una nanoparticella di immunostimulatory (INP) costituito da DNA è un nuova concezione adiuvante di nano-immunitario auto-assemblato da microphase separazione a causa della struttura anfifilica di lipido-DNA1. Di conseguenza, protocolli per INP che coinvolge amministrazione del materiale1 in vivo tramite percorsi diversi e tre procedure per la raccolta di tessuti appropriati come il linfonodo inguinal (iLN), LN (mLN) mediastinica e la milza, sono descritto. Infine, questi tessuti sono stati analizzati per l'attivazione delle cellule dendritiche (DC), le cellule presentanti l'antigene più potente del sistema immunitario. Questo protocollo può essere applicato anche per la valutazione di antigeni, anticorpi o altri adiuvanti immuni2.
Abbiamo testato la formulazione INP perché è un agente che ha mostrato grande promessa. INP è un recettore Toll-like 9 (TLR9) materiale ausiliario che contiene acidi nucleici, per la cui valutazione di immunostimolazione efficacia è necessario verificare iniezione differenti metodi3. In questo contesto, la stimolazione di DCs è un potente endpoint per la valutazione in vivo . Dopo molecole dell'antigene o immunostimulatory phagocytosed dal DCs in tessuti periferici o sangue, queste cellule migrano verso organi linfoidi come la milza e LNs4,5. Così, attivazione delle DC è stato analizzato in milza, iLN e mLN degli animali iniettati. Pertanto è anche cruciale per valutare la risposta immunitaria ad un romanzo di adiuvante o agenti patogeni5correttamente la raccolta di questi tessuti. Tale raccolta di tessuto è anche importante per lo sviluppo di una nuova metodologia immunologica come terapia del cancro. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per verificare l'efficacia di altri farmaci, come il virus dell'immunodeficienza umana terapeutica6.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr>soluzione <tr><td>salina tampone fosfato</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td>Lavaggio organi</td></tr> <tr><td>(PBS, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>soluzione di isoflurano&nbsp;</td><td>Aesica Queenborough limited</td><td>26675-46-7</td><td>Processo di anestesia</td></tr><tr><td>Siringa tubercolina da 1 ml -</td><td>Junglim</td><td>N/A</td><td>Iniezione</td></tr><tr><td>50 ml di tubo conico&nbsp;</td><td>SPL</td><td>50050</td><td>Processo di anestesia</td></tr><tr><td>Siringa da insulina da 1 ml&nbsp;</td><td>(BD Ultra-FineTM&shy;II)_short ago</td><td>324826</td><td>Iniezione intramuscolare</td></tr><tr><td>DMEM Hyclone ad alto contenuto di glucosio</td><td></td><td>SH30081.01</td><td>Conservazione degli organi</td></tr><tr><td>Istopaco</td><td>&nbsp; Analisi Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Alcool etilico anidro 99,5 %&nbsp;</td><td>Daejung</td><td>4022-4110</td><td>Disinfettante</td></tr><tr><td>Attrezzature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FineCycler C100 (Termociclatore)</td><td></td><td>Centrifuga</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> di ricottura ssufine <td></td></tr><tr><td>Centrifuga tubo FACS&nbsp;</td><td>FALCON</td><td>2052</td><td>FACS analysis</td></tr><tr><td>Citometro a flusso automatizzato ad alte prestazioni</td><td>BD (USA), FACSVerse-FACS</td><td></td> <td>analysis</td></tr></tbody></table>

valutazione immunostimulatory agente: attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione route-dipendente delle cellule dendritiche

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Per la valutazione di un nuovo agente terapeutico per l'immunoterapia o la vaccinazione, analisi di attivazione delle cellule immuni in tessuti linfatici è essenziale. Qui, abbiamo studiato gli effetti immunologici di un immunostimolante di romanzo del lipido-DNA in forma di nanoparticelle da vie di somministrazione differenti nel topo: orale, intranasale, sottocutanea, zampa, intraperitoneale ed endovenosa. Queste iniezioni influenzerà direttamente la risposta immunitaria e la raccolta dei tessuti linfatici e analisi dell'attivazione delle cellule dendritiche (DC) nei tessuti sono parti cruciali di queste valutazioni. L'estrazione dei linfonodi mediastinici (mLNs) è importante ma abbastanza complessa a causa della dimensione e la posizione di questo organo. È descritta una procedura graduale per la raccolta il linfonodo inguinal (iLN), mLN e la milza e l'analisi di attivazione delle DC tramite flusso cytometry.

Per valutare percorsi appropriati iniezione di INP per l'attivazione del tessuto linfatico DC, la popolazione di DC come lignaggio è stata definita ---CD11c+ cellule nella milza, iLN e mLN e analizzati i livelli di espressione di molecole costimolatorie. Trattamento di INP iniezione endovenosa (i.v.) e sottocutanea (s.c.) ha promosso gli aumenti sostanziali nell'espressione CD40, CD80 e CD86 in milza e iLN DCs (Figura 2B</strong...

Procedure sperimentali per l'estrazione successiva di tessuti linfatici per testare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi sono descritti dopo il trattamento di un nanomateriale immunostimulating.

Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di familiarizzare con la tecnica unica richiesta per isolare il linfonodo mediastino dai topi. L'operazione è stata condotta dopo aver iniettato materiale immunostimolante su sei diverse vie nei topi. In questo studio, abbiamo usato una nuova classe di materiali che formano strutture di dimensioni nanometriche.I tensioattivi sono costituiti da gruppo testa idrofila e coda idrofobica. Questi formano micelle sferiche o altra struttura secondaria a causa della separazione dei microfagi. Abbiamo utilizzato questa proprietà per una bio macromolecola che è il DNA.L'anfifilo del DNA, mostrato qui, come nucleotidi regolari come A, C, G, T, ha blocchi idrofili mentre le nucleobase neuro-cellulari modificate lipidiche agiscono come unità idrofobiche. L'oligo modificato è stato sintetizzato dal sintetizzatore DNA in ottogrammi su larga scala. Negli equi-media i DNA lipidici anfifili formano spontaneamente micelle sferiche di dimensioni nanometriche.Quando si forma la micelle, il DNA rimane mono-filamento come vettore vuoto con circa 10 nanometri di diametro. Per dotare il vettore di immuno-stimolante, è semplice estendere la sequenza del DNA con recettore a pedaggio nove coadiuvanti vale a dire eCpG. Dna lipidico e base eCpG qui quindi la superficie esterna della micella viene degradata con sequenza CpG.Quindi chiamiamo questa nanoparticcella immuno-stimolante come INP. Per determinare il modo corretto degli INP per la risposta immunitaria abbiamo iniettato INP ai topi in 64 vie di iniezione e di conseguenza è stato analizzato un tessuto linfonodo adeguato. Per istruzioni di iniezione più dettagliate si prega di trovare un articolo JOB pubblicato da Charles River nel 2012.Il vantaggio principale di questo video è mostrare visivamente come ottenere il linfonodo mediastino. Il video mostra esplicitamente la posizione del linfonodo mediastino che molte persone trovano difficoltà nell'isolare gli organi. Tutti gli esperimenti sono stati condotti sotto le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee presso lo Shanghai Public Health Clinical Center, o University of Ulsan College of Medicine.Questa parte mostrerà la posizione specifica di organi o tessuti, che sono cruciali per l'analisi immunologica. Milza e due linfonodi saranno isolati. Prima di tutto, i topi sono stati sacrificati dall'eutanasia per inalazione di anidride carbonica e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza come segue la guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.D'ora in poi troviamo gli organi e li isoliamo. Per prima cosa, fissare correttamente il mouse sulla scrivania operativa con quattro perni sul palmo del mouse. Sterilizzare l'area di dissezione con alcol.Sezionare la copertura esterna del fondo dell'addome del topo con una forbice di grandi dimensioni. Utilizzare le pin per aprire entrambi i lati dell'attacco e fissarlo con i perni sul tavolo operatorio. La posizione del linfonodo inguinale è esposta trovando la congiunzione del vaso che scende verso la gamba sinistra.La forma del vaso sembra la lettera dell'alfabeto inclinato Y.Scopri lo strato con le forcep e tiralo dalla pelle. Tagliare il peritoneo con forbice più piccola per esporre gli organi interni. Spostare l'intestino a destra usando le forcep e quindi avvolgere la milza sagomata, che mostra sul lato sinistro, superiore sinistro dell'addome.È necessaria un'ulteriore attenzione durante la procedura poiché la milza è facile da interrompere. Infine il punto chiave di questo video: raccolta del linfonodo mediastino. Si trova sotto il lato superiore del polmone, che è difficile da vedere a causa delle sue piccole dimensioni e della posizione un po 'nascosta.Esporre attentamente l'area utilizzando piccole forbici e forcep. Tagliare entrambi i lati delle nervature e anche il diaframma. Ritagliare le costole tagliate sopra il petto.Durante la procedura evitare di danneggiare il cuore e i vasi sanguigni poiché potrebbe accecare il sito, trovando il linfonodo mediastinico traslucido. Se per caso il vaso sanguigno scoppia, pulire delicatamente il sangue con una garza. Afferrare il lato sinistro del polmone e girarlo dolcemente dall'altra parte per vedere sotto il polmone.Tirare su il linfonodo mediastino usando le forcep. Dopo aver raccolto il linfonodo mediastino, assicurarsi di rimuovere perfettamente tutto il grasso e il sangue che circondano il linfonodo poiché il tessuto indesiderato può influenzare l'analisi. Infine, tutti gli organi isolati su una piastra di Petri piena di media.Totale 0,1 per 10 alla sesta cellule sono state analizzate su questa citometria del flusso. In base al getter di forza e alle dimensioni, la popolazione di leucociti getter fu recinta e le cellule furono escluse dalla colorazione scura. 24 ore dopo l'iniezione in INP per 64 vie di iniezione, milza, linfonodo inguinale e linfonodo mediastinico sono stati raccolti e analizzati l'attivazione CC per citometria del flusso.Sulla base della strategia della citometria del flusso, la popolazione DC è stata definita come cellule positive cd11C e negative di lignaggio nel leucocita vivo. In particolare, l'iniezione intranasale di INP ha promosso aumenti significativi nell'espressione CD40, 80, 86 nel linfonodo mediastino rispetto al PBS per il controllo. Pertanto, questi dati hanno suggerito che l'iniezione intranasale di INP può essere utilizzata come coadiuvante mucoso per il miglioramento dell'immunità nel polmone.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra un metodo per convertire le cellule dendritiche (DC) in DC tollerogeniche (TolDCs) utilizzando un agente farmacologico immunomodulatore. Questa conversione è confermata dalla valutazione della funzione di TolDC attraverso il loro effetto immunosoppressivo sulle cellule T CD4+.

Effetto di un agente farmacologico immunomodulatore sull'interazione tra cellule dendritiche e cellule T CD4+

Il metodo più comunemente utilizzato per generare un elevato numero di cellule dendritiche autologhe (DC) per uso in immunoterapia tumore è descritto. Il metodo utilizza IL-4 e GM-CSF per differenziare DC da monociti. Le DC immature sono stimolati a maturo e poi caricato con antigeni prima di essere iniettati nel paziente.

Preparazione del Tumor Antigen-caricati mature cellule dendritiche per l&#39;immunoterapia

Vaccinazione profilattica e terapeutica spesso non riesce a stimolare forti risposte immunitarie dovuto settimana drenaggio del vaccino ai linfonodi e conseguente scarsa coinvolgimento delle cellule immunitarie. Mediante iniezione diretta di vaccino da linfonodi, cosiddetta iniezione endolinfatica, l'efficacia del vaccino può essere fortemente migliorata e dosi di vaccino può essere ridotta.

Endolinfatica immunoterapia e di vaccinazione nei topi

Le cellule dendritiche immature possono essere differenziate selettivamente in cellule dendritiche tolleranti o mature per regolare l'equilibrio tra immunità e tolleranza. Questo lavoro presenta un mezzo per generare da cellule dendritiche immature derivate da monociti (moDC), moDC in vitro tollerogeniche e mature che differiscono nei fenotipi metabolici.

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Monocito-derivate DC (MoDC) può percepire la minor quantità di molecole associate al pericolo e sono pertanto facilmente innescato. Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di MoDC da sangue e tumori e la loro attivazione con complessi immuni evidenziando le principali precauzioni che dovrebbero essere considerate al fine di evitare loro attivazione prematura.

Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

Qui presentiamo un'applicazione per una tecnica immunologica standard (CFSE macchiato OT-ho proliferazione) destinato a monitorare rapidamente adiuvante-mediata di linfociti T citotossici (CTL) generazione in vivo. Questa veloce stima delle capacità CTL è utile per lo sviluppo di vaccini profilattici contro patogeni intracellulari, come pure i vaccini terapeutici del cancro.

Rapida In Vivo valutazione della funzionalità di generazione i linfociti T citotossici di adiuvante per lo sviluppo di vaccini

Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare e caratterizzare le cellule dendritiche tollerogeniche (TolDCs) e valutare la loro utilità di immunoterapia.

Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione in vivo dell'ingenuo T CD4 delle cellule (cellule T) attivazione, proliferazione e differenziazione Th1, indotta da GM-CSF midollo osseo (BM)-derivato le cellule dendritiche (DCs). Inoltre, questo protocollo descrive isolamento BM e T-cell, generazione di DC e DC e T-cell trasferimento adottivo.

Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

Il dispositivo di transimmunizzazione (TI) o la piastra e i relativi protocolli sono stati sviluppati per replicare le caratteristiche chiave della fotochemioterapia extracorporea (ECP), in un ambiente sperimentale, permettendo la produzione di fisiologicamente attivato, Tunable dendritico cellule (DCs) per l'immunoterapia oncologica.

Nuovo protocollo per la generazione di cellule dendritiche fisiologiche immunogene

La metodologia descrive la generazione di cellule dendritiche derivate da monociti bovini (MoDC) e la loro applicazione per la valutazione in vitro di candidati antigenici durante lo sviluppo di potenziali vaccini veterinari nei bovini.

Determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini

Descriviamo una procedura per valutare la capacità degli agenti farmacologici di generare cellule dendritiche tollerogeniche da cellule dendritiche naive derivate da monociti in vitro e convalidare la loro potenza mediante la generazione di cellule T regolatorie autologhe.

Un metodo semplice ed efficiente per testare gli agenti immunomodulatori per la generazione di cellule dendritiche tollerogeniche da monociti CD14+ umani

Impara l'isolamento dei linfonodi mediastinici nei topi per valutare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi dopo l'iniezione di nanomateriali immunostimolanti. Questa tecnica chirurgica consente analisi precise del sistema immunitario.

Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche (Video) | JoVE Journal

Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche

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