Name: Efficiente generazione di Pancreas/duodeno Homeobox Protein 1+ posteriore del Foregut/pancreatico progenitori da hPSCs nelle culture di adesione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri come generare progenitori pancreatici PDX1+ da hPSC in coltura adesiva monostrato. Questo metodo garantisce popolazioni cellulari omogenee per studi di biologia dello sviluppo pancreatico.

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Questo lavoro è stato in parte sostenuto da finanziamenti della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) attraverso Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 e 18 K 08510) al T.T. e sovvenzione per assegnisti di ricerca pagine JSP (Javaserver KAKENHI Grant numero 17J07622) di A.K. e l'Agenzia giapponese per la ricerca medica e sviluppo (AMED) attraverso la sua ricerca concedere "Core Center for iPS Cell ricerca, centro di ricerca rete per realizzazione di medicina rigenerativa" per K.O. Gli autori ringraziano il Dr. Peter Karagiannis per leggere il manoscritto.

Gli esperimenti usando hPSCs sono stati approvati dal comitato etico del dipartimento di medicina e Graduate School of Medicine, Università di Kyoto.
1. preparazione dei materiali
Nota: Preparare tutti i terreni e reagenti per colture cellulari in ambiente sterile. Caldo a base di coltura a temperatura ambiente (TA) prima dell'uso. Medio per differenziazione viene utilizzata all'interno di 6 h a RT. dettagli dei reagenti elencati nella Tabella materiali.
<ol><li>
Differenziazione (Figura 1A)
	<ol>
<li>Stage 1A medio: trasferimento medium RPMI 1640 in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento senza siero, activina A, CHIR99021 e Y-27632 a una concentrazione di 1 x, 100 ng/mL, 3 μM e 10 μM, rispettivamente.</li>
		<li>Stage 1B medio: trasferimento medium RPMI 1640 in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento senza siero, activina A e CHIR99021 a una concentrazione di 1 x, 100 ng/mL, ≤ 1 μM, rispettivamente. Nota: La concentrazione di CHIR99021 deve essere inferiore a Stage 1A medio e aggiunta non è necessaria, ma aumenta il numero di cellulare.</li>
		<li>Stage 2 medio: medio di trasferimento migliorato MEM (iMEM) in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento privo di siero e il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) ad una concentrazione di 0,5 x e 50 ng/mL, rispettivamente.</li>
		<li>Stage 3 medio: mezzo di iMEM di trasferimento in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento senza siero, KGF, NOGGIN, 3-cheto-N-amminoetil-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) e acido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) mediante pipetta per concentrazioni di 0.5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM e 10 nM, rispettivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Citometria a flusso (FCM)
	<ol>
<li>Permeabilizzazione/lavaggio 1X: trasferire l'acqua in un tubo mediante una pipetta. Aggiungere tampone di permeabilizzazione/lavaggio mediante una pipetta ad una concentrazione di 1 x.</li>
		<li>FCM soluzione bloccante: trasferire Permeabilization/lavaggio 1X in una provetta mediante una pipetta. Aggiungere asino siero mediante una pipetta ad una concentrazione del 2% (vol/vol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining
	<ol>
<li>Soluzione bloccante: Phosphate-Buffered Saline (DPBS di trasferimento Dulbecco) in un tubo mediante una pipetta. Aggiungere siero asino e Triton X mediante pipetta a concentrazioni di 5% (vol/vol) e 0,4% (vol/vol), rispettivamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hPSC differenziazione ai progenitori di cellule/pancreatico posteriore del Foregut (PDX1 cellule+ )
Nota: Effettuare tutte le procedure usando tecniche sterili. hPSCs sono mantenuti su piastre da 6 pozzetti rivestite da un materiale di superficie sintetico per hPSCs con hPSC mezzo di manutenzione secondo le istruzioni17,26 del produttore. Quando le cellule di raggiungere confluency di 50-80% (stadio 0) li usano per differenziazione.
<ol><li>
Preparare della membrana dello scantinato piastre rivestite con matrice.
	<ol>
<li>Trasferimento 6 mL di RPMI 1640 (4 °C) in una provetta raffreddata a 4 °C sul ghiaccio. Aggiungere 2 mg di matrice della membrana basale (4 °C) con 1 mL-puntali per pipette raffreddato e mescolare bene di pipettaggio delicato per rendere la matrice della membrana basale di 0,33 mg/mL.</li>
		<li>Trasferire 2 mL di matrice della membrana basale diluito in ciascun pozzetto di piastre per colture cellulari a 6 pozzetti mediante una pipetta. Posizionare le piastre a 37 °C per 60-90 min in un'incubatrice. In seguito, tenere le piastre a temperatura ambiente fino all'utilizzo (all'interno di 3 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
L'hPSCs di semi e avviare la differenziazione di endoderma definitivo (1A tappa).
	<ol>
<li>Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di 0.5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (RT) per pozzetto mediante pipetta per lavare l'hPSCs coltivati nelle piastre 6 pozzetti.</li>
		<li>Aspirare 0,5 mM EDTA e aggiungere 2 mL di 0.5 mM EDTA per pozzetto mediante pipetta. Incubare le piastre a 37 °C per 5 min.</li>
		<li>Aspirare 0,5 mM EDTA e aggiungere 1 mL di mezzo di manutenzione hPSC presso RT completati con 10 μM Y-27632 per bene dalla pipetta. Pipettare delicatamente ma rapidamente per soffiare via la cellule allegate sulle piastre e dissociare le cellule ragruppate in singole celle. Non bolla sospensione delle cellule durante il pipettaggio.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 50 mL contenente 4 mL di mezzo di manutenzione hPSC presso RT completati con 10 μM Y-27632. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare.</li>
		<li>Contare il numero di cellule in sospensione delle cellule usando la procedura di esclusione del Trypan Blue macchia.<ol>
<li>Mix 15 µ l di sospensione cellulare e 15 μL di Trypan blu in un tubo.</li>
			<li>Trasferire 10 μL della sospensione delle cellule diluita con Trypan Blue su cella contando diapositive in duplicato mediante una pipetta da 10 μL.</li>
			<li>Contare la cella numero con un contatore di cellule automatico e calcolare la densità delle cellule in sospensione delle cellule. Vitalità è di solito > 98%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquotare la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 50 mL a 1-1,5 x 106 cellule per pozzetto di piastre da 6 pozzetti (1-1.5 x 105 cellule/cm2).</li>
		<li>Centrifugare la provetta 50 mL a 200 x g per 5 min a RT.</li>
		<li>Aspirare il surnatante con una pipetta e risospendere le cellule con 1 mL di terreno di 1A fase (RT) per pozzetto. Delicatamente Pipettare la sospensione cellulare e aggiungere un altro 1 mL di mezzo di fase 1A (totale, 2 mL per pozzetto).</li>
		<li>Aspirare la matrice della membrana dello scantinato diluiti nei pozzetti delle piastre di coltura cellulare preparate al punto 2.1.2 mediante una pipetta μL 1.000. Procedere al passaggio successivo immediatamente.</li>
		<li>Delicatamente dispensare la sospensione di eritrociti nel passaggio 2.2.8 nuovamente. Immediatamente dopo la miscelazione, trasferire la sospensione cellulare (2 mL) in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggere la piastra dalla luce. Collocare la piastra nel banco pulito a temperatura ambiente per 10-15 min. Nota: Non spostare la piastra dopo la semina.</li>
		<li>Posizionare delicatamente la piastra in un 37 °C, 5% CO2 incubator (atmosfera umidificata) e cultura per 24 h. Nota: Non agitare la piastra dopo la semina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Indurre la differenziazione in endoderma definitivo (fase 1B).
	<ol>
<li>Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS ai pozzetti mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta. Nota: Per rimuovere eventuali cellule morte da strato monomolecolare, scuotere delicatamente la piastra prima di ogni aspirazione.</li>
		<li>Aspirare il DPBS usato mediante una pipetta e aggiungere 4 mL di Stage 1B medio (37 °C) per pozzetto. Posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore a 37 °C (atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 48 h.</li>
		<li>Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta. Nota: Rimuovere le cellule morte dal monostrato di agitazione delicata prima di ogni aspirazione.</li>
		<li>Aspirare il DPBS usate mediante pipetta e aggiungere 4 mL di Stage 1B medio (37 °C) per pozzetto. Posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore (37 °C, atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Indurre il differenziamento nel tubo dell'intestino primitivo (fase 2).
	<ol>
<li>Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta. Nota: Rimuovere le cellule morte dal monostrato di agitazione delicata prima di ogni aspirazione.</li>
		<li>Aspirare il DPBS usate mediante pipetta e aggiungere 4 mL di terreno di fase 2 (37 °C) per pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 4 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Indurre il differenziamento in PDX1+ cellule (fase 3).
	<ol>
<li>Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.</li>
		<li>Aspirare il DPBS usate mediante pipetta e aggiungere 4 mL di terreno di fase 3 (37 °C) per pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 3 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Indurre la differenziazione in cellule endocrine del pancreas.
	<ol>
<li>Eseguire induzione di cellule NKX6.1+ (fase 4, per 8 giorni) seguita da induzione endocrina delle cellule (fase 5, per 12 giorni) con protocolli precedentemente descritti3,16,26. Caratterizzano e convalidare la differenziazione endocrina delle cellule di immunostaining e analisi quantitativa in tempo reale trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena (qRT-PCR). Nota: Fare riferimento alla Toyoda et al.16 e Kimura et al.26 per dettagliate procedure sperimentali. Consultare la tabella 1 per sequenze primer utilizzate per analisi qRT-PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. citometria di flusso (FCM)
<ol><li>Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di 0.5 mM EDTA al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di 0,5 mM EDTA una volta. Nota: Agitare la piastra delicatamente per rimuovere eventuali cellule morte dalle cellule dello strato monomolecolare prima di ogni aspirazione.</li>
	<li>Per dissociare le cellule (circa 3-6 × 106 cellule per pozzetto), aggiungere 2 mL di 0,25% tripsina contenente 0,5 mM EDTA per pozzetto. Incubare le piastre a 37 °C per 5-10 min.</li>
	<li>Pipettare delicatamente ma rapidamente a dissociare le cellule di ragruppata in singole celle. Non bolla sospensione delle cellule durante il pipettaggio.</li>
	<li>Aggiungere 8-10 mL di terreno base (RPMI 1640 o iMEM, RT) contenente 0,5 x integratore privo di siero e 10 μM Y-27632 per bene e mescolare la sospensione cellulare. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min a RT.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere le cellule con 2 mL di 0.5 mM EDTA (RT). Pipettare delicatamente la sospensione cellulare.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min a RT.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere le cellule con 100 μL di tampone di fissazione e permeabilizzazione per 106 cellule sotto una cappa. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare sotto una cappa. Tenere il tubo a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 min a RT.</li>
	<li>Aspirare il supernatante sotto un cofano e risospendere le cellule con 500 μL di soluzione di FCM blocco per 106 cellule. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare. Tenere il tubo a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	<li>Trasferire 50 μL della sospensione delle cellule in una provetta (circa 1 x 105 cellule). Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 100 µ l di anticorpo primario diluito (Vedi Tabella materiali) in FCM soluzione di blocco e incubare a 4 °C per > 16 h.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 180 μL di tampone di lavaggio/Perm 1x.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 100 µ l di anticorpo secondario diluito (Vedi Tabella materiali) in FCM soluzione bloccante. Incubare le cellule a RT per 60 min o a 4 °C per > 16 h con protezione dalla luce.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 180 μL di tampone di lavaggio/Perm 1x.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 180 μL di siero asino 2% in DPBS.</li>
	<li>Filtrare la sospensione cellulare trasferendo un 5 ml provetta polistirolo con un filtro cella (rete di nylon 35 µm) e conservare a 4 °C con protezione dalla luce fino all'analisi.</li>
	<li>Analizzare una percentuale di cellule marcate positivamente da un cytometer di flusso27.</li>
</ol>4. Immunostaining
<ol><li>Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta. Nota: Scuotere delicatamente la piastra per rimuovere eventuali cellule morte dalle cellule dello strato monomolecolare prima di ogni aspirazione.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) (4 °C) per pozzetto mediante pipetta sotto una cappa. Tenere la piastra a 4 °C per 20 min.</li>
	<li>Rimuovere il PFA pipetta sotto una cappa. Aggiungere 2 mL di DPBS presso RT al pozzo mediante pipetta sotto una cappa. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di soluzione bloccante per pozzetto e tenere la piastra a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	<li>Aspirare la soluzione usata e aggiungere 1 mL di anticorpo primario (Vedi Tabella materiali) nella soluzione per pozzetto di blocco. Incubare a temperatura ambiente per 60 min o a 4 °C per > 16 h.</li>
	<li>Aspirare la soluzione usata, aggiungere 2 mL di DPBS contenente 0,4% Triton X-100 e incubare a + RT 10 min ripetere l'aspirazione, aggiunta di soluzione e incubazione una volta.</li>
	<li>Aspirare la soluzione usata e aggiungere 1 mL di anticorpo secondario (Vedi Tabella materiali) nella soluzione per pozzetto di blocco. Incubare a temperatura ambiente per 60 min con protezione dalla luce.</li>
	<li>Aspirare la soluzione usata, aggiungere 2 mL di DPBS contenente 0,4% Triton X-100 (RT) e incubare a temperatura ambiente per 5 min con protezione dalla luce. Ripetere l'aspirazione, aggiunta di soluzione e incubazione due volte.</li>
	<li>Prendere micrografie per esaminare l'efficacia di differenziazione sotto un microscopio di fluorescenza28.</li>
</ol>

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<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).</li>
<li>Hohwieler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+acinar%2Fductal+organoids+generate+human+pancreas+upon+orthotopic+transplantation+and+allow+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling.</a> Gut. 66 (3), 473-486 (2017).</li>
<li>Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endodermal+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+insulin-producing+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture.</a> Scientific Reports. 4, 4488(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La generazione di PDX1+ cellule è composto da più passaggi; Pertanto, è fondamentale per il trattamento di cellule al momento opportuno. Tra i passaggi, l'efficienza di induzione dell'endoderma definitivo colpisce in gran parte l'efficienza finale induzione, possibilmente da interferenze provenienti da altre cellule lignaggio contaminanti (cioè, mesoderma ed ectoderma), che possono proliferare e/o secernono fattori che compromettere la differenziazione specifica. Se la proporzione di SOX17+ cellule ...

Il pancreas è costituito principalmente da cellule esocrine ed endocrine, e sua disfunzione o sovraccarico provoca diverse malattie, come la pancreatite, diabete e cancro del pancreas. Per delucidare il pathogeny di fibrocalcolosa, è necessario analizzare il processo di sviluppo e la funzione delle cellule pancreatiche. Inoltre, per stabilire la terapia di supplementazione di cellule/tessuti è necessaria una fornitura di cellulari stabili con qualità robusta. Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule pancreatiche derivate sono una promettente fonte di cellule per questi scopi, e il protocollo di differenziazione verso le cellule del pancreas è stato intensamente studiato1,2,3, 4. Gli avanzamenti recenti nella generazione in vitro di cellule β del pancreas imitano la generazione di cellule β in adulto umano e queste cellule Visualizza efficacia terapeutica su impiantati in topi diabetici modello2,3. Inoltre, l'analisi delle cellule β generate dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di sano di tipo 1 diabete paziente donatori ha rivelato nessuna differenza funzionale tra cui quando sotto stress5. Inoltre, i fenotipi di malattia sono stati riprodotti parzialmente in cellule pancreatiche indotte con iPSCs derivate dal paziente o hPSCs che harboring le mutazioni genetiche nello stesso sito come pazienti6,7.
Per generare le cellule pancreatiche da hPSCs, graduale differenziazione diretto che ricapitola i processi di sviluppo viene utilizzata. Il pancreas è derivato dallo strato endoderma dell'embrione precoce, che esprime il sesso che determina regione Y-box 17 (SOX17) e forkhead box A2 (FOXA2)8. Basato sugli studi del mouse, lo strato endodermico forma il tubo dell'intestino primitivo, che è contrassegnato dall'espressione dell'epatocita fattore nucleare 1 beta (Hnf1β) e dell'epatocita nucleare di fattore 4-alfa (Hnf4α). Il tubo dell'intestino primitivo si allunga e si sviluppa nell'apparato respiratorio, digerente e organi. Dopo l'allungamento, la zona posteriore del foregut diventa la regione pancreatica presuntiva, come indicato dall'espressione della proteina fattore trascrizionale pancreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. Le parti dorsali e ventrali della PDX1+ gut tubo addensare a formare cime del pancreas, che sono segnati dalla co-espressione del pancreas trascrizione fattore 1 subunità alfa (PTF1A) e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Questa espressione segna l'inizio morfologico dell'organogenesi pancreatica. Cellule pancreatiche endoderma, che sono componenti delle gemme del pancreas, formano una rete ramificata tubolare di strutture epiteliali12 e alla fine differenziarsi in cellule esocrine ed endocrine, tra cui β-cellule secernenti insulina e che secernono glucagone α-cellule. Espressione di PDX1 viene rilevato in primo luogo alla regione pancreatica presuntiva, che poi è osservata durante l'intero sviluppo del pancreas e Mostra la localizzazione di cellule β - e δ-9,13,14. Anche se il Pdx1+ zona delle cellule che non esprimono Ptf1a o Nkx6.1 differenzia in antrum gastrico, del duodeno, dei dotti biliari extrahepatic e alcune cellule intestinali a metà alla fine della fase di sviluppo in topi9, PDX1+ le cellule sono considerate i progenitori del pancreas nella fase iniziale dello sviluppo negli esseri umani.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziarsi hPSCs in PDX1+ cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas. La differenziazione di iniziati di protocollo da semina dissociato celluli15,16,17. In genere, indifferenziato hPSCs sono mantenuti come colonie o aggregati cellulari in sospensione o in adesione. Di conseguenza, la maggior parte dei protocolli avviare la differenziazione poco dopo il passaggio. Tuttavia, nello stato di colonie o aggregati, le cellule sono inclini a eterogeneità spaziale e trascrizionale18,19,20,21,22, che potrebbero ostacolare la primo passo di differenziazione verso l'endoderma definitivo seguita da differenziazione inefficiente per PDX1+ cellule. Il presente protocollo può offrire maneggevolezza per migliorare e stabilizzare l'efficienza di differenziazione di alcune linee di hPSC che precedentemente sono stati trovati per differenziare inefficacemente endodermici lignaggi e PDX1+ cellule23, 24 , 25.

<table><tbody><tr><td>acido 3-cheto-N-amminoetil-N&prime;-amminocaproyldiidrocinnamoilciclopamina</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>K171000</td><td>CYC</td></tr><tr><td>4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetraidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]-benzoico</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-203303</td><td>TTNPB</td></tr><tr><td>50 mL Provette da centrifuga sterili sterili coniche</td><td>in polipropilene Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CDX2 [EPR2764Y]</td><td>Abcam</td><td>Ab76541</td><td>Anti-CDX2, &volte; 1/1000 diluizione</td></tr><tr><td>B-27 Integratore (50 &volte;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>Integratore senza siero</td></tr><tr><td>BD FACSAria II Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Congelatore biomedico</td><td>SANYO</td><td>MDF-U538</td><td>Per -30 &deg; C per la conservazione</td></tr><tr><td>dei vetrini per il conteggio delle cellule per il contatore di cellule TC10/TC20, a doppia camera</td><td>BIO-RAD</td><td>1450011</td><td>Vetrino per il conteggio</td></tr><tr><td>PIASTRA MULTIPOZZETTO PER COLTURA CELLULARE, 6 POZZETTI, PS, TRASPARENTE</td><td>Greiner bio-one</td><td>657165</td><td>Per la coltura di differenziazione/piastra a 6 pozzetti</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>TOMY</td><td>AX-310</td><td>Per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>TOMY</td><td>MX-305</td><td>Per RT-qPCR</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>PANCA PULITA</td><td>SHOWA KAGAKU&nbsp;</td><td>S-1601PRV</td><td>Banco pulito</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Per colture senza alimentatore di hPSC/piastra a 6 pozzetti</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrice della membrana basale Fattore di crescita ridotto</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrice della membrana basale</td></tr><tr><td>Corning Synthemax II-SC Substrato</td><td>Corning</td><td>3535</td><td>Per colture senza alimentatore di hPSC/materiale sintetico di superficie per hPSC</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>Leica CM1510 S</td><td>Per l'immunocolorazione di aggregati.</td></tr><tr><td>Kit Cytofix/Cytoperm</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td>tampone Perm/Wash è&nbsp; Permeabilizzazione/Tampone di lavaggio. Il tampone Cytofix/Cytoperm è un tampone di fissazione e permeabilizzazione.</td></tr><tr><td>Dako pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Per l'immunocolorazione di aggregati</td></tr><tr><td>dNTP mix (10 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427-088</td><td>Per RT-qPCR</td></tr><tr><td>Asino anti-IgG di capra (H+L) Anticorpo secondario adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Anticorpo secondario, &volte; 1/500 diluizione Asino</td></tr><tr><td>anti-Topo IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td>Anticorpo secondario, &volte; diluizione 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio d'asino (H+L), Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Anticorpo secondario, & volte; diluizione 1/500</td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td>Siero d'asino</td></tr><tr><td>D-PBS(-) senza Ca o Mg</td><td>Nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Per colture senza alimentatore di hPSC/terreno di mantenimento hPSC</td></tr><tr><td>Provetta in polistirene a fondo tondo Falcon da 5 mL, con filtro cellulare Tappo a scatto</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL con filtro a celle</td></tr><tr><td>Puntale filtrante, 1.000 &; L</td><td>Watoson</td><td>124-1000S</td><td>Utilizzare insieme alle pipette Puntale</td></tr><tr><td>con filtro, 20 &; L</td><td>Watoson</td><td>124-P20S</td><td>Utilizzare insieme a pipette Puntale</td></tr><tr><td>con filtro, 200 &; micro; L</td><td>Watoson</td><td>124-P200S</td><td>Utilizzare insieme alle pipette</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td>Per l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 incubatore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370A</td><td></td></tr><tr><td>incubatore HNF-1&beta; Anticorpo (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7411</td><td>Anti-HNF1&beta;, &volte; 1/200 diluizione</td></tr><tr><td>HNF-4&alfa; Anticorpo (H-171)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8987</td><td>Anti-HNF4&alpha;, &volte; 1/200 diluizione</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Per la colorazione del nucleo, &volte; 1/200 diluizione</td></tr><tr><td>Pancreas umano RNA totale</td><td>Ambion</td><td>AM7954</td><td>Per RT-qPCR</td></tr><tr><td>Umano PDX-1/IPF1 Anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>Anti-PDX1, IgG di capra, &volte; 1/200 diluizione</td></tr><tr><td>Anticorpo umano SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>Anti-SOX17, &volte; diluizione 1/200</td></tr><tr><td>Zinco MEM migliorato Opzione media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>Camera di incubazione</td> iMEM <td>Cosmo Bio</td><td>10DO</td><td>Per l'immunocolorazione degli aggregati Guanti da</td></tr><tr><td>esplorazione in lattice</td><td>Adachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS rivestito vetrino</td><td>scorrevole Matsunami Glass</td><td>83-1881</td><td>Per immunocolorazione degli aggregati</td></tr><tr><td>MicroAmp Piastra di reazione veloce a 96 pozzetti</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 4346907</td><td></td> Per microscopio <td>RT-qPCR</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX41N-31PHP</td><td>Per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Microtubo</td><td>Watoson</td><td>131-515CS</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonale Anti-&alfa;-Fetoproteina</td><td>SIGMA</td><td>A8452</td><td>Anti-AFP, &volte; diluizione 1/200</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>per RT-qPCR</td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>FASMAC</td><td>Oligo su misura</td><td>Per RT-qPCR di sequenza è "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT</td></tr>"<tr><td>Paraformaldeide, polvere</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td>PFA, fissativo, diluito in DPBS</td></tr><tr><td>Frigorifero farmaceutico</td><td>SANYO</td><td>MPR-514</td><td>per 4 &deg; C stoccaggio</td></tr><tr><td>PIPETMAN P&nbsp;</td><td>GILSON</td><td></td><td>Pipetta</td></tr><tr><td>Umana Ricombinante KGF/FGF-7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td>KGF</td></tr><tr><td>Noggin umana ricombinante</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td>NOGGIN</td></tr><tr><td>Activina umana/topo/ratto ricombinante A</td><td>& D Systems</td><td>338-AC</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>ReverTra Ace (100 U/&mu; L)</td><td>TOYOBO</td><td>TRT-101</td><td>Per RT-qPCR</td></tr><tr><td>Set di DNasi senza RNasi (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>Per RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>Per RT-qPCR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-Gln</td><td>Nacalai tesque</td><td>30264-85</td><td>RPMI 1640</td></tr><tr><td>Pellicola sigillante per Real Time</td><td>Takara</td><td>NJ500</td><td>Per RT-qPCR</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche 10 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4488</td><td>Per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche 25 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4489</td><td>Per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche 5 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4487</td><td>Per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>3579S</td><td>Anti-SOX2, &volte; 1/200 diluizione</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientifico</td><td></td><td>per RT-qPCR</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td>Per immunocolorazione di aggregati</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II&nbsp;</td><td>Takara</td><td>RR820B</td><td>per RT-qPCR</td></tr><tr><td>TC20 Contatore di cellule automatizzato</td><td>BIO-RAD</td><td>1450101J1</td><td>Contatore di cellule automatico</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT composto 4583&nbsp;</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td>Per l'immunocolorazione di aggregati</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Stampi/Adattatori Sakura</td><td>Finetechnical</td><td>4566</td><td>Per l'immunocolorazione di aggregati</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>BIO-RAD</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore ultrafreddo</td><td>SANYO</td><td>MDF-U33V</td><td>Per -80 &deg; C che conserva</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>Diluire con DPBS per preparare 0,5 mM EDTA</td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>per RT-qPCR</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>251-00514</td><td></td></tr></tbody></table>

efficiente generazione di pancreas/duodeno homeobox protein 1+ posteriore del foregut/pancreatico progenitori da hpscs nelle culture di adesione

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule pancreatiche derivate sono una promettente fonte di cellule per la medicina rigenerativa e una piattaforma per lo studio di processi di sviluppo umani. Diretto graduale differenziazione che ricapitola i processi inerenti allo sviluppo è uno dei principali modi per generare cellule pancreatiche compreso pancreas/duodeno homeobox proteina 1+ (PDX1+) cellule progenitrici del pancreas. Protocolli convenzionali avviano la differenziazione con piccole colonie poco dopo il passaggio. Tuttavia, nello stato di colonie o aggregati, le cellule sono inclini a eterogeneita ', che potrebbero ostacolare la differenziazione per PDX1+ cellule. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziarsi hPSCs in PDX1+ cellule. Il protocollo consiste di quattro passi e avvia la differenziazione di singole cellule dissociate di semina. L'induzione di SOX17+ cellule endoderma definitivo è stata seguita dall'espressione di marcatori di tubo due intestino primitivo, HNF1β e HNF4α ed eventuale differenziazione in PDX1+ cellule. Il presente protocollo fornisce la gestione facile e può migliorare e stabilizzare l'efficienza di differenziazione di alcune linee di hPSC che precedentemente sono stati trovati per differenziare in modo inefficiente in endodermici lignaggi o PDX1+ cellule.

Moltiplicazione delle hiPSCs (585A129,30) sono condensati e formano un monostrato omogeneo (Figura 1B) che è adatto per differenziazione. HiPSCs indifferenziato (stadio 0) sono dissociate e ri-seminato come singole cellule a densità bassa delle cellule (1-1.5 x 105 cellule/cm2). Entro 1 h, le cellule sono attaccate alla piastra e iniziano a mostrare la protrusione. Il giorno 1, le cellule sono moltiplicate e ben...

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in proteina di pancreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas basano sulla crescita di monostrato di tipo non-Colonia di dissociato singole cellule. Questo metodo è adatto per la produzione di cellule derivate da hPSC omogenee, manipolazione genetica e di screening.

Efficiente generazione di Pancreas/duodeno Homeobox Protein 1+ posteriore del Foregut/pancreatico progenitori da hPSCs nelle culture di adesione

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Il vantaggio principale di questa tecnica è che prima della stimolazione, le cellule vengono disperse uniformemente e quindi stimolate uniformemente in adesione cellulare tandem. A dimostrare la procedura sarà Azuma Kimura, una studentessa laureata del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, trasferire sei millilitri di RPMI 1640 in un tubo raffreddato a quattro gradi Celsius sul ghiaccio.Utilizzando punte di pipetta di millilitro raffreddate, aggiungere due milligrammi di matrice di membrana basale. Mescolare bene con una pipettazione delicata per renderlo una matrice di membrana basale con una concentrazione di 0,33 milligrammi per millilitro. Successivamente, utilizzare una pipetta per trasferire due millilitri della matrice di membrana basale diluita in ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare a sei pozzi.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 60-90 minuti. Successivamente, mantenere la piastra a temperatura ambiente per un massimo di tre ore, fino a quando non è pronta per l'uso. In primo luogo, aspirare il mezzo usato e utilizzare una pipetta per aggiungere due millilitri di EDTA da 0,5 millimolare ad ogni pozzo per lavare gli hPCS coltivati nella piastra

efficient-generation-pancreasduodenum-homeobox-protein-1-posterior

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Biologia dello sviluppo

Qui, si descrive un metodo per l'isolamento, la cultura e manipolazione del pancreas embrionali di topo. Ciò rappresenta un...

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

Il metodo di coltura tridimensionale descritto in questo protocollo ricapitola sviluppo pancreas dispersi da progenitori topo pancreas embrionali, compresa la loro notevole espansione, differenziazione e morfogenesi in un organo ramificato. Questo metodo è suscettibile di immagini, interferenze funzionali e manipolazione della nicchia.

In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

Qui si descrive un protocollo a 4 stadi per differenziare le cellule staminali embrionali umane per NKX6-1 + progenitori pancreatici in vitro. Questo protocollo può essere applicata ad una varietà di linee di cellule staminali pluripotenti umane.

Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitori pancreatici

Protocolli per generare linee mutanti HPSC che utilizzano la piattaforma iCRISPR e di differenziare hPSCs in cellule beta-come il glucosio-reattiva sono descritti. La combinazione di tecnologia di editing genoma con differenziazione HPSC-diretto fornisce una piattaforma potente per l'analisi sistematica del ruolo dei determinanti lignaggio nello sviluppo umano e la progressione della malattia.

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Qui, presentiamo un protocollo per generare insulina esprimendo 3D pancreatoids murino da progenitori pancreatici e 10.5 digalleggiante dissociato e mesenchima associato.

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

Questo protocollo presenta un confronto tra due diversi protocolli di induzione per differenziare le cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSC) verso le linee pancreatiche in vitro:il protocollo integrativo e il protocollo non integrativo. Il protocollo integrativo genera più cellule produttrici di insulina (IPC).

In vitro Induzione di cellule staminali della polpa dentale umana verso lignaggi pancreatici

Il presente protocollo descrive un metodo potenziato per aumentare la co-espressione dei fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in monostrati planari. Ciò si ottiene reintegrando la matrice fresca, manipolando la densità cellulare e dissociando le cellule endodermiche.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in precursori di cellule beta pancreatiche in un sistema di coltura 2D

La differenziazione delle cellule staminali in cellule insulari fornisce una soluzione alternativa al trattamento convenzionale del diabete e alla modellizzazione della malattia. Descriviamo un protocollo dettagliato di coltura di cellule staminali che combina un kit di differenziazione commerciale con un metodo precedentemente convalidato per aiutare a produrre isole derivate da cellule staminali secernenti insulina in un piatto.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

Questo articolo presenta un protocollo per la differenziazione diretta e l'analisi funzionale di cellule simili a cellule β. Descriviamo le condizioni e i passaggi di coltura ottimali per le cellule staminali pluripotenti umane prima di generare cellule pancreatiche produttrici di insulina. La differenziazione a sei stadi progredisce dalla formazione definitiva dell'endoderma alle cellule funzionali simili a cellule β che secernono insulina in risposta al glucosio.

Protocollo ottimizzato per la generazione di cellule pancreatiche funzionali secernenti insulina da cellule staminali pluripotenti umane

Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivate da cellule staminali possono essere utilizzate per molteplici applicazioni, tra cui terapie cellulari per la degenerazione retinica, modelli di malattie e studi farmacologici. Qui presentiamo un semplice protocollo per derivare in modo riproducibile l'RPE dalle cellule staminali.

Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

Scopri come generare progenitori pancreatici PDX1+ da hPSC in coltura adesiva monostrato. Questo metodo garantisce popolazioni cellulari omogenee per studi di biologia dello sviluppo pancreatico.

Efficiente generazione di Pancreas/duodeno Homeobox Protein 1+ posteriore del Foregut/pancreatico progenitori da hPSCs nelle culture di adesione (Video) | JoVE Journal

Efficiente generazione di Pancreas/duodeno Homeobox Protein 1⁺ posteriore del Foregut/pancreatico progenitori da hPSCs nelle culture di adesione

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