Isolamento delle cellule staminali intestinale e cultura in un modello porcino di segmentale piccola Ischemia intestinale

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare gli effetti dell'ischemia intestinale sulle cellule staminali epiteliali intestinali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule staminali, come ad esempio il modo in cui le cellule staminali resistono alle lesioni e contribuiscono alla riparazione dopo una lesione ischemica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un modello animale di grandi dimensioni che può essere utilizzato per lo studio clinico delle malattie intestinali e la riparazione.

A dimostrare la procedura saranno Amy Stieler Stewart, una studentessa laureata, e John Freund, uno specialista di ricerca del mio laboratorio. Inizia usando una lama di bisturi per praticare un'incisione della linea mediana ventrale da otto a 10 centimetri sull'addome centrata sull'ombelico di un maiale incrociato Yorkshire di 8-10 settimane. Localizzare il digiuno, a circa 40 centimetri orali dalla giunzione ileocecale.

Legare circonferenzialmente l'intestino due volte per delineare anse di digiuno lunghe 10 centimetri con un centimetro tra ciascuna legatura. Creare due loop per ogni punto temporale di ischemia adiacenti l'uno all'altro, uno per l'ischemia e uno per l'ischemia con un'ulteriore ora di riperfusione. Per indurre un'ischemia completa reversibile, utilizzare pinze vascolari o emostatici bulldog per ostruire circa tre vasi mesenterici per pinza per il periodo di tempo sperimentale appropriato.

Mantenere l'addome coperto per tutto il periodo ischemico. Alla fine dell'esperimento, utilizzare le forbici di Metzenbaum per raccogliere prima un pezzo di controllo di digiuno normale almeno da cinque a 10 centimetri prossimalmente all'ultimo ansa ischemica, seguito dalla raccolta del resto delle anse. Conserva i loop di ogni punto temporale della lesione in piccoli contenitori di PBS ghiacciato fino all'isolamento della cripta.

Per isolare le cellule staminali della cripta, utilizzare un filo calibro 20 e una pinza per tessuti per invertire ogni ansa dell'intestino tenue in modo che la superficie della mucosa sia esposta. Sutura saldamente la parte superiore e inferiore di ciascun anello al filo e risciacqua ogni anello invertito con PBS ghiacciato. Quando tutti i detriti luminali sono stati rimossi, posizionare immediatamente i campioni in singole provette coniche da 50 millilitri contenenti 30 millilitri di reagente di dissociazione numero uno su ghiaccio per 30 minuti agitando e capovolgendo ogni cinque minuti.

Al termine del periodo di incubazione, trasferire i campioni nelle corrispondenti provette da 50 millilitri contenenti 30 millilitri del reagente di dissociazione numero due e pellettare i campioni del ciclo ischemico da due a quattro ore mediante centrifugazione. Risospendere i pellet in cinque millilitri di PBS e utilizzare un'aliquota da 50 microlitri da ciascun campione per verificare il grado di associazione cripta e la quantità di detriti mediante microscopia ottica. Successivamente, posizionare i campioni in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 minuti con agitazione o inversione ogni cinque minuti.

Quindi trasferire i campioni direttamente in 25 millilitri di PBS ghiacciato su ghiaccio in un agitatore orbitale impostato a 60 giri/min per due-cinque minuti di agitazione con agitazione manuale aggiuntiva o inversione ogni 30 secondi. Al termine dell'incubazione con agitazione, controllare il grado di associazione con la cripta e la quantità di detriti e trasferire i campioni in nuove provette coniche da 50 millilitri contenenti 25 millilitri di PBS freddo per l'agitazione fino a quando le cripte intatte non saranno isolate con detriti e villi minimi. Quando le anse sono state completamente dissociate, rimuovere il tessuto rimanente, pellettare i campioni mediante centrifugazione e risospendere i restanti pellet di cripta in cinque millilitri di PBS fresco.

Quindi aliquotare 150 cripte per provetta in singole provette da microcentrifuga e pellettare le cripte mediante microcentrifugazione. Utilizzando una pipetta pre-raffreddata, risospendere delicatamente i pellet con 50 microlitri di master mix per pozzetto, quindi pipettare rapidamente 15 volte per miscelare. Quindi, erogare una goccia di cripta da 50 microlitri al centro di ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti pre-sverminata e grigliata e posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Dopo 30 minuti, sovrapporre ogni tortino di matrice con 500 microlitri per pozzetto di terreno di cellule staminali epiteliali intestinali aggiungendo 500 microlitri di PBS sterile a tutti i pozzetti inutilizzati per mantenere l'umidità e contare il numero di cripte piastrellate al giorno zero. Aggiungere fattori di crescita a ciascun pozzetto ogni 48 ore, sostituendo il surnatante ogni 96 ore con 500 microlitri di terreno fresco integrato con fattore di crescita. L'ischemia intestinale completa viene creata nelle anse intestinali tenue utilizzando l'occlusione vascolare con suture o pinze, come mostrato.

Se eseguita correttamente, la lesione ischemica inizierà all'estremità dei villi intestinali e migrerà verso il basso all'interno della cripta all'aumentare della durata dell'ischemia. Un errore comune con la tecnica chirurgica può verificarsi quando i vasi sanguigni non vengono legati o bloccati in modo uniforme, provocando un'ischemia emorragica in cui la vena a parete sottile collassa prima dell'arteria, consentendo al sangue aggiuntivo di infiltrarsi nei tessuti. Dopo la rimozione delle anse intestinali ischemiche, le cripte intestinali possono essere isolate con successo seguendo il protocollo di dissociazione appena dimostrato.

Le cripte dei punti temporali più gravemente danneggiati sono spesso rotte e contengono più detriti cellulari di fondo rispetto a quelle che non subiscono danni o ne subiscono lievemente. Quando le cripte intestinali normali e lievemente danneggiate vengono piastrate in coltura, le enterosfere si formano entro 24-48 ore. Con grave danno ischemico, le cripte intestinali sopravvivono ma vengono danneggiate con conseguente formazione di sfere molto più piccole inizialmente.

Da 72 a 120 ore, gli enteroidi di tutte le cripte diventano più complessi con evidenti lumi centrali e strutture in gemmazione, e con una diminuzione complessiva dell'efficienza di crescita della cripta, così come una diminuzione delle dimensioni degli enteroidi derivati dal tessuto intestinale gravemente danneggiato. Una volta padroneggiate, le procedure di isolamento della placcatura della cripta possono essere completate in circa due o tre ore se vengono eseguite correttamente. È meglio che le cripte raccolte per la placcatura derivino da lavaggi e non da frazioni di dissociazione a causa della maggiore probabilità di contaminazione della coltura nella frazione di dissociazione.

Questo metodo può essere utilizzato anche per testare l'efficacia di farmaci per il trattamento di lesioni epiteliali derivanti da ischemia più o meno riperfusione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia gastrointestinale per esplorare l'impatto dell'ischemia sull'epitelio in particolare sulle cellule staminali intestinali in un modello animale traslazionale di grandi dimensioni clinicamente rilevante. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare ischemia intestinale con o senza riperfusione, nonché di isolare le cripte intestinali per la coltura 3D dopo una lesione in vivo.