Name: Isolamento delle cellule staminali intestinale e cultura in un modello porcino di segmentale piccola Ischemia intestinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Impara l'isolamento delle cellule staminali intestinali e la coltura in un modello porcino di ischemia segmentale. Questo metodo permette di studiare la riparazione epiteliale dopo lesioni ischemiche.

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Questo progetto è stato sostenuto dal NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 e dipartimento di Scienze clinica diffusione fondi

Per questi esperimenti, tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della North Carolina State University.
1. preparazione per la cultura
Nota: Tutti i reagenti sono elencati nella Tabella materiali. Concentrazioni di specifici fattori di crescita sono elencate nella tabella 1.
<ol><li>Preparare una soluzione 0,5 M di acido (EDTA) etilendiamminotetracetico in acqua distillata deionizzata (ddH2O). Mescolare in modo adeguato e regolare il pH a 7,4 utilizzando soluzioni di NaOH o HCl. Nota: Compongono soluzione EDTA fresco prima di ogni esperimento.</li>
	<li>Preparazione del reagente di dissociazione #1 (DR #1) come segue e metterli su ghiaccio: soluzione tampone fosfato di combinare senza Ca2 + e Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT), 10 µM Y27632 e 1 soluzione X antibiotico-antimicotica (Anti-Anti) contenenti penicillina, streptomicina e anfotericina b. Nota: Aggiungere Y27632 immediatamente prima della raccolta del tessuto.</li>
	<li>Preparazione del reagente di dissociazione #2 (DR n. 2) come indicato di seguito e inserire in bagnomaria a 37 ° C: combinare PBS senza Ca2 + e Mg2 +, EDTA 0.5 M, 10 µM Y27632 e 1 X anti-Anti. Nota: Aggiungere Y27632 immediatamente prima della raccolta del tessuto.</li>
	<li>Preparare i supporti delle cellule staminali epiteliali intestinali (IESC) come segue: Mix 25 mL advanced medium DMEM/F12 con 1 supplemento N2 X, 1 X B-27 supplemento, 10 mM HEPES, 2mm Glutamax e 1 X anti-Anti. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Preparare un mix master di fattore di crescita ridotta della membrana dello scantinato matrix (matrice) e fattori di crescita supplementari come segue: scongelare la matrice sul ghiaccio. In un tubo del microcentrifuge, aggiungere 100 ng/mL Noggin umana ricombinante, 500 ng/mL 1 R-Spondin umano ricombinante, 50 ng/mL ricombinante umano fattore di crescita epidermico (EGF), 100 ng/mL Wnt3a umana ricombinante, 10mm nicotinammide, gastrina nM 10, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 e 2,5 µM glicogeno sintasi chinasi 3 inibitore (GSK3i, CHIR99021). Quando la matrice è scongelata, completare con il mix di fattore di crescita (facendo mix master) e memorizzare sul ghiaccio. Nota: Fare attenzione per evitare di introdurre bolle d'aria come questo creerà artefatto entro la patty di matrice durante placcatura.</li>
	<li>Pre-riscaldare un piatto di coltura del tessuto 24 pozzetti in un incubatore a 37 ° C prima di iniziare le procedure di isolamento delle cellule.</li>
</ol>2. modello chirurgico di Ischemia e di raccolta del tessuto
<ol><li>Uso da otto a dieci-settimana-vecchio Yorkshire incrociate maiali di entrambi i sessi (scelta consigliata). Rimuovere tutti i mangimi 16-18 h prima della chirurgia. Consentire l'accesso all'acqua in ogni momento suini.</li>
	<li>Pianificare i maiali di arrivare almeno 48 h prima degli esperimenti per consentire ambientale acclimatazione. Nota: Tecnici veterinari e/o laboratorio preparati sotto la supervisione di un veterinario autorizzato forniscono routine cura degli animali e assistenza con procedure anestetiche.</li>
	<li>Wow il maiale con xilazina (1,5 mg/kg per via intramuscolare (IM)) e ketamina (11-20 mg/kg (IM))15. Una volta calmo, intubare la orotracheally di maiale.</li>
	<li>Mantenere i maiali in anestesia generale con isoflurano (2-5%) vaporizzato in 100% O2 fino al momento dell'eutanasia.</li>
	<li>Posizionare un catetere endovenoso (IV) (vena orecchio consigliato) e amministrare un fluido sostitutivo come soluzione di Ringer lattato suonerie a un tasso di mantenimento di 15 mL/kg/h.</li>
	<li>Eseguire la routine di anestetico monitoraggio compreso pulsossimetria, elettrocardiografia e indiretta pressione sanguigna misure15. Monitorare la frequenza respiratoria e sforzo del maiale e ventilare manualmente o meccanicamente come necessario se end tidal CO2 supera i 55-60 mmHg. Nota: L'anestesia appropriata è confermata dal continuo monitoraggio delle tendenze nella frequenza cardiaca (gamma 80-130 battiti/min), pressione sanguigna non invasiva (media pressione arteriosa 75-100 mmHg) e frequenza respiratoria (10-25 respiri/min)16e controllo periodico per assenza di mascella e tono anale. Profondità dell'anestesia può anche essere giudicato da grado di rilassamento muscolare e fascicolazioni muscolari segue stimolo chirurgico. Riflessi oculari sono di solito di nessun valore16. L'analgesia può essere fornito come diretto dalla politica istituzioni IACUC. In questo caso, un oppiaceo, come la buprenorfina, può essere somministrato durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Posizionare il maiale su un rilievo di riscaldamento e trattengono in decubito dorsale per la procedura chirurgica.</li>
	<li>Radere l'addome ventrale e prepara con scrub chirurgico (soluzione di clorexidina) e alcool isopropilico.</li>
	<li>Fare un'incisione di 8-10 cm ventrale del midline usando un bisturi centrato al umbilicus per accedere all'addome.</li>
	<li>Identificare il piccolo intestino (digiuno) circa 40 cm per via orale alla giunzione ileocecale. Delineare il loop lungo dieci-cm del digiuno legando circonferenzialmente intestino due volte, uno cm tra ogni legatura, prima di creare successive loops 10cm trova oralmente (Figura 1).</li>
	<li>Creare due cicli per ogni punto di tempo di ischemia adiacente a vicenda, uno per ischemia e uno per ischemia con un ulteriore 1h di riperfusione se lo si desidera. Per creare l'ischemia completa (nessun flusso di arterie o vene), morsetto o legare il sistema vascolare mesenterico usando pinze vascolari bulldog, emostatiche di zanzara Halstead curvi o seta non riassorbibile 2-0 per 1, 2, 3 e 4h e quindi rimuovere Morse per 1h di riperfusione, se lo si desidera. Nota: Gli autori creato tutti i cicli di ischemia in ordine a partire con il ciclo ischemico di 4h e progredito in movimento prossimalmente (minimizzare il tempo totale di chirurgia). Per affrontare la possibilità che la vicina ischemici segmenti intestinali può danneggiare spire adiacenti, l'ordine dei cicli ischemici può essere variata. Questo può alterare il tempo chirurgico totale. Nota: L'intervallo di tempo di riperfusione può essere variata basata sulla domanda di ricerca di interesse o se terapie volete essere testato durante il periodo di riperfusione. Tuttavia, come danno di tessuto diventa più grave dall'aumentare le durate di ischemia da solo, riperfusione probabilmente non contribuisce a ulteriori lesioni epiteliali. Riperfusione probabilmente un ruolo seguenti periodi lieve della lesione ischemica.</li>
	<li>Tra i punti di tempo di ischemia, tenere l'addome coperti o chiusi utilizzando un asciugamano sterile e/o un morsetto di asciugamano. Nota: All'interno di un singolo animale per questo esperimento, otto segmenti ischemici possono essere creati. Identificare un segmento aggiuntivo del digiuno, almeno 5-10 cm prossimale all'ultimo anello ischemico, che servirà come un normale controllo interno.</li>
	<li>Ostruire circa tre vasi mesenterici per bulldog morsetto vascolare o curvo pinza emostatica di zanzara di Halstead. Deve prestare attenzione durante l'applicazione del laccio emostatico perché i vasi sono facilmente traumatizzati. Tenta di impilare i vasi all'interno delle mascelle dei morsetti.</li>
	<li>Alla fine dell'esperimento, seguente l'eutanasia con pentobarbital 85-100 mg/kg IV, raccogliere tutti i cicli del tessuto utilizzando forbici metzenbaum, dopo la morte è stata confermata senza battito cardiaco auscultati con perdita del riflesso corneale. Iniziare raccogliendo un pezzo di controllo di digiuno normale almeno 5 - 10 cm prossimale all'ultimo anello ischemico.</li>
	<li>Separano e raccolgono il loop da ogni punto del tempo di ferita in piccoli contenitori di PBS freddo ghiaccio fino al momento per l'isolamento di cripta. Nota: Se lo si desidera, fare ischemico loop abbastanza a lungo per dividere in campioni separati per istologia e cultura intestinale delle cellule staminali; Tuttavia, gli autori hanno trovato che gli anelli superiori a circa 10 cm di lunghezza sono più probabili di diventare emorragica.</li>
</ol>3. cripta (cellule staminali) isolamento da ischemico e loop di controllo
<ol><li>Inverti ogni ciclo di piccolo intestino utilizzando un calibro 20 filo e pinze per esporre la superficie mucosa. Legare la parte superiore e inferiore del ciclo in modo sicuro al filo mediante sutura (2-0 non assorbibili seta o equivalente).</li>
	<li>A seguito di inversione, sciacquare ogni ciclo in PBS freddo ghiaccio per rimuovere i detriti luminal.</li>
	<li>Posizionare il campione immediatamente in provette coniche da 50 mL contenente DR #1 sul ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Raccogliere i cicli iniziano con controllo e seguire con cicli di aumento incrementale durate di ischemia. Loop da meno tessuto danneggiato (cioè 1 h e controllo tessuto ischemico) può essere agitato con forza, rompersi il polso per ottenere i migliori risultati. Tessuti dai tessuti gravemente danneggiati (3 e 4 h di ischemia) dovrebbero essere dolcemente cullati o invertiti solo come troppa agitazione provocherà cripta rottura e distruzione di tessuto supplementare. Tubi dovrebbero essere scossi o invertiti ogni 5 min mentre il ghiaccio.</li>
	<li>Trasferire i campioni in DR #2 per 10 min in bagnomaria a 37° C. Scuotere o invertire tubi ogni 5 min.</li>
	<li>Dopo aver trasferito i tessuti, centrifugare le provette coniche contenenti DR #1 dai loop 2-4 h danneggiato per rimuovere il surnatante EDTA (200 x g per 5 min). Come questi tessuti sono altamente danneggiati è possibile che le cripte hanno già diventare dissociate. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con un piccolo volume di PBS (5 mL) e procedere al punto 3.9.</li>
	<li>Rimuovere i campioni da DR #2 e inserire direttamente i campioni di tessuto 25 mL di PBS freddo sul ghiaccio (etichetta come lavare n. 1). Posizionare i campioni su agitatore orbitale su ghiaccio a 60 giri/min. Continuare a scuotere o capovolgere ogni provetta per 30 s ogni 2-5 min.</li>
	<li>Dopo aver trasferito i tessuti, spin le provette coniche contenenti DR #2 da 2-4 h danneggiato con passanti per rimuovere il surnatante EDTA (200 x g per 5 min). Come questi tessuti sono altamente danneggiati è possibile che le cripte hanno diventare dissociate. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con un piccolo volume di PBS (5 mL) e procedere al punto 3.9.</li>
	<li>Rimuovere un'aliquota di 50 µ l dal lavaggio #1 (o dal DR) per verificare il grado di dissociazione di cripta e quantità di detriti. Posizionare il tessuto in una nuova provetta conica 50 mL (Wash #2, #3, ecc.) riempito con 25 mL di PBS freddo e agitare fino a cripte intatte sono isolati con detriti minimal e villi. Nota: L'obiettivo è di essere in grado di isolare una frazione pulita con cripte intatte ed i residui minimi. Ogni ulteriore lavaggio pulirà le cellule tuttavia troppo agitazione inizierà a provocare il danno secondario dei tessuti/cellule. Inoltre, i migliori risultati con meno contaminazione si realizzerà se cripte sono rivestiti da una fase di lavaggio e non da un passo di reagente di dissociazione.</li>
	<li>Rimuovere il tessuto restante e centrifugare le provette coniche da 50 mL a 200 x g per 5 minuti per rimuovere il surnatante, quindi risospendere restanti il pellet cripta nel più piccolo volume di PBS (5 mL).</li>
	<li>Utilizzando un microscopio invertito, esaminare 50 aliquote µ l di ogni campione per determinare il numero di cripte o frazione. L'obiettivo è di 50-100 µ l di cripte/50, come questa sarà la dimensione del mondo di patty di matrice finale. Nota: Se il campione è troppo concentrato, continuare ad aggiungere PBS freddo fino a quando non viene raggiunta la concentrazione desiderata. Se il campione è troppo diluito, determinare il numero di aliquote necessarie per raggiungere la resa desiderata cripta e regolare.</li>
	<li>Aliquotare volumi appropriati delle cripte (determinati dall'aliquotare osservazioni) in un tubo del microcentrifuge. Ad esempio, se il campione contiene 50 µ l di cripte/50 poi aliquota 50 µ l per patty X3 replica = 150 µ l / tubo del microcentrifuge. Se il campione contiene solo 25 µ l di cripte/50 poi 2 aliquote necessarie / patty X 3 replica = 300 µ l/tubo.</li>
	<li>Cripte di pellet a 200 x g per 5 min a 4° C.</li>
	<li>Risospendere delicatamente pellettati cripte con volume appropriato di mix master (50 µ l per pozzetto). Mescolare accuratamente pipettando rapidamente 15 volte senza creare bolle d'aria. Nota: Pre-raffreddare la punta della pipetta con PBS freddo sterile prima di aspirare il mix master. Questo vi aiuterà a mantenere il mix master dalla diffusione. Suggerimenti possono essere conservati in frigorifero e collocati nella cappa immediatamente prima dell'uso.</li>
	<li>Erogare una 50 mix master µ l plus gocciolina cripta nel centro di ciascun pozzetto di una piastra ben 24 pre-riscaldato.</li>
	<li>Incubare la piastra di coltura per 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Sovrapposizione di ogni tortino di matrice con 500 µ l / pozzo di media IESC (senza ulteriori fattori di crescita necessari il giorno 0 come si trovassero all'interno del master mix).</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l PBS sterile eventuali pozzetti inutilizzati a sinistra sulla piastra per mantenere l'umidità.</li>
	<li>Contare il numero di cripte placcati il giorno 0. Nota: È utile per pre-griglia ogni cella cultura piastra in quadranti per contribuire a garantire il conteggio più preciso.</li>
	<li>Contare il numero di enterospheres ogni 24h e monitorare per lo sviluppo di enteroid al giorno.</li>
	<li>Aggiungere fattori di crescita per ogni bene ogni 48 h. rimuovere il supporto IESC ogni 96 ore e sostituire con media fresco di 500 µ l (fattori di crescita deve essere aggiunto ai media).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo sviluppo di un modello porcino di ischemia intestinale segmentale si espande sulla precedenti modelli murini consentendo per lo studio di più punti di tempo della lesione del tessuto all'interno dello stesso animale. Ci sono diversi punti di discussione critica del presente protocollo, tra cui la legatura corretta nave, riperfusione del tessuto e coltura cellulare successo cripta.
La legatura vaso corretto è fondamentale per la creazione di un modello di ischemia completa. Se la sutura è legata in modo non uniforme o il morsetto non serrate completamente, sangue dall'arteria pareti spesse può continuare ad immettere il tessuto e non è possibile uscire a causa del crollo della vena con pareti sottili. In questo modo lo stravaso di sangue nella lamina propria causando danni di tessuto supplementare. Tuttavia, a seconda del tipo di lesione ischemica in fase di studio, ischemia completa o emorragica può essere desiderato. Ad esempio, nel processo di trapianto intestinale, intestino è completamente separato dal rifornimento vascolare (arteria e vena) durante la fase di resezione della procedura, che si traduce in ischemia intestinale completa. In alternativa, tuttavia, quando il mesentere è contorto durante un evento come un volvolo intestinale, il ritorno venoso è spesso ostacolato in primo luogo, che conduce sangue addizionale all'interno del tessuto prima di essere il rifornimento arterioso occluso, creando così ischemia emorragica.
Lesione ischemica provoca danni ai tessuti inizia sulla punta del villo e si estende fino alla base della cripta3. Durante l'ischemia, energia sotto forma di trifosfato di adenosina continua ad essere utilizzata e genera l'ipoxantina metabolita. Quando il tessuto è reperfused con ossigeno, ipoxantina diventa metabolizzato dalla xantina ossidasi e produce radicali liberi superossido che conduce alla ferita mucosa e l'attrazione del tessuto danneggiando i neutrofili17,18. Differenze tra specie in architettura vascolare della mucosa così come espressione variante della xantina ossidasi, causare vari gradi di riperfusione lesioni3. Felini e roditore modelli di ischemia-riperfusione sono più suscettibili alla riperfusione da metaboliti reattivi dell'ossigeno19,20. Al contrario, maiali sono stati trovati per avere meno xantina ossidasi e conseguenza meno riperfusione, rendendo questo modello più paragonabile a quella di ischemia intestinale umano21. In questo momento, l'utilizzo di Ko o modelli transgenici suini per lo studio di lesione intestinale non è stata descritta, rendendo questo una limitazione importante di questo modello. Selezione del modello animale adeguato dipende dal processo di malattia o condizione specifica il ricercatore desidera studiare. Ad esempio, modelli porcine della lesione ischemica fino a 6 h sono stati descritti22, considerando che le procedure più ischemiche in modelli murini sono 45-60 min23.
Successo isolamento delle cripte intestinali dall'intestino normale e ischemically danneggiato consente lo studio di recupero epiteliale nella cultura. Questo sistema consente al ricercatore di concentrarsi unicamente sull'epitelio da solo, come c'è rifornimento non vascolare o componente delle cellule immuni da considerare. Questo offre l'opportunità di studiare le interazioni delle cellule epiteliali e recupero dopo la lesione oltre alla risposta a diversi fattori di crescita, o trattamenti somministrati durante chirurgia o seguente cripta isolamento completando i terreni di coltura. Questo passaggio rimane il più difficile, come isolamento dai loop gravemente danneggiato richiede agitazione delicata e la rimozione rapida delle soluzioni contenenti EDTA nel caso in cui le cripte hanno diventare prematuramente dissociati. Se queste anse dell'intestino non vengono lavate accuratamente, le cripte hanno il potenziale per diventare contaminato nella cultura. Di conseguenza, soluzione antibiotico antimicotico inserito in entrambe le soluzioni DR oltre i media IESC. Un altro punto di discussione si concentra sull'intestino raccolto come un normale controllo. Come gli animali subiscono l'anestesia con possibili alterazioni in perfusione tissutale sistemica, assieme alla possibilità di circolanti di mediatori infiammatori secondarie ad ischemia, tessuto di controllo anche "normali" non può rappresentare un vero controllo. In questi esperimenti, è di nota che il tessuto di controllo è sembrato grossolanamente ed istologicamente paragonabile al tessuto da animali che non subissero l'ischemia in altri esperimenti (Gonzalez, L.M., dati non pubblicati, 2017).
In sintesi, questo metodo viene descritto un modello riproducibile di ischemia intestinale porcina, che modella molto attentamente ciò che avviene nella lesione ischemica umana. Inoltre, l'isolamento di cellule staminali intestinale da loop ischemico è descritto, che serve per studiare la riparazione epiteliale e possibile risposta al trattamento nella cultura.

Lesione ischemica intestinale, il risultato della disponibilità di ossigeno in diminuzione a causa di una riduzione o l'occlusione completa del flusso di sangue all'intestino, rimane una causa significativa della morbosità e della mortalità in pazienti umani e animali1,2. Danno ischemico, con conseguente infiammazione e infiltrazione cellulare, conduce al compromesso di barriera mucosa. La barriera mucosa è fondamentale per la prevenzione della traslocazione batterica e tossine associate nella circolazione sistemica3,4. La successiva riperfusione dei tessuti ischemici può provocare la formazione di danneggiare specie reattive dell'ossigeno che possono esacerbare la ferita5. Da ischemia intestinale è raramente evitabile, ricerca più corrente è stato incentrato sulla promozione di tecniche per la diagnosi precoce di ischemia e lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici che riducono la riparazione della mucosa di riperfusione lesioni o destinazione.
Modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per ampliare le nostre conoscenze di scienza di base di ischemia-riperfusione e rimanere imperativo per ricerca traslazionale. Modelli di roditori sono stati il più ampiamente usato dovuto la loro capacità di essere geneticamente manipolati6. Più recentemente, tuttavia, l'uso di modelli animali grandi, in particolare il maiale, è stato sostenuto per futuri studi traslazionali a causa di una serie di vantaggi, tra cui le somiglianze di anatomici e fisiologici di maiali a esseri umani7,8. Una varietà di modelli di lesione sono stati sviluppati per lo studio di ischemia-riperfusione e includono l'occlusione vascolare completa, ischemia di flusso debole e occlusione vascolare mesenterica segmentale. Una recensione completa di questi modelli è di fuori del Regno di questo articolo tuttavia gli autori diretta ai lettori di una recente revisione3.
Oltre ai modelli in vivo , l'uso di ex vivo sistemi di coltura cellulare offre uno strumento promettente per lo studio dell'omeostasi intestinale e riparazione dopo la lesione. Cellule staminali intestinali sono responsabili della proliferazione cellulare e fatturato del rivestimento epiteliale intestinale. Quando isolato dall'intestino normale o ferito, cellule staminali intestinali possono essere mantenute in coltura e servire come uno strumento o un modello per lo studio delle cellule staminali e biologia delle cellule epiteliali. Metodi per isolare e stabilire questi tridimensionale cultura sistemi (chiamati enteroids e colonoids quando derivato dal piccolo e grande intestino, rispettivamente) sono stati descritti per una varietà di specie e organo sistemi9,10 ,11,12,13. In particolare, all'interno del tratto gastrointestinale, questi sistemi di coltura sono stati utilizzati per la malattia gastrointestinale compreso cancro, agente patogeno infezione e malattia di viscere infiammatoria14modello. In questo momento, non ci sono rapporti che descrive l'isolamento e la manutenzione delle cellule staminali intestinale dal tenue ischemically feriti in ogni specie. Di conseguenza, qui descriviamo il processo di ischemia intestinale in un romanzo, grande modello animale porcino che provoca lesioni riproducibile e la capacità di isolare cellule staminali intestinale dall'intestino normale e ischemically ferito per l'ulteriore studio di recupero ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, Ca2+, Mg 2+ free</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP-399</td><td>Diluire 1:10</td></tr><tr><td>Acqua distillata e deionizzata (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per preparare EDTA e PBS</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiame tetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>Preparare fresco prima di ogni esperimento; pH 7,4</td></tr><tr><td>1,4-Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina/Amfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Soluzione anti-anti</td></tr><tr><td>Wnt-3a umano ricombinante</td><td>R & D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rispondina umana ricombinante1</td><td>R & D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>Noggin umano ricombinante</td><td>R & D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante</td><td>R & D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Umano [leu]15-gastrina 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>acqua, qualità WFI</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>Indicato come acqua sterile (SW); per i fattori di crescita stock</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td> Piatto di coltura a 24 pozzetti <td>senza rosso fenolo</td></tr><tr><td></td><td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica, 50 ml&nbsp;</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>430828</tr><tr><td>Manico per bisturi</td> Strumenti <td>di precisione mondiali</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>lama chirurgica in acciaio al carbonio, n. 10</td> Strumenti <td>di precisione mondiali</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti</td> Strumenti <td>di precisione mondiali</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti Debakey</td> Strumenti <td>di precisione</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Forbici</td><td> Strumenti di precisione</td><td>501752</td> Forbici <td>Metzenbaum curve o diritte</td></tr> World <tr><td></td><td>Precision Instruments</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per zanzare, Curved</td><td>World Precision Instruments</td><td>503724-12</td><td>Curvo o dritto (503728-12)</td></tr><tr><td>Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Stoelting Co.</td><td>52120-40P</td><td>Seta dritta</td></tr><tr><td>, 2-0&nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-MA</td><td>Qualsiasi marca simile è accettabile</td></tr><tr><td>Morsetti per asciugamani</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per aghi</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>Sutura a filo, calibro 20</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>Tagliare e raddrizzare prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Asciugamani chirurgici</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>Qualsiasi prodotto simile è accettabile.</td></tr><tr><td>Soluzione di Ringers lattato</td><td>Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>Scrub antisettico al clorex (4%)</td><td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>Qualsiasi marca simile è accettabile</td></tr><tr><td>Alcool isopropilico 70%</td><td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>Qualsiasi marca simile è accettabile</td></tr><tr><td>Catetere IV, calibro 22</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>Potrebbe essere necessario 20 g o 24 g a seconda delle dimensioni della vena</td></tr><tr><td>Xilazina (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>Farmaco controllato</td></tr><tr><td>Soluzione di isoflurano</td><td>Henry</td><td>Schein 10015516</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Soluzione fatale più eutanasia (390 mg/ml))</td><td>Vortech Pharm.</td><td></td><td>Sono disponibili diverse marche di pentobarbital sodico.</td></tr><tr><td>Termoforo&nbsp;</td><td>Sistema di riscaldamento Gaymar Tpump Core; altri sono disponibili.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray North America</td><td></td><td>Qualsiasi apparecchiatura di monitoraggio equivalente accettabile</td></tr><tr><td>Vaporizzatore</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>Si consiglia di utilizzare un sistema circolare con pezzo Y; più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Pompa per fluidi</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+; Si consiglia un produttore simile.</td></tr></tbody></table>

isolamento delle cellule staminali intestinale e cultura in un modello porcino di segmentale piccola ischemia intestinale

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Ischemia intestinale rimane una causa importante di morbilità e mortalità in pazienti umani e veterinari. Molti processi di malattia causare ischemia intestinale, quando il rifornimento di sangue e quindi ossigeno è diminuita all'intestino. Questo porta alla perdita di barriera intestinale e danni al tessuto sottostante. Cellule staminali intestinali risiedono alla base delle cripte di Lieberkühn e sono responsabili per rinnovo intestinale durante l'omeostasi e lesione seguente. Tecniche di coltura ex vivo delle cellule hanno permesso per il riuscito studio delle interazioni delle cellule staminali epiteliali stabilendo condizioni di coltura che supportano la crescita dei sistemi organo-come epiteliali tridimensionali (chiamato "enteroids" e" colonoids"dal piccolo e grande intestino, rispettivamente). Questi enteroids sono composti da cripta e villi coriali-come i dominii e maturo per contenere tutti i tipi di cellulare trovati all'interno dell'epitelio. Storicamente, i modelli murini sono stati utilizzati per studiare la lesione intestinale. Tuttavia, un modello porcino offre diversi vantaggi tra cui la somiglianza di dimensioni così come gastrointestinale anatomia e fisiologia a quello degli esseri umani. Utilizzando un modello porcino, stabiliamo un protocollo in cui il loop segmentale di ischemia intestinale possono essere creati all'interno di un singolo animale, consentendo lo studio di differenti punti della lesione ischemica tempo e riparare in vivo. Inoltre, descriviamo un metodo per isolare e coltura delle cellule staminali intestinali dai loop ischemica dell'intestino, consentendo lo studio continuo di riparazione epiteliale, modulata dalle cellule staminali, ex vivo.

Ischemia intestinale completa è stata creata in piccole anse intestinali utilizzando occlusione vascolare con sutura o i morsetti come mostrato in Figura 1. Rilasciando i morsetti, può essere eseguito un controllata periodo di riperfusione, consentendo lo studio supplementare della successiva riperfusione se lo si desidera. Tutti gli animali sopravvissero durante la procedura con la minima complicazione fino ad eutanasia. La più comune complicanza chirurgica era ipotensione, che ha risolto con il completamento di un inotropa positiva come dobutamina.
Se eseguita correttamente, la lesione ischemica inizierà sulla punta del villo intestinale e migrare verso il basso all'interno della cripta, come la durata di aumenti di ischemia (Figura 2). Un errore comune con la tecnica chirurgica può verificarsi quando i vasi sanguigni non sono legati o fissati in modo uniforme. Il risultato è un'ischemia emorragica (Figura 3), in cui la vena sottili crolla prima l'arteria, consentendo ulteriori sangue di infiltrare i tessuti. Questo è visto grossolanamente come una superficie serosal viola scura (Figura 3, a sinistra) rispetto ad una superficie più chiara durante ischemia completa (Figura 3, destra).
A seguito di rimozione delle anse intestinali ischemiche, cripte intestinali sono stati correttamente isolati seguendo il protocollo di dissociazione (Figura 4). Come previsto, le cripte da punti temporali più severamente danneggiato spesso erano rotti (f; frammento) e frazioni di cripta conteneva più detriti cellulari di sfondo rispetto a quelli che hanno subito di no o lievi danni. Durante il protocollo, l'intestino gravemente infortunato deve essere agitata delicatamente per evitare ulteriori danni al tessuto sottostante. Agitando troppo approssimativamente può causare ulteriori danni di cripta e la maggior parte delle cripte finendo nella DR soluzioni contenenti EDTA, conseguente rottura aggiuntiva.
Una volta placcato, cripte da tutti i punti di tempo di ischemia sopravvivono e sono in grado di stabilirsi in cultura (Figura 5). Quando cripte intestinali normali e lievemente danneggiati sono placcati in cultura, enterospheres forma entro 24-48 h. Con grave danno ischemico (3 e 4 h), cripte intestinali sopravvivono ma sono danneggiate, causando la formazione di sfere molto più piccoli inizialmente. Da 72-120 h, enteroids diventano più complesse con evidente lumen centrale e strutture in erba. Nel complesso, c'è un'efficienza di crescita è diminuito delle cripte e anche una dimensione ridotta di enteroids derivato dal tessuto intestinale gravemente danneggiato (Gonzalez, L.M., dati non pubblicati, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> Figura 1 : Modello chirurgico di ischemia intestinale completa in un modello porcino. A) normale digiuno porcina esteriorizzato. B) mesenteriche vasi sono state legate con sutura creazione di ischemia intestinale. C) ischemia creato utilizzando pinze vascolari bulldog per consentire riperfusione del tessuto se lo si desidera. D) intestinale vascolarizzazione immediatamente dopo rimozione dei morsetti vascolari. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> Figura 2 : Prova istologica (ematossilina ed eosina (H &amp; E) macchia) di aumentare il danno epiteliale seguendo le durate più lunghe di ischemia intestinale completa. Danni inizia sulla punta del del villo con graduale perdita dello strato epiteliale unicellulare, villo smussamento e danno cellulare che si estende verso il basso per la cripta base con lesioni gravi (durata fino a 4 h). barra della scala 100 µm. Io = Ischemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> Figura 3 : Prova lorda ed istologica di ischemia emorragica. A) lorda fotografia confrontando l'ischemia emorragica (loop di sinistra) e ischemia completa (loop di destra). Quando il sistema vascolare non è legato o fissato uniformemente, sangue può continuare a infiltrare i tessuti, con conseguente ulteriore infiammazione e danno. B) H &amp; E immagini di ischemia emorragica di aumento della durata da 1-4 h. Oltre al danno cellulare visto con ischemia completa, c'è prova di infiltrazione di globuli rossi all'interno della lamina propria circostante. barra della scala 100 µm. Io = Ischemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> Figura 4 : Aliquote delle cripte intestinali isolati dai cicli dell'intestino ischemico e normale. Completi, intatti cripte intestinali (asterischi) sono stati correttamente isolati da ogni ansa dell'intestino. Come previsto, le cripte da più punti di tempo gravemente danneggiato spesso erano rotti (f; frammento) e frazioni di cripta conteneva più detriti cellulari di sfondo rispetto a quelli che hanno subito di no o lievi danni. barra della scala 100 µm. Io = Ischemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> Figura 5 : Corso di tempo di crescita intestinale delle cellule staminali dopo isolamento da loop ischemica dell'intestino tenue. Quando cripte intestinali normali erano cromate nella cultura, enterospheres formata entro 24-48 h. Con grave danno ischemico (3 e 4 h), cripte sopravvivono ma formano inizialmente molto più piccole sfere. Da 72-120 h, enteroids diventano più complesse con evidente lumen centrale e strutture in erba. 20 µm scala bar se non diversamente. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Fattore di crescita</td>
			<td>Diluente</td>
			<td>Concentrazione d'archivio</td>
			<td>Diluizione di stock</td>
			<td>Diluizione di lavoro</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>1 µ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zucca</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>FEG</td>
			<td>10mM acido acetico</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>500 µ g/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ΜM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinammide</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrina</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>2,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: tabella dei fattori di crescita di reagente. Sintesi delle soluzioni di riserva del fattore di crescita e soluzioni di lavoro utilizzate nel presente protocollo.

Questo protocollo consentirà ai lettori di stabilire con successo un modello porcino di ischemia intestinale segmentale e successivamente isolare e coltura di cellule staminali intestinali per lo studio della riparazione epiteliale dopo la lesione.

Isolamento delle cellule staminali intestinale e cultura in un modello porcino di segmentale piccola Ischemia intestinale

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare gli effetti dell'ischemia intestinale sulle cellule staminali epiteliali intestinali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule staminali, come ad esempio il modo in cui le cellule staminali resistono alle lesioni e contribuiscono alla riparazione dopo una lesione ischemica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un modello animale di grandi dimensioni che può essere utilizzato per lo studio clinico delle malattie intestinali e la riparazione.A dimostrare la procedura saranno Amy Stieler Stewart, una studentessa laureata, e John Freund, uno specialista di ricerca del mio laboratorio. Inizia usando una lama di bisturi per praticare un'incisione della linea mediana ventrale da otto a 10 centimetri sull'addome centrata sull'ombelico di un maiale incrociato Yorkshire di 8-10 settimane. Localizzare il digiuno, a circa 40 centimetri orali dalla giunzione ileocecale.Legare circonferenzialmente l'intestino due volte per delineare anse di digiuno lunghe 10 centimetri con un centimetro tra ciascuna legatura. Creare due loop per ogni punto temporale di ischemia adiacenti l'uno all'altro, uno per l'ischemia e uno per l'ischemia con un'ulteriore ora di riperfusione. Per indurre un'ischemia completa reversibile, utilizzare pinze vascolari o emostatici bulldog per ostruire circa tre vasi mesenterici per pinza per il periodo di tempo sperimentale appropriato.Mantenere l'addome coperto per tutto il periodo ischemico. Alla fine dell'esperimento, utilizzare le forbici di Metzenbaum per raccogliere prima un pezzo di controllo di digiuno normale almeno da cinque a 10 centimetri prossimalmente all'ultimo ansa ischemica, seguito dalla raccolta del resto delle anse. Conserva i loop di ogni punto temporale della lesione in piccoli contenitori di PBS ghiacciato fino all'isolamento della cripta.Per isolare le cellule staminali della cripta, utilizzare un filo calibro 20 e una pinza per tessuti per invertire ogni ansa dell'intestino tenue in modo che la superficie della mucosa sia esposta. Sutura saldamente la parte superiore e inferiore di ciascun anello al filo e risciacqua ogni anello invertito con PBS ghiacciato. Quando tutti i detriti luminali sono stati rimossi, posizionare immediatamente i campioni in singole provette coniche da 50 millilitri contenenti 30 millilitri di reagente di dissociazione numero uno su ghiaccio per 30 minuti agitando e capovolgendo ogni cinque minuti.Al termine del periodo di incubazione, trasferire i campioni nelle corrispondenti provette da 50 millilitri contenenti 30 millilitri del reagente di dissociazione numero due e pellettare i campioni del ciclo ischemico da due a quattro ore mediante centrifugazione. Risospendere i pellet in cinque millilitri di PBS e utilizzare un'aliquota da 50 microlitri da ciascun campione per verificare il grado di associazione cripta e la quantità di detriti mediante microscopia ottica. Successivamente, posizionare i campioni in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 minuti con agitazione o inversione ogni cinque minuti.Quindi trasferire i campioni direttamente in 25 millilitri di PBS ghiacciato su ghiaccio in un agitatore orbitale impostato a 60 giri/min per due-cinque minuti di agitazione con agitazione manuale aggiuntiva o inversione ogni 30 secondi. Al termine dell'incubazione con agitazione, controllare il grado di associazione con la cripta e la quantità di detriti e trasferire i campioni in nuove provette coniche da 50 millilitri contenenti 25 millilitri di PBS freddo per l'agitazione fino a quando le cripte intatte non saranno isolate con detriti e villi minimi. Quando le anse sono state completamente dissociate, rimuovere il tessuto rimanente, pellettare i campioni mediante centrifugazione e risospendere i restanti pellet di cripta in cinque millilitri di PBS fresco.Quindi aliquotare 150 cripte per provetta in singole provette da microcentrifuga e pellettare le cripte mediante microcentrifugazione. Utilizzando una pipetta pre-raffreddata, risospendere delicatamente i pellet con 50 microlitri di master mix per pozzetto, quindi pipettare rapidamente 15 volte per miscelare. Quindi, erogare una goccia di cripta da 50 microlitri al centro di ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti pre-sverminata e grigliata e posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.Dopo 30 minuti, sovrapporre ogni tortino di matrice con 500 microlitri per pozzetto di terreno di cellule staminali epiteliali intestinali aggiungendo 500 microlitri di PBS sterile a tutti i pozzetti inutilizzati per mantenere l'umidità e contare il numero di cripte piastrellate al giorno zero. Aggiungere fattori di crescita a ciascun pozzetto ogni 48 ore, sostituendo il surnatante ogni 96 ore con 500 microlitri di terreno fresco integrato con fattore di crescita. L'ischemia intestinale completa viene creata nelle anse intestinali tenue utilizzando l'occlusione vascolare con suture o pinze, come mostrato.Se eseguita correttamente, la lesione ischemica inizierà all'estremità dei villi intestinali e migrerà verso il basso all'interno della cripta all'aumentare della durata dell'ischemia. Un errore comune con la tecnica chirurgica può verificarsi quando i vasi sanguigni non vengono legati o bloccati in modo uniforme, provocando un'ischemia emorragica in cui la vena a parete sottile collassa prima dell'arteria, consentendo al sangue aggiuntivo di infiltrarsi nei tessuti. Dopo la rimozione delle anse intestinali ischemiche, le cripte intestinali possono essere isolate con successo seguendo il protocollo di dissociazione appena dimostrato.Le cripte dei punti temporali più gravemente danneggiati sono spesso rotte e contengono più detriti cellulari di fondo rispetto a quelle che non subiscono danni o ne subiscono lievemente. Quando le cripte intestinali normali e lievemente danneggiate vengono piastrate in coltura, le enterosfere si formano entro 24-48 ore. Con grave danno ischemico, le cripte intestinali sopravvivono ma vengono danneggiate con conseguente formazione di sfere molto più piccole inizialmente.Da 72 a 120 ore, gli enteroidi di tutte le cripte diventano più complessi con evidenti lumi centrali e strutture in gemmazione, e con una diminuzione complessiva dell'efficienza di crescita della cripta, così come una diminuzione delle dimensioni degli enteroidi derivati dal tessuto intestinale gravemente danneggiato. Una volta padroneggiate, le procedure di isolamento della placcatura della cripta possono essere completate in circa due o tre ore se vengono eseguite correttamente. È meglio che le cripte raccolte per la placcatura derivino da lavaggi e non da frazioni di dissociazione a causa della maggiore probabilità di contaminazione della coltura nella frazione di dissociazione.Questo metodo può essere utilizzato anche per testare l'efficacia di farmaci per il trattamento di lesioni epiteliali derivanti da ischemia più o meno riperfusione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia gastrointestinale per esplorare l'impatto dell'ischemia sull'epitelio in particolare sulle cellule staminali intestinali in un modello animale traslazionale di grandi dimensioni clinicamente rilevante. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare ischemia intestinale con o senza riperfusione, nonché di isolare le cripte intestinali per la coltura 3D dopo una lesione in vivo.

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Questo articolo e il video di accompagnamento presentare il nostro protocollo per la generazione di tessuto ingegnerizzato intestino nel topo, utilizzando un organoid unità-on-scaffold approccio.

L&#39;ingegneria dei tessuti del colon in un modello murino

Qui si descrive la procedura dettagliata di intestinale ischemia-riperfusione nei topi che causa ferite riproducibili senza la mortalità per favorire la standardizzazione di questa tecnica in tutto il campo. Questo modello di intestinale danno da ischemia-riperfusione può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di lesioni e di rigenerazione.

Modello murino di ischemia-riperfusione intestinale Injury

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell'intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Qui, presentiamo un protocollo per isolare il mesenchima intestinale murino, compresi i telocytes. Questi possono essere utilizzati per diverse applicazioni, come la co-coltura con topo o organoidi di derivazione umana, per sostenere la crescita e riflettere meglio la situazione nel tessuto originale.

Isolamento del mesenchima intestinale murino con conseguente alta resa di telociti

Descriviamo come generare un modello chirurgico ampiamente utilizzato di danno da ischemia-riperfusione intestinale (IRI) nei roditori. La procedura prevede l'occlusione dell'arteria mesenterica superiore seguita dal ripristino del flusso sanguigno. Questo modello è utile per gli studi che indagano le cause occlusive dell'IRI intestinale sia in medicina veterinaria che umana.

Modello di roditore di danno da ischemia-riperfusione intestinale attraverso l'occlusione dell'arteria mesenterica superiore

Il presente protocollo descrive la creazione di un sistema di organoidi del colon murino per studiare l'attività e il funzionamento delle cellule staminali del colon in un modello knockout di claudina-7.

Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali

Qui, descriviamo un protocollo per la coltura di organoidi intestinali 3D di maiale da cripte epiteliali crioconservate. Descriviamo anche un metodo per stabilire monostrati cellulari derivati da organoidi 3D, consentendo l'accesso al lato apicale delle cellule epiteliali.

Coltura di organoidi intestinali 3D di maialino da cripte epiteliali crioconservate e creazione di monostrati cellulari

Descriviamo un protocollo per isolare le piccole cripte intestinali murine e la coltura di organoidi 3D intestinali dalle cripte. Inoltre, descriviamo un metodo per generare organoidi da una singola cellula staminale intestinale in assenza di una nicchia cellulare sub-epiteliale.

La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi

Questo protocollo fornisce una guida passo passo per l'approvvigionamento di un pancreas suino per l'isolamento e la purificazione delle isole.

Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Impara l'isolamento delle cellule staminali intestinali e la coltura in un modello porcino di ischemia segmentale. Questo metodo permette di studiare la riparazione epiteliale dopo lesioni ischemiche.

Isolamento delle cellule staminali intestinale e cultura in un modello porcino di segmentale piccola Ischemia intestinale

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