Name: Caratterizzazione di biofilm acquatici con citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Scopri la caratterizzazione dei biofilm acquatici con citometria a flusso e clustering visivo. Questo metodo permette di analizzare comunità microbiche, rilevare inquinanti e valutare la salute degli ecosistemi acquatici.

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Il lavoro presentato è stato supportato da una borsa di studio di Ambizione SNF (PZ00P2_142533) e un assegno di ricerca Velux (Amplebig). Vorremmo ringraziare Bettina Wagner per aiuto con il lavoro sperimentale.

1. ecosistema selezione e campionamento di Biofilm
<ol><li>Selezionare un ecosistema acquatico di interesse e trovare siti di campionamento dove crescono i biofilm. Parti poco profonde di un flusso con lento al flusso idrico medio e un alveo pietroso per biofilm allegato sono appropriati17,18.</li>
	<li>Opzionale: Se il sito non dispone di sufficienti superfici per biofilm allegato, o per diminuire la variabilità di biofilm all'interno di un sito, inserire substrati artificiali per il fissaggio di biofilm (ad es. lastre di vetro, piastrelle di ceramica) il sito, facendo in modo che Essi sono posti nella stessa direzione rispetto al flusso di acqua e a simili profondità e intensità luminosa19.</li>
	<li>Per determinare le condizioni ambientali presso il sito di campionamento, uso strumenti portatili per misurare l'intensità della luce, temperatura, conducibilità, ossigeno e pH proprio sopra il superficie biofilm è da campionare da. Nel corso del campionamento, è necessario prendere misure ripetute (3 – 5) al fine di calcolare i valori medi.</li>
	<li>Optional: Parametri di chimica dell'acqua prendere campioni di acqua al fine di determinare rilevanti (carbonio organico (DOC), disciolto K+, Na+, Ca2 +, Mg2 +, Cl–, F-, SO42 -, PO42 - , NO32 -,4SiO4 -).</li>
	<li>Uso di guanti protettivi, raccogliere pietre paragonabile (in dimensione, forma e tipo) da ogni sito (o substrati artificiali). Le pietre devono essere esposti al flusso simile e condizioni di luce18.</li>
	<li>Filtro acqua a sufficienza in diretta dal sito attraverso 0,22 μm filtri, in modo che è pronto per tutti i campioni raccolti (ad esempio, 15 mL per campione).</li>
	<li>Utilizzare uno spazzolino morbido per rimuovere il biofilm dal substrato in un matraccio (spazzola finché non viene rimosso tutti i biofilm) con 15 mL di filtrato flusso acqua20.</li>
	<li>Difficoltà i campioni in 0,01% paraformaldeide e 0,1% di glutaraldeide21.</li>
</ol>2. determinazione dei parametri ottimale flusso-cytometric (FC)
<ol><li>Sottocampioni di trasferimento di un microscopio ottico (utilizzando un 40 X / 0.75 obiettivo; se necessario, utilizzare un obiettivo di olio 100 × 1.3) e identificare le specie presenti nei campioni22,23.</li>
	<li>Singola specie ordine identificato da collezioni di colture adeguate (ad es. l'algologia sperimentale e cultura raccolta di alghe all'Università di Goettingen [EPSAG] o cultura raccolta di alghe all'Università di Colonia [CCAC] se monitoraggio viene eseguito in ecosistemi europei centrali).</li>
	<li>Crescere le singole specie continuamente in condizioni ambientali simili (ad es., luce, temperatura, pH) per l'ambiente che sono stati prelevati i campioni di biofilm. Soggiornare all'interno di 1 ° C e 0,5 punto di pH da campioni ambientali è raccomandato.</li>
	<li>Per staccare/disperdere le cellule, mettere 15 mL di campioni di singole specie in provette da centrifuga e mettere i tubi al centro di una vasca di acqua e immergere, in modo che la superficie del liquido del campione è allo stesso livello come la superficie della vasca. Sonicare i campioni per 1 min a 45 kHz24,25.</li>
	<li>Registrare gli spettri di assorbimento e fluorescenza delle singole specie utilizzando un lettore di piastra. Fare riferimento al lettore di piastre di scelta per le istruzioni. In questo esempio, lastre di polistirolo trasparente Fondo piatto 96 pozzetti sono stati caricati con 200 µ l di campione e assorbanza è stata misurata. (Impostazioni utilizzate: modalità di scansione (a) fluorescenza; fase di lunghezza d'onda di emissione dimensioni 10 nm, emissione scansione numero 30, larghezza di banda 20 nm, guadagno 100, 25 lampeggia, US 20 modalità di scansione di tempo o (b) assorbanza integrazione; 25 lampeggia, larghezza di banda 9 nm).</li>
	<li>Impostare il citometro a flusso con laser, Splitter dicroiche e filtri che in combinazione coprono tutte quelle gamme fluorescente in cui specie differenti hanno proprietà specifiche. Per i flussi europei centrale, una 405 nm, 488 nm e 638 nm laser produrre risultati utili.</li>
	<li>Regolare l'impostazione della tensione di fotomoltiplicatori (non applicabili a tutti i citometri a flusso) e la gamma delle fluorescenze misurati per includere almeno il 99% di tutti gli eventi dei campioni.</li>
	<li>In alternativa, se la conoscenza sulle specie presenti nel biofilm è disponibile, iniziare dal passaggio 2.2. Se la proprietà fluorescenti sono noti, iniziare con passo 2.6.</li>
</ol>3. facoltativo: Preparazione di un Database di riferimento di flusso-cytometric
Nota: Il FC non consente identificazione tassonomica delle cellule presenti nel biofilm. Un database di riferimento di FC misurazioni di unica specie conosciuta per essere presente nei biofilm, coltivate in condizioni simili come il biofilm, può aiutare con l'interpretazione dei dati.
<ol><li>
Riferimento: singola specie
	<ol>
<li>Utilizzando i parametri FC ottimizzati impostati in 2.5 – 7, misurare le proprietà ottiche e fluorescente di singola specie (risolto in paraformaldeide e glutaraldeide e filtrata attraverso filtri di dimensioni adeguate per il citometro a flusso).</li>
		<li>Normalizzare i dati da singole specie allo stesso modo come i dati dal biofilm (Vedi punto 6.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Riferimento: cellule danneggiate e decadente Uno dei più importanti indicatori della salute di biofilm è la frazione delle cellule danneggiate/morendo presenti nel biofilm. Per quantificare queste cellule, può essere preparato un riferimento di cellule in decomposizione.<ol>
<li>Prendere sottocampioni 1ml di biofilm diluito e li Centrifugare a temperatura ambiente a 8.000 x g per 10 minuti in una centrifuga da tavolo. Sospendere il pellet risultante in 1 mL di etanolo al 90% e memorizzare la sospensione durante la notte a 4 ° C. Ripetere il giorno successivo.</li>
		<li>Utilizzando le impostazioni ottimizzate di FC, misurare le proprietà ottiche e fluorescente delle cellule danneggiate e decadente (fissi e filtrata).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Riferimento: taminino Nota: se siete interessati a particelle di microplastic nel biofilm di monitoraggio, verifica se differiscono abbastanza da particelle biotiche in ottica e proprietà di fluorescenza per l'identificazione.<ol>
<li>Sospendere le particelle di microplastic secondo le istruzioni del produttore microplastiche e misurare le loro proprietà ottiche e fluorescente (utilizzando parametri FC da 2,7).</li>
		<li>Aggiungere le particelle di microplastic nell'esempio di biofilm e lasciare tutta la notte a 4 ° C.</li>
		<li>Filtrare la sospensione e la misura con gli stessi parametri FC come sopra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparazione e conservazione del campione
<ol><li>Una volta che è stato istituito il FC e il database di riferimento FC è pronto, si può procedere con la valutazione del biofilm freschi campioni, raccolti secondo passaggi 1.1 – 7. Per staccare/disperdere il biofilm, trasferire 15 mL dei campioni dai palloni (Vedi punto 1.7) in provette da centrifuga.</li>
	<li>Mettere ogni tubo al centro del bagno d'acqua e immergere in modo che la superficie del liquido del campione è allo stesso livello come la superficie della vasca. Sonicare i campioni per 1 min a 45 kHz.</li>
	<li>Difficoltà i campioni in 0,01% paraformaldeide e 0,1% glutaraldeide (stock in acqua nanopure). Conservare a 4 ° C fino al momento dell'analisi.</li>
	<li>Importante: Utilizzare metà dei campioni per analisi di citometria a flusso e tenere metà in deposito per la sicurezza e per la convalida opzionale con fluorescenza-attivato delle cellule cernita e/o microscopia (Vedi sezione 6). Nota: Stored in frigorifero, i campioni di biofilm fisso dovrebbero tenere loro proprietà ottiche e fluorescenti per fino a tre settimane.</li>
</ol>5. esecuzione dell'esempio attraverso il FC
<ol><li>Se i campioni sono stati conservati in frigorifero, li Sonicare rapidamente o pipetta parecchie volte per separare le particelle. Filtrare i sottocampioni con 50 μm filtri (filtro dimensione dipende dalla larghezza del capillare FC) prima della misurazione.</li>
	<li>Caricare i campioni individuali (1 – 2 mL, questo dipende il citometro a flusso utilizzato) nel citometro a flusso e misurare le proprietà ottiche e fluorescente di ogni particella. Ripetere la misurazione tre volte per ogni replica biologico (tre replicati tecnici).</li>
	<li>Esportare i dati da FC in formato CSV.</li>
</ol>6. preparazione dei dati e analisi di correlazione
FC in grado di analizzare diversi parametri (ad es., area di segnale, altezza, larghezza) per ogni proprietà ottica misurata e la fascia di fluorescenza. Eseguire un'analisi di correlazione su variabili misurate e mantenere solo quelle misure che non sono altamente correlate. Questo di solito rimuove tutti, ma un parametro FC (ad es., area di segnale) e può anche rimuovere altamente correlate misure fluorescente (solitamente derivanti dal laser stesso e limitrofi filtri).
<ol><li>
Eseguire CYT come un toolbox di Matlab:
	<ol>
<li>Replica di importazione il FC ridotto dei dati in formato CSV da tutti i campioni che devono essere analizzati nel CYT software16, comprese tutte le tecniche e biologiche. (Fai clic su +, File CSV di filtro, selezionare i file per l'importazione).</li>
		<li>Trasformare i canali fluorescenti di tutti i campioni utilizzando la trasformazione di arcoseno iperbolico. Il valore del cofattore deve essere selezionata; 150 opere per più phototrophic biofilm e citometri a flusso, ma ottimizzazione potrebbero essere necessari per particolari configurazioni sperimentali e biofilm eterotrofi. (Right-Click/trasformazione/immettere cofattore 150)</li>
		<li>Per il controllo qualità, confrontare visivamente (in CYT) gli istogrammi dei singoli campioni e singoli canali ottici e fluorescenti per assicurarsi che non ci sono nessun valori anomali a livello tecnico e biologico della replica. Valori erratici si manifesteranno in distribuzioni fluorescente/ottico significativamente spostati tra le repliche. (Selezionare dati, selezionare il canale, trama)<ol>
<li>Alternativa: eseguire un'analisi delle componenti principali (PCA) sui valori mediani delle distribuzioni fluorescente e assicurarsi che tecniche e biologiche replica cluster insieme.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Unisci il tecnico replica in ogni replica biologico e frazionare la replica di biologica, così che ciascuno è rappresentato dallo stesso numero di particelle (cellule, frammento di cella e particelle abiotiche) e in modo che il numero totale di particelle analizzate da Neighbor stocastico Barnes-capanna incorporamento (bh-SNE) è circa 150.000 (per migliore visualizzazione risultati26). (Selezionare dati, clic destro, Merge/sottocampione)</li>
		<li>Per il confronto tra i campioni, è importante selezionare solo quei campioni che devono essere confrontati. Selezionare i campioni ed eseguire bh-SNE27. Una volta che l'algoritmo è finiti, nuovi canali, denominati bh-SNE1 e bh-SNE2 vengono visualizzati. Queste sono le coordinate SNE di tutte le particelle analizzate, che possono essere utilizzate per visualizzare i dati in un grafico a dispersione (viSNE mappa). (Selezionare i dati, selezionare canali, tasto destro del mouse, bh-SNE, sì dati normalizzati)</li>
		<li>Nella mappa viSNE, particelle sono posizionate secondo la somiglianza e raggruppate in cluster visivamente separabili. Controllare le proprietà di ottica/fluorescente del cluster e marchio e nome quelli che sono ben separati e hanno proprietà diverse ottiche/fluorescenza utilizzando strumenti di disegno disponibili in CYT. (Selezionare il canale bh-SNE1, bh-SNE2)</li>
		<li>Facoltativo: Se è disponibile un database di riferimento delle singole specie microbiche (misurati con la stessa impostazione di citometria a flusso e coltivate in condizioni simili!), esportare le mappe viSNE in Matlab e il database di riferimento di proiettare le mappe. In questo modo, i cluster di particolari possono essere collegati a gruppi particolari specie/tassonomici (script disponibili per il download a https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Sessione/Salva)</li>
		<li>Risoluzione dei problemi: Se l'analisi di bh-SNE non restituisce i cluster visivamente separabili, ma una sola grande, troppe particelle sono state utilizzate in bh-SNE. Riprovare con un minor numero di particelle per esempio. Se non esistono i cluster, ma piuttosto radi singoli punti, aumentare il numero di particelle utilizzato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opzionale: Invece di basarsi su bh-SNE per il clustering, altri metodi di clustering (ad es., gerarchico, basato su centroide o densità basato clustering) possono essere utilizzati sui dati normalizzati e poi sovrapposta alla mappa viSNE (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).</li>
	<li>Una volta identificati i cluster, contare il numero di particelle in ogni cluster appartenendo a ogni replica biologico in ciascun campione. Valutare le differenze tra i campioni, usando test ANOVA e di Tukey con appropriato (ad es., Holmes) correzione per il confronto di più.</li>
</ol>7. facoltativo: Convalida dell'interpretazione di Cluster utilizzando l'ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule
<ol><li>Una volta identificati i cluster, è possibile utilizzare fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per ordinarli fuori i campioni se lo si desidera, purché la FACS ha una configurazione simile (o identica) di laser e filtri fluorescenti.</li>
	<li>Per ogni cluster identificati, CYT fornisce porte ottiche e fluorescente che definiscono il cluster. Utilizzare queste porte per ordinare fuori le particelle in ogni cluster con il FACS e quindi identificare le celle ordinate utilizzando la microscopia chiara.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto sopra è relativamente semplice da implementare. Tuttavia, mentre le impostazioni di default presentato sono state indicate per essere adatto a tutti phototrophic biofilm provato finora, ottimizzazione (come descritto nel protocollo) è necessario per massimizzare le informazioni ottenute dal metodo. Infatti, le proprietà ottiche e fluorescente di biofilm possono variare, a seconda delle condizioni ambientali (stagione, temperatura e composizione chimica dell'acqua)1. Pertant...

I biofilm sono consorzi dinamici del microorganismo che svolgono un ruolo chiave negli ecosistemi d'acqua dolce, che vanno dalla produzione primaria, ciclo dei nutrienti e purificazione dell'acqua ad influenzare la distribuzione dei microrganismi e della loro biodiversità nell'ecosistema 1. quando biofilm sono esposti a condizioni ambientali o a fattori di stress, quali i prodotti chimici, la loro struttura di comunità si sposta rapidamente verso più tollerante specie2,3. Loro alta sensibilità si trasforma il biofilm in sistemi modello attraente per monitoraggio ambientale4, tuttavia nessuno dei metodi attualmente è perfettamente adatto per tracciare effettivamente la dinamica di una comunità di biofilm in un modo facile e veloce.
Il comunemente utilizzato set di metodi per la caratterizzazione di biofilm consiste nella misurazione di endpoint funzionale e strutturale. A livello dell'intera comunità, l'attività fotosintetica e respiratoria, nonché l'attività degli enzimi extracellulari fornisce informazioni sullo stato funzionale del biofilm5,6,7,8 ,9. Attribuzione di biomassa viene utilizzato come un indicatore per la crescita complessiva del biofilm. Cambiamenti strutturali sono attualmente misurate sia tramite identificazione di specie tradizionali con microscopia chiara o con tecniche basate su nucleotide (ad es., denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), distanziale intergenica ribosomale automatizzato analisi (ARISA), metagenomica)10,11,12. Questi metodi forniscono informazioni ma sono richiede molto tempo per eseguire, o richiedono conoscenze specifiche o sono ancora in fase di sviluppo. Infine, nuovi metodi per la valutazione delle sostanze polimeriche extracellulari (EPS)13,14 e il biofilm architettura1, mentre sensibile, sono basso-throughput e non sono state ancora sviluppate verso a fini di controllo.
È evidente che per una completa caratterizzazione di biofilm d'acqua dolce, è necessario combinare diversi metodi, che consentono di comprendere la funzione di biofilm, la composizione e l'architettura. Per il monitoraggio ambientale, d'altra parte, un metodo veloce e sensibile che è in grado di rilevare le modifiche nel biofilm e abilitare base interpretazione biologica dei mutamenti a livello strutturale e funzionale è necessario.
Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la caratterizzazione della comunità microbica del componente phototrophic di flusso biofilm (perifiton), che è abbastanza veloce per fini di controllo e allo stesso tempo fornisce sufficienti informazioni sulla comunità di biofilm struttura per consentire l'interpretazione biologica15. Si basa su singola cellula flusso cytometry (FC) di campioni di biofilm ed accoppiato con visualizzazione computazionale e fornisce informazioni sulle proprietà ottiche e fluorescente del biofilm a livello di singola cellula.
Il flusso di lavoro dopo il biofilm campionamento consiste di preparazione del campione sotto forma di sonicazione, fissazione e filtraggio basato sulle dimensioni dei campioni seguiti da valutare il campione tramite flusso cytometry. I dati acquisiti forniscono informazioni sulle caratteristiche cellulari diversi in una singola misurazione: granulometria, densità, contenuto di pigmenti, abiotici contenuti (ad es. microplastiche) nel biofilm. Questo set di dati è che analizzati tramite visualizzazione computazionale utilizzando visual stocastico prossimo incorporamento (viSNE)16, che consente il veloce e facile interpretazione dei dati. Anche un paio di settimane è necessario configurare e ottimizzare il metodo, una volta impostato, ci vogliono solo poche ore dalla raccolta dei campioni di biofilm per l'interpretazione dei risultati.
I principali vantaggi del metodo presentato sopra gli altri sono la velocità di analisi e di alto contenuto di informazioni. Inoltre, i campioni possono essere conservati per diverse settimane dopo la raccolta senza perdita di loro ottica e proprietà di fluorescenza. Questo può essere molto utile quando è richiesto, ad esempio campionamento grandi studi o programmi di biomonitoraggio caratterizzazione di un gran numero di campioni, ma può anche fornire una notevole quantità di informazioni in più piccoli studi esplorativi.
Il protocollo presentato si basa sull'analisi cytometric di flusso, di phototrophic biofilm (perifiton), raccolto da diversi punti di un flusso. Molti passaggi del protocollo, ad esempio la selezione di siti appropriati per il monitoraggio, dipendono gli obiettivi della ricerca e pertanto non possono essere prescritto. Altri consentono meno libertà e richiedono che il protocollo è seguito da vicino, ciò è reso chiaro nel protocollo dettagliato qui sotto.
Il protocollo inizia con la selezione dei siti per il monitoraggio ambientale basato su biofilm. Il passo successivo è quello di set-up il citometro a flusso (FC) così che le sue misure permettono discriminazione tra diversi organismi phototrophic vivono in biofilm nell'ambiente monitorato. Questa operazione viene eseguita attraverso la raccolta di campioni di biofilm dai siti, identificare le proprietà fluorescenti di diverse specie presenti nel biofilm e configurando il citometro a flusso con filtri che permettono la misurazione del ottico e laser lunghezze d'onda. Una volta che la FC è stato istituito, i biofilm possono essere raccolti dai siti periodicamente, le proprietà ottiche e fluorescente delle singole particelle presenti nel biofilm misurata da citometria a flusso e i dati analizzati dal clustering visual. Per la migliore interpretazione dei risultati, è possibile costruire un database di riferimento FC di specie locali di biofilm-vivente e loro fenotipi e utilizzare il database per identificare differenti tassonomie nei dati FC. La convalida è possibile attraverso l'ordinamento basato su fluorescenza dei cluster individuati di singole cellule mediante FACS e basati su microscopia identificazione tassonomica delle specie presenti. Un disegno schematico del protocollo è dato in Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Multimetro</td><td>WTW</td><td>MultiLine 3620 IDS</td><td>Per misurare la temperatura, il pH, l'ossigeno disciolto</td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>VWR International</td><td>97043-986</td><td>Dimensioni del serbatoio: 15*14*10 cm</td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios</td><td>Laser: 405, 488 e 638 nm. Bande dei filtri nella Tabella supplementare 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.</td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>utilizzato per selezionare l'impostazione appropriata del</td></tr><tr><td>selezionatore di celle</td> FC <td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td>Impostazioni nella Tabella supplementare 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td>Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75</td></tr><tr><td>obiettivo SOFTWARE Matlab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>MathWorks</td><td>R2013a</td><td>software per il calcolo numerico</td></tr><tr><td>CYT</td><td>Dana Pe'er Lab</td><td>Versione 1.1</td><td>strumento di visualizzazione interattivo gratuito per l'analisi dei dati citometrici</td></tr></tbody></table>

caratterizzazione di biofilm acquatici con citometria a flusso

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

I biofilm sono consorzi dinamici del microorganismo che svolgono un ruolo chiave negli ecosistemi d'acqua dolce. Modificando la loro struttura di comunità, biofilm rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali e possono essere quindi utilizzati come indicatori della qualità dell'acqua. Attualmente, biofilm valutazione si basa principalmente sugli endpoint integrativo e funzionale, come l'attività fotosintetica o respiratoria, che non forniscono informazioni sulla struttura di comunità di biofilm. Citometria a flusso e visualizzazione computazionale offrono un metodo alternativo, sensibile e facile da usare per valutare la composizione della Comunità, in particolare della parte autotrofe del biofilm d'acqua dolce. Richiede solo la preparazione di base del campione, dopo che l'intero campione è gestito attraverso il citometro a flusso. Le informazioni ottiche e fluorescente di cella singola viene utilizzate per la visualizzazione del calcolo e interpretazione biologica. I suoi principali vantaggi rispetto ad altri metodi sono la velocità di analisi e la natura di alto contenuto di informazioni. Citometria a flusso fornisce informazioni su diversi tratti di biofilm e cellulare in una singola misurazione: granulometria, densità, contenuto di pigmenti, abiotici contenuti nel biofilm e grossolane informazioni tassonomiche. Tuttavia, non fornisce informazioni sulla composizione di biofilm a livello di specie. Vediamo elevato potenziale nell'uso del metodo per il monitoraggio ambientale degli ecosistemi acquatici e come valutazione iniziale biofilm passo che informa a valle dettagliate indagini dai metodi complementari e più dettagliati.

Utilizzando la procedura presentata qui (Figura 1), sono stati analizzati campioni prelevati da diversi siti di un torrente locale in Svizzera. In ogni sito, tre pietre di dimensioni simili (10 – 12 cm) sono state prese e biofilm erano spazzolati via le pietre. I campioni sono stati poi sonicato, fisso, filtrata e successivamente analizzati mediante citometria a flusso. L'installazione del citofluorimetro e il database di riferimento utilizzati erano gli stes...

Citometria a flusso in combinazione con il clustering visual offre un facile da usare e veloce metodo per lo studio di biofilm acquatici. Può essere utilizzato per la caratterizzazione di biofilm, rilevamento delle modifiche nella struttura della comunità di biofilm e la rilevazione delle particelle abiotiche incorporato nel biofilm.

Caratterizzazione di biofilm acquatici con citometria a flusso

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle scienze ambientali, come gli impatti dell'inquinamento chimico o dei cambiamenti climatici negli ecosistemi acquatici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che tutti i singoli passaggi sono semplici e veloci da eseguire. Sebbene l'obiettivo della procedura sia quello di caratterizzare i biofilm autotrofi, può essere utilizzata anche per caratterizzare i biofilm eterotrofi e rilevare particelle inquinanti come le microplastiche.Per iniziare, seleziona un sito di campionamento acquatico in cui cresce il biofilm, si tratta in genere di parti poco profonde di corsi d'acqua che hanno un flusso d'acqua da lento a intermedio e letti di corsi d'acqua sassosi. Se il sito non ha una superficie sufficiente per l'attacco del biofilm, è possibile utilizzare substrati artificiali su cui i biofilm possono crescere. Misurare le condizioni ambientali nel sito di campionamento utilizzando strumenti portatili per misurare la conducibilità, il pH, la temperatura dell'acqua e l'intensità della luce proprio sopra la superficie del biofilm da campionare.Usando guanti protettivi, raccogli pietre simili per dimensioni, forma e tipo da ogni sito. Le pietre devono essere raccolte da aree esposte a condizioni di flusso e luce simili. Oltre alla raccolta dei campioni di biofilm e alla misurazione delle condizioni di crescita in loco, è possibile ottenere campioni d'acqua per misurare i parametri chimici dell'acqua.Per elaborare i campioni di biofilm, filtrare prima 15 millilitri di acqua del torrente dal sito attraverso un filtro da 0,22 micrometri. Quindi, utilizzare uno spazzolino morbido per rimuovere il biofilm dal substrato fino a quando non è completamente sospeso in un pallone. Fissare i campioni di biofilm utilizzando lo 0,01% di paraformaldeide e lo 0,1% di glutaraldeide.Trasferire sottocampioni del biofilm al microscopio ottico. Passa all'ingrandimento appropriato per il tuo campione e identifica le specie presenti nei campioni di biofilm. Prepara le colture per le singole specie.Coltivarli continuamente utilizzando condizioni ambientali simili all'ambiente da cui sono stati prelevati i campioni di biofilm. Una volta cresciute, disperdere le cellule sonicandole per 5-10 secondi a 45 kilohertz. Posizionare le cellule disperse in una piastra a 96 pozzetti.Una volta dispersi, registrare gli spettri di assorbanza e fluorescenza delle singole specie utilizzando un lettore di piastre. Successivamente, impostare il citometro a flusso con splitter dicroici e filtri per coprire gli intervalli di fluorescenza in cui le diverse specie hanno proprietà specifiche. Per preparare un riferimento per una singola specie, utilizzare i parametri ottimizzati della citometria a flusso per misurare le proprietà ottiche e fluorescenti di singole specie.Successivamente, preparare le cellule danneggiate e in decomposizione prelevando un sottocampione da un millilitro di biofilm diluito, centrifugandolo a 8.000 g per 10 minuti e quindi rimettendo in sospensione il pellet in un millilitro di etanolo al 90%. Conservare la sospensione per una notte a quattro gradi Celsius e ripetere nuovamente il processo il giorno successivo. Utilizzando le stesse impostazioni ottimizzate della citometria a flusso, è possibile misurare le proprietà ottiche e fluorescenti delle cellule danneggiate e in decadimento.Dopo aver impostato i parametri del citometro a flusso e costruito il database di riferimento, è il momento di iniziare a raccogliere i campioni per la campagna di monitoraggio. I campioni devono essere raccolti ed elaborati come mostrato nei passaggi precedenti, con l'eccezione che la sonicazione deve durare un minuto a 45 kilohertz. Una volta pronti per l'analisi, prelevare i campioni dal deposito.Per evitare di bloccare il citometro a flusso, filtrare i sottocampioni attraverso filtri a pori da 50 micrometri, quindi caricare da uno a due millilitri dei singoli campioni nel citometro a flusso e misurare le proprietà ottiche e fluorescenti di ciascuna particella. Ripetere la misurazione tre volte per ogni campione. Apri MATLAB ed esegui CYT come toolbox.Quindi, importare i dati della citometria a flusso ridotto come file csv nel software CYT. Quindi, utilizzare la trasformazione arcosinusoidale iperbolica per trasformare i canali fluorescenti di tutti i campioni. Immettere 150 come valore del cofattore.Questo valore funziona per la maggior parte dei biofilm fototrofici e dei citometri a flusso, ma potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione. Per il controllo di qualità, tracciare e confrontare visivamente gli istogrammi dei singoli campioni e dei singoli canali ottici e fluorescenti per assicurarsi che non vi siano valori anomali a livello tecnico e biologico di replicazione. I valori anomali si manifesteranno in distribuzioni ottiche fluorescenti significativamente spostate tra le repliche.Successivamente, unire le repliche tecniche in ciascuna replica biologica e sottocampionare le repliche biologiche in modo che ciascuna sia rappresentata dallo stesso numero di particelle. Il numero ideale di particelle analizzate dal Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding è di circa 150.000. Per il confronto tra i campioni, selezionare solo i campioni da confrontare ed eseguire l'incorporamento del vicino stocastico Barnes-Hut.Una volta terminato l'algoritmo, compaiono nuovi canali, denominati bh-SNE1 e bh-SNE2. Visualizza i dati dei canali risultanti come un grafico a dispersione per mostrare tutte le coordinate di incorporamento del vicino stocastico contenenti tutte le particelle analizzate. Se i cluster non sono visivamente separabili, probabilmente sono state utilizzate troppe o non abbastanza particelle nell'analisi.Regolare il numero di particelle e ripetere l'analisi. Nella mappa viSNE, le particelle sono posizionate in base alla somiglianza e raggruppate in cluster visivamente separabili. Ispezionare le proprietà di fluorescenza ottica dei cluster e contrassegnare e nominare quelli che sono ben separati e hanno proprietà diverse utilizzando gli strumenti di disegno.Per la successiva analisi statistica, esportare i cluster viSNE in MATLAB. Utilizzando la procedura qui presentata, sono stati analizzati campioni prelevati da diversi siti di un corso d'acqua locale in Svizzera. Utilizzando le mappe viSNE, è possibile distinguere tra diversi biofilm ambientali.Qui sei diversi campioni presentano densità diverse in varie parti della mappa viSNE. Le mappe viSNE mostrate qui sono popolate da particelle con diverse proprietà ottiche e di fluorescenza che forniscono indizi sull'origine biotica/abiotica delle particelle e a quale gruppo tassonomico appartengono le particelle biotiche. Inoltre, la proiezione del database di riferimento sulla mappa viSNE può aiutare a interpretare quali parti della mappa sono popolate da quali taxa e/o particelle abiotiche.Può anche stabilire quali sottopopolazioni sono diverse tra i campioni. Qui, il numero di particelle per ogni sottopopolazione è mostrato per ciascuna delle diverse repliche biologiche. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore dalla raccolta del campione all'analisi completata.Seguendo questa procedura, altri metodi come lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza possono essere utilizzati per convalidare le previsioni del clustering visivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la citometria a flusso e il clustering visivo per analizzare i biofilm acquatici.

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Pseudomonas aeruginosa e biofilm Saccharomyces cerevisiae in celle di flusso

Biofilm microbici sono generalmente costituiti da distinti sottopopolazioni di cellule specializzate. Cella singola analisi di queste sottopopolazioni richiede l'uso di reporter fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo di visualizzare e monitorare diversi...

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