Caratterizzazione di biofilm acquatici con citometria a flusso

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle scienze ambientali, come gli impatti dell'inquinamento chimico o dei cambiamenti climatici negli ecosistemi acquatici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che tutti i singoli passaggi sono semplici e veloci da eseguire. Sebbene l'obiettivo della procedura sia quello di caratterizzare i biofilm autotrofi, può essere utilizzata anche per caratterizzare i biofilm eterotrofi e rilevare particelle inquinanti come le microplastiche.

Per iniziare, seleziona un sito di campionamento acquatico in cui cresce il biofilm, si tratta in genere di parti poco profonde di corsi d'acqua che hanno un flusso d'acqua da lento a intermedio e letti di corsi d'acqua sassosi. Se il sito non ha una superficie sufficiente per l'attacco del biofilm, è possibile utilizzare substrati artificiali su cui i biofilm possono crescere. Misurare le condizioni ambientali nel sito di campionamento utilizzando strumenti portatili per misurare la conducibilità, il pH, la temperatura dell'acqua e l'intensità della luce proprio sopra la superficie del biofilm da campionare.

Usando guanti protettivi, raccogli pietre simili per dimensioni, forma e tipo da ogni sito. Le pietre devono essere raccolte da aree esposte a condizioni di flusso e luce simili. Oltre alla raccolta dei campioni di biofilm e alla misurazione delle condizioni di crescita in loco, è possibile ottenere campioni d'acqua per misurare i parametri chimici dell'acqua.

Per elaborare i campioni di biofilm, filtrare prima 15 millilitri di acqua del torrente dal sito attraverso un filtro da 0,22 micrometri. Quindi, utilizzare uno spazzolino morbido per rimuovere il biofilm dal substrato fino a quando non è completamente sospeso in un pallone. Fissare i campioni di biofilm utilizzando lo 0,01% di paraformaldeide e lo 0,1% di glutaraldeide.

Trasferire sottocampioni del biofilm al microscopio ottico. Passa all'ingrandimento appropriato per il tuo campione e identifica le specie presenti nei campioni di biofilm. Prepara le colture per le singole specie.

Coltivarli continuamente utilizzando condizioni ambientali simili all'ambiente da cui sono stati prelevati i campioni di biofilm. Una volta cresciute, disperdere le cellule sonicandole per 5-10 secondi a 45 kilohertz. Posizionare le cellule disperse in una piastra a 96 pozzetti.

Una volta dispersi, registrare gli spettri di assorbanza e fluorescenza delle singole specie utilizzando un lettore di piastre. Successivamente, impostare il citometro a flusso con splitter dicroici e filtri per coprire gli intervalli di fluorescenza in cui le diverse specie hanno proprietà specifiche. Per preparare un riferimento per una singola specie, utilizzare i parametri ottimizzati della citometria a flusso per misurare le proprietà ottiche e fluorescenti di singole specie.

Successivamente, preparare le cellule danneggiate e in decomposizione prelevando un sottocampione da un millilitro di biofilm diluito, centrifugandolo a 8.000 g per 10 minuti e quindi rimettendo in sospensione il pellet in un millilitro di etanolo al 90%. Conservare la sospensione per una notte a quattro gradi Celsius e ripetere nuovamente il processo il giorno successivo. Utilizzando le stesse impostazioni ottimizzate della citometria a flusso, è possibile misurare le proprietà ottiche e fluorescenti delle cellule danneggiate e in decadimento.

Dopo aver impostato i parametri del citometro a flusso e costruito il database di riferimento, è il momento di iniziare a raccogliere i campioni per la campagna di monitoraggio. I campioni devono essere raccolti ed elaborati come mostrato nei passaggi precedenti, con l'eccezione che la sonicazione deve durare un minuto a 45 kilohertz. Una volta pronti per l'analisi, prelevare i campioni dal deposito.

Per evitare di bloccare il citometro a flusso, filtrare i sottocampioni attraverso filtri a pori da 50 micrometri, quindi caricare da uno a due millilitri dei singoli campioni nel citometro a flusso e misurare le proprietà ottiche e fluorescenti di ciascuna particella. Ripetere la misurazione tre volte per ogni campione. Apri MATLAB ed esegui CYT come toolbox.

Quindi, importare i dati della citometria a flusso ridotto come file csv nel software CYT. Quindi, utilizzare la trasformazione arcosinusoidale iperbolica per trasformare i canali fluorescenti di tutti i campioni. Immettere 150 come valore del cofattore.

Questo valore funziona per la maggior parte dei biofilm fototrofici e dei citometri a flusso, ma potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione. Per il controllo di qualità, tracciare e confrontare visivamente gli istogrammi dei singoli campioni e dei singoli canali ottici e fluorescenti per assicurarsi che non vi siano valori anomali a livello tecnico e biologico di replicazione. I valori anomali si manifesteranno in distribuzioni ottiche fluorescenti significativamente spostate tra le repliche.

Successivamente, unire le repliche tecniche in ciascuna replica biologica e sottocampionare le repliche biologiche in modo che ciascuna sia rappresentata dallo stesso numero di particelle. Il numero ideale di particelle analizzate dal Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding è di circa 150.000. Per il confronto tra i campioni, selezionare solo i campioni da confrontare ed eseguire l'incorporamento del vicino stocastico Barnes-Hut.

Una volta terminato l'algoritmo, compaiono nuovi canali, denominati bh-SNE1 e bh-SNE2. Visualizza i dati dei canali risultanti come un grafico a dispersione per mostrare tutte le coordinate di incorporamento del vicino stocastico contenenti tutte le particelle analizzate. Se i cluster non sono visivamente separabili, probabilmente sono state utilizzate troppe o non abbastanza particelle nell'analisi.

Regolare il numero di particelle e ripetere l'analisi. Nella mappa viSNE, le particelle sono posizionate in base alla somiglianza e raggruppate in cluster visivamente separabili. Ispezionare le proprietà di fluorescenza ottica dei cluster e contrassegnare e nominare quelli che sono ben separati e hanno proprietà diverse utilizzando gli strumenti di disegno.

Per la successiva analisi statistica, esportare i cluster viSNE in MATLAB. Utilizzando la procedura qui presentata, sono stati analizzati campioni prelevati da diversi siti di un corso d'acqua locale in Svizzera. Utilizzando le mappe viSNE, è possibile distinguere tra diversi biofilm ambientali.

Qui sei diversi campioni presentano densità diverse in varie parti della mappa viSNE. Le mappe viSNE mostrate qui sono popolate da particelle con diverse proprietà ottiche e di fluorescenza che forniscono indizi sull'origine biotica/abiotica delle particelle e a quale gruppo tassonomico appartengono le particelle biotiche. Inoltre, la proiezione del database di riferimento sulla mappa viSNE può aiutare a interpretare quali parti della mappa sono popolate da quali taxa e/o particelle abiotiche.

Può anche stabilire quali sottopopolazioni sono diverse tra i campioni. Qui, il numero di particelle per ogni sottopopolazione è mostrato per ciascuna delle diverse repliche biologiche. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore dalla raccolta del campione all'analisi completata.

Seguendo questa procedura, altri metodi come lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza possono essere utilizzati per convalidare le previsioni del clustering visivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la citometria a flusso e il clustering visivo per analizzare i biofilm acquatici.