Name: Intracranica Subarachnoidal itinerario dellinfezione per indagare ruoli di biofilm di Streptococcus suis nella meningite in un modello di infezione del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Scopri un modello di infezione intracranica subaracnoidea nel topo per studiare il ruolo dei biofilm di Streptococcus suis nella meningite batterica e valutare nuove terapie.

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Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina [2017YFD0500102]; la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina [31572544]; il laboratorio chiave dello stato di biologia eziologico veterinaria [SKLVEB2016KFKT005]; l'agricoltura di Shanghai applicato tecnologia sviluppo programma, Cina [G2016060201].

Gli esperimenti di infezione del mouse sono stati approvati dal laboratorio animale monitoraggio Comitato della provincia di Jiangsu, Cina ed eseguiti nel laboratorio animale Center of Nanjing Agricultural University (permesso numero: SYXK (Su): 2017-0007).
1. preparazione di batteri
Nota: Il ceppo virulento di S. suis sierotipo 2 P1/7 è stato isolato da un maiale malato con meningite19. Ceppo P1/7 è stato coltivato in brodo Todd-Hewitt (THB, formula per litro di THB: Heart Infusion, 3,1 g neopeptone, 20,0 g; destrosio, 2,0 g; cloruro di sodio, 2,0 g; fosfato disodico, 0,4 g; carbonato di sodio, 2,5 g) e placcato su Todd-Hewitt agar (THA, formula per litro di THA: Heart Infusion, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; destrosio, 2,0 g; cloruro di sodio, 2,0 g; disodio fosfato, 0,4 g; carbonato di sodio, 2,5 g; agar, 15,0 g) a 37 ° C e 5% CO2.
<ol><li>Raccolta di ceppo cellule planctoniche P1/7<ol>
<li>Raccogliere 5 mL di cellule planctoniche da cultura Mid-registro fase (OD600= 0,6), centrifugare per 3 min a 8000 × g e poi lavare 3 volte con PBS.</li>
		<li>Risospendere le cellule con 5 mL di glicerolo al 25% in THB, aliquotare in 5 provette e quindi conservare a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccolta di ceppo cellule di stato biofilm P1/7<ol>
<li>Prendere 20 mL di una coltura durante la notte e aggiungere a 180 mL di THB fresco; dividere la cultura diluita in 10 piastre di coltura rotondo ugualmente e poi mettere le piastre in un incubatore a 37 ° C in 5% CO2 per 24 h.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, agitare la piastra delicatamente per risospendere i batteri che non hanno aderito alla piastra e quindi eliminare il surnatante tramite aspirazione. Nota: Agitare la piastra delicatamente ed evitare risospendere il sedimento.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di PBS per raccogliere le cellule di stato del biofilm, risospendere il sedimento completamente e poi trasferire il campione ad un nuovo tubo.</li>
		<li>Sottoporre ad ultrasuoni le celle di stato di biofilm dall'ultimo passaggio con i seguenti parametri: 60 W, 4 cicli, 5 s s on e 10 off.</li>
		<li>Centrifugare per 3 min a 8000 × g e conservare il supernatante a-80 ° C. Nota: Il supernatante può contenere componenti di biofilm e può essere utilizzato per risospendere i biofilm di batteri prima dell'infezione come descritto negli esperimenti sugli animali (passaggio 3).</li>
		<li>Risospendere il sedimento con glicerolo 25% 10ml in THB e quindi memorizzare le celle di stato biofilm a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. scansione analisi di microscopia elettronica (SEM)
<ol><li>Difficoltà il biofilm raccolti stato cellule e cellule planctoniche usando paraformaldeide al 4% per 12-24 h a 4 ° C.</li>
	<li>Sciacquare i campioni rapidamente con acqua distillata e disidratare i campioni in sequenza con una crescente concentrazione di etanolo (25%, 50%, 70%, 90% e 100%) per 30 min in ogni soluzione.</li>
	<li>Rispettare i campioni essiccati per titolari con nastro biadesivo in metallo e infine trattarle in un evaporatore con oro e Palladio.</li>
	<li>Osservare i campioni da un microscopio elettronico a scansione utilizzando i seguenti parametri: EHT (Extra alta tensione) = 10 kV; WD (distanza di lavoro) = 7.0 o 8.0 mm; Ingrandimento = 5000 ×; Segnale A = SE1.</li>
</ol>3. animale esperimenti
<ol><li>Utilizzare SPF 6-settimana-vecchi topi BALB/c femminili in questo studio. Infettare tutti i topi attraverso l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione cui sito di iniezione è situato 3,5 mm rostrale dal bregma. Le coordinate stereotassiche del sito di iniezione sono stati chiaramente descritti da Chiavolini et al17.<ol>
<li>Per l'analisi istopatologica, infettare due gruppi di topi (5 topi per gruppo) utilizzando cellule planctoniche o biofilm stato cellule ad una dose di 3 × 107 unità formanti colonie (CFU), e un altro 5 topi sono stati iniettati con PBS come controllo.</li>
		<li>Per la rilevazione dell'espressione del mRNA di TLR2 e citochine nel cervello, infettare altre due gruppi di topi (6 topi per ogni gruppo) utilizzando cellule planctoniche o biofilm stato cellule ad una dose di 3 × 107 CFU.</li>
		<li>Determinare il numero di batteri vitali di diluizioni seriali a THA di placcatura.</li>
		<li>Eutanasia tutti i topi a di post-infezione 12 h per ulteriori ricerche. Nota: Glicerolo a stock medio deve essere rimosso prima dell'infezione. Sia le cellule planctoniche e biofilm celle di state recuperate da-80 ° C vengono lavate 3 volte con PBS. Quindi, le cellule planctoniche sono risospese con PBS e diluite alla dose appropriata per l'infezione; biofilm stato cellule sono risospese con il surnatante stored (dal punto 1.2.5) e diluite alla dose appropriata per l'infezione. Il volume per l'infezione non dovrebbe essere più di 50 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rilevare l'espressione del mRNA di TLR2 e citochine nel tessuto cerebrale<ol>
<li>Estratto il RNA totale dal tessuto di cervello utilizzando un kit di estrazione di RNA.<ol>
<li>Per ogni mouse, è possibile utilizzare tessuto cerebrale tutta per l'estrazione di RNA. Dividere del tessuto di cervello intero in 5 provette. Prenda al tessuto cerebrale 100mg e aggiungere 1 mL di soluzione di lisi in ogni provetta contenente la matrice lisante fornita dal kit.</li>
			<li>Elaborare il tubo in un omogeneizzatore per 40 s con un'impostazione del 6.0 e poi Centrifugare la provetta a 12000 × g e 4 ° C per 5 min.</li>
			<li>Dopo la centrifugazione, trasferire la fase superiore ad un nuovo tubo del microcentrifuge.</li>
			<li>Incubare il campione trasferito per 5 min a temperatura ambiente; aggiungere 300 µ l di cloroformio, vortexare per 10 s e poi incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Centrifugare la provetta a 12000 × g e 4 ° C per 5 min. trasferire la fase superiore ad un nuovo tubo.</li>
			<li>Aggiungere 500 µ l di etanolo assoluto freddo al tubo, prima di esso invertente per 5 volte e quindi conservare il campione a-20 ° C per almeno 1 h.</li>
			<li>Centrifugare la provetta a 12000 × g e 4 ° C per 15 min e rimuovere il surnatante. Lavare la pallina con 500 µ l di etanolo 75% freddo privo di RNasi H2O.</li>
			<li>Rimuovi l'etanolo, aria secca il pellet per 5 min a temperatura ambiente e risospendere il RNA in 100 µ l di RNAsi-libera H2O.</li>
			<li>Incubare il RNA per 5 min a temperatura ambiente e determinare la concentrazione di RNA con un RNA bioanalyzer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire sintesi di cDNA, compreso eliminazione del DNA genomico (gDNA), utilizzando un termociclatore con un kit di reagenti di trascrizione inversa (RT).<ol>
<li>Aggiungere 1 µ g di RNA da un tubo contenente 2 µ l di buffer di eliminazione 5 x gDNA, 1 µ l di enzima eliminazione gDNA e privo di RNasi H2O fino a quando il volume raggiunge 10 µ l. Incubare per 2 min a 42 ° C.</li>
			<li>Aggiungere 10 µ l di master mix (1 µ l di enzima RT mescolare I, 1 µ l di miscela di Primer RT, 4 µ l di tampone 2: 5x e 4 µ l di RNAsi-libera H2O) per la soluzione di reazione dall'ultimo passo e poi mescolare delicatamente. Procedere immediatamente con la reazione di RT: 37 ° C per 15 min e poi 85 ° C per 5 s.</li>
			<li>Eseguire l'analisi quantitativa di PCR (RT-qPCR) in tempo reale, utilizzando una macchina PCR Real-Time con un kit SYBR RT-qPCR. Aggiungere 10 µ l di enzima: 2x, 0,8 µ l di primer forward, 0,8 µ l di primer reverse, 0,4 µ l di 50 x ROX riferimento Dye II, 2 µ l di modello di cDNA e privo di RNasi H2O fino a un volume totale di 20 µ l.</li>
			<li>Eseguire ogni esempio in triplice copia utilizzando i seguenti parametri termici: 30 s a 94 ° C, seguiti da 40 cicli di 5 s a 95 ° C e 34 s a 60 ° C, con una fase finale di 15 s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C e 15 s a 95 ° C. Primer per RT-qPCR sono elencati nella tabella 1. Geni housekeeping B2m e 18s rRNA sono stati usati come controlli interni.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcolare la variazione relativa piega sulla base del metodo 2-ΔΔCt .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osservazione delle sezioni istologiche
	<ol>
<li>Dopo la fissazione di 24h con formalina al 10%, è possibile ricostruire il tessuto cerebrale fisso in dimensioni appropriate di pezzi di tessuto a 2-3 mm.</li>
		<li>Mettere i pezzi di tessuto in una cassetta di incorporamento e immergere in una nuova soluzione fissante per disidratazione con un essiccatore di vuoto automatico.</li>
		<li>Estrarre il tessuto fisso e si disidratano in sequenza in aumento delle concentrazioni di etanolo (70%, 80%, 95%, 95% e 100%) per 30 min in ogni soluzione.</li>
		<li>Transparentize il campione con xilene per 15 min, immergerlo nel liquido paraffina a 60 ° C per 90 min e quindi incorporare utilizzando una macchina per l'incorporamento.</li>
		<li>Tagliare il tessuto di blocco incorporato di paraffina a fette di 3 µm, affianca la fetta sull'acqua a 45 ° C e poi asciugare all'aria.</li>
		<li>Incubare la sezione per 3 h a 60 ° C, macchia utilizzando il haematoxylin ed eosina (lui) metodo e sigillare con la gomma neutra.</li>
		<li>Osservare i cambiamenti istopatologici del cervello con un microscopio ottico. Un sistema di classificazione del quattro-punto è stato utilizzato per valutare i cambiamenti istologici. Utilizzare un test spaiato t per l'analisi statistica. Congestione/emorragia: assente, Punteggio 0; piccola area di congestione/emorragia focale, Punteggio 1; grande area di congestione/emorragia focale, o più siti di piccola zona di congestione/emorragia focale, Punteggio 2; fino a tre siti di grande congestione/emorragia focale, Punteggio 3; diffusa congestione/emorragia, Punteggio 4. Necrosi: assente, Punteggio 0; necrosi focale, Punteggio 1; diffusa presenza di cellule necrotiche 1-10, Punteggio 2; i fuochi di necrosi confluente, Punteggio 3; vasta necrosi confluente, Punteggio 4. L'infiltrazione delle cellule infiammatorie: assente, Punteggio 0; pochi e focale infiltrazioni, Punteggio 1; multifocale infiltrazione o infiltrazioni con formazione di aggregati, Punteggio 2; fino a tre aggregati, Punteggio 3; e più di quattro aggregati, Punteggio 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%3A+a+new+emerging+or+an+old+neglected+zoonotic+pathogen%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?</a> Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).</li>
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<li>Xiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+small+RNA+rss04+contributes+to+the+induction+of+meningitis+by+regulating+capsule+synthesis+and+by+inducing+biofilm+formation+in+a+mouse+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model.</a> Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+serotype+2%2C+an+important+swine+and+human+pathogen%2C+induces+strong+systemic+and+cerebral+inflammatory+responses+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).</li>
<li>Seitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intranasal+mouse+model+for+mucosal+colonization+by+Streptococcus+suis+serotype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2.</a> Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).</li>
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<li>Williams, A. E., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+Streptococcal+meningitis+following+intravenous+intracisternal+and+natural+routes+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+cochlear+inflammation+and+vestibular+syndrome+in+an+experimental+model+of+Streptococcus+suis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).</li>
<li>Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+Studies+of+Different+Sequence+Types+and+Geographical+Origins+of+Streptococcus+suis+Serotype+2+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection.</a> Pathogens. 5 (3), (2016).</li>
<li>Chiavolini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+inducing+experimental+pneumococcal+meningitis+in+outbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice.</a> BMC Microbiology. 4, 36(2004).</li>
<li>Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otitis+interna+is+a+frequent+sequela+to+Streptococcus+suis+meningitis+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs.</a> Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).</li>
<li>Holden, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+virulence+and+drug+resistance+in+the+emerging+zoonotic+pathogen+Streptococcus+suis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis.</a> PLoS One. 4 (7), e6072(2009).</li>
<li>Dominguez-Punaro Mde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+microglial+inflammatory+response+to+Streptococcus+suis%2C+an+important+emerging+zoonotic+agent+of+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis.</a> Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).</li>
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<li>Takeuchi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+suilysin+to+the+pathogenesis+of+Streptococcus+suis+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis.</a> Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione qui descritto ha ovvi vantaggi sopra altri itinerari dell'infezione. Esso consente ai ricercatori di studiare l'interazione ospite-batterio e l'effetto di componenti batteriche sulla risposta immune dell'ospite direttamente nel cervello, che mimano ingresso batterica nel sistema nervoso centrale. Così, questo itinerario dell'infezione può essere esteso per indagare i meccanismi della meningite causate da altri batteri. Inoltre, può anche essere utilizzato per tes...

Streptococcus suis (S. suis) è un importante agente patogeno batterico di suini in tutto il mondo, causando gravi malattie tra cui la meningite, polmonite, setticemia, endocardite e artrite1. È anche un agente zoonotico emergente. Finora, è stato segnalato che nove sierotipi possono causare infezione in esseri umani, compreso i sierotipi 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 e 312,3,4. In esseri umani e maiali, la meningite è uno dei principali segni clinici delle infezioni da S. suis . In Vietnam e Thailandia, S. suis è la principale causa della meningite in adulti5. Biofilm microbici sono microrganismi che aderiscono a vicenda e sono concentrati in un'interfaccia; Essi sono essenziali per la virulenza batterica, sopravvivenza in ambienti diversi e Antibiotico-resistenza5. I biofilm sono in genere circondati da una matrice extracellulare che generalmente contiene polisaccaridi, proteine e DNA6. Quest'ultimo è in grado di suscitare la risposta infiammatoria dell'ospite e di produzione di citochina7. Formazione di biofilm è stata segnalata per essere coinvolti nella meningite streptococcica in studi precedenti. Biofilm contribuiscono alla meningite da Streptococcus agalactiae in un modello di pesce tilapia e formazione di biofilm è stato rivelato all'interno dei tessuti del cervello e nei dintorni di meningea superfici in vivo attraverso Inoculazione intra-addominale8. Durante la meningite, lo streptococco pneumoniae è in uno stato di biofilm e batteri in un tale stato di biofilm erano più efficaci nell'induzione della meningite in un modello di infezione del mouse9. Inoltre, nel nostro precedente studio, lo stato di biofilm associato S. suis nel cervello del topo contribuisce alla virulenza batterica di sopravvivenza analisi10. Tuttavia, la prova diretta per il coinvolgimento di biofilm in S. suis meningite richiede ulteriori indagini.
Modelli animali di infezione da S. suis sono stati sviluppati nei topi utilizzando intraperitoneale (i.p.)11, intranasale (i.n.)12, endovenosa (i.v.)13e gli itinerari di intracisternal (i.c.) di infezione14, 15 , 16. Tuttavia, le vie di i.p., i.n. e i.v. di infezione non sono adatte per studiare i ruoli dei componenti di superficie di S. suis nella meningite direttamente nel cervello. Questi includono matrice extracellulare da biofilm. Anche se l'inoculazione di i.c. è stato usato per infezione da S. suis , il sito di iniezione precisa non è stata descritta in quei fascicoli. Al contrario, le coordinate stereotassiche del sito di iniezione per inoculazione subarachnoidal intracranica chiaramente è stato descritto in un precedente studio17. Questo ha permesso il facile riconoscimento del punto di inoculazione e più semplicistico protocollo sperimentale. Inoltre, l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione imita ingresso batterica nel sistema nervoso centrale da seni o l' orecchio medio17e la relazione tra l'orecchio medio e la meningite causata da S. suis è stato dimostrato da Madsen et al.18. Inoltre, applicando l'itinerario subarachnoidal intracranica dell'infezione nei topi, abbiamo dimostrato che S. suis piccolo RNA rss04 contribuisce alla meningite nel nostro precedente studio10.
Nello studio presente, l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione è stato utilizzato nei topi per indagare i ruoli di biofilm in S. suis meningite. Topi sono stati infettati con cellule planctoniche o cellule stato biofilm di S. suis da questo itinerario dell'infezione. L'analisi istopatologica e aumentata espressione di mRNA di TLR2 e citochine dal tessuto di cervello di topi iniettati con le cellule di biofilm stato chiaramente indicato che il biofilm di S. suis contribuisce alla meningite.

<table><tbody><tr><td>Todd Hewitt Brodo(THB)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>DF0492078</td><td>Sciogliere 30 g di polvere in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>DSBIO</td><td>16C0050</td><td>Sciogliere 15 g di polvere in 1 L di THB. Autoclave a 121 gradi per 15 min.</td></tr><tr><td>Sistema di purificazione dell'acqua di riferimento Milli-Q</td><td>Merck KGaA</td><td>Z00QSVCUS</td><td>senza Dnasi/ Rnasi</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO3, 0,27 g di KH2PO4 in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min. Utilizzare KOH per regolare il pH a 7,4.</td></tr><tr><td>Na2HPO3</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009012-01-09</td><td>Sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO3, 0,27 g di KH2PO4 in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min. Utilizzare KOH per regolare il pH a 7,4.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009017-01-09</td><td>Sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO3, 0,27 g di KH2PO4 in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min. Utilizzare KOH per regolare il pH a 7,4.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009019-01-09</td><td>Sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO3, 0,27 g di KH2PO4 in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min. Utilizzare KOH per regolare il pH a 7,4.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009014-01-09</td><td>Sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO3, 0,27 g di KH2PO4 in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min. Utilizzare KOH per regolare il pH a 7,4.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Diluito con un volume uguale di acqua purificata, autoclave a 121 gradi per 15 min</td></tr><tr><td>4% di paraformaldeide</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80096675</td> 25% Glutaraldehyde Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 30092436 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>diluito 10 volte con acqua purificata per il fissaggio.</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Spctrophotometer</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11 +</td><td></td></tr> <tr><td>Frantoio cellulare a ultrasuoni</td><td>NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd</td><td>JY96-IIN</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Hitachi Koki Co., Ltd</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero</td><td>Aucma Co., Ltd</td><td>DW-86L500</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Zeiss</td><td>EVO-LS10</td><td></td></tr><tr><td>FastRNA Pro Green Kit</td><td>MP Biomedicals</td> <td># 6045-050</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 Instrument</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Instrument per PCR</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>1124310110</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485689</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di reagenti PrimeScript RT con gomma</td> <td>per gDNATakara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>Processatore di tessuti completamente chiuso</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ASP200S</td><td></td></tr><tr><td>Modulo di inclusione in paraffina riscaldata</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotativo semiautomatico</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua per sezioni di paraffina</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer XL</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr></tbody></table>

intracranica subarachnoidal itinerario dell'infezione per indagare ruoli di biofilm di streptococcus suis nella meningite in un modello di infezione del topo

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Streptococcus suis è non solo un importante agente patogeno batterico di suini in tutto il mondo, ma anche un agente zoonotico emergente. In esseri umani e maiali, la meningite è una manifestazione importante di infezioni da S. suis . Un modello di infezione adatto è uno strumento essenziale per comprendere i meccanismi delle malattie causate da agenti patogeni. Diversi itinerari dell'infezione nei topi sono stati sviluppati per studiare la patogenesi dell'infezione da S. suis . Tuttavia, i percorsi intraperitoneali, intranasali ed endovenosa dell'infezione non sono adatti per studiare i ruoli dei componenti di superficie di S. suis nella meningite direttamente nel cervello, come la matrice extracellulare da biofilm. Anche se l'inoculazione intracisternal è stato utilizzato per infezione da S. suis , il sito di iniezione precisa non è stata descritta. Qui, l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione è stata descritta in un modello murino per studiare i ruoli di biofilm in S. suis meningite. S. suis cellule planctoniche o biofilm dello stato sono stati iniettati direttamente nello spazio subaracnoideo dei topi attraverso il sito di iniezione si trova 3,5 mm rostrale dal bregma. L'analisi istopatologica e aumentata espressione di mRNA di TLR2 e citochine del tessuto cerebrale da topi iniettati con le cellule di biofilm stato indicato chiaramente che S. suis biofilm svolge ruoli definitivi in S. suis meningite. Questo itinerario dell'infezione ha evidenti vantaggi rispetto ad altre vie di infezione, permettendo lo studio dell'interazione ospite-batterio. Inoltre, esso consente l'effetto di componenti batteriche sulla risposta immune dell'ospite direttamente nel cervello per essere valutati e imita ingresso batterica nel sistema nervoso centrale. Questo itinerario dell'infezione può essere esteso per indagare i meccanismi della meningite causate da altri batteri. Inoltre, può anche essere utilizzato per testare l'efficacia di farmaci contro la meningite batterica.

Analisi SEM è stato effettuato per esaminare la formazione di biofilm nelle circostanze sperimentali. Come illustrato nella Figura 1, c'è una differenza significativa nella formazione del biofilm tra cellule planctoniche (Figura 1A) e stato biofilm (Figura 1B). Analisi SEM ha mostrato che il biofilm batteri erano in ciuffi e più livelli e sono stati racchiusi nella m...

Qui, descriviamo l'itinerario subarachnoidal intracranica dell'infezione nei topi per studiare i ruoli dei biofilm nella meningite Streptococcus suis . Questo modello di infezione è anche adatto per studiare la patogenesi di altre meningite batterica e l'efficacia di nuovi farmaci contro la meningite batterica.

Intracranica Subarachnoidal itinerario dell'infezione per indagare ruoli di biofilm di Streptococcus suis nella meningite in un modello di infezione del topo

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sui ruoli dei componenti dello streptococcus suis in molti siti, come la matrice extracellulare dei suoi biofilm. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di studiare i componenti batterici che influenzano il modo in cui le risposte immunitarie direttamente in un cervello e imitano l'ingresso dei batteri nel sistema nervoso centrale. A dimostrare la procedura sarà il signor Shouming Zhang, uno studente laureato del mio laboratorio.Per raccogliere le cellule planctoniche del ceppo P1/7, raccogliere prima cinque millilitri di cellule dalla coltura in fase mid-lock. Centrifugare per tre minuti a 8000 volte G prima di lavare le celle tre volte in PBS. Risospendere le cellule con cinque millilitri di glicerolo al 25% in THB e aliquotare in cinque provette.In alternativa, per raccogliere le cellule dello stato del biofilm del ceppo P1/7, prelevare 20 millilitri di una coltura notturna e aggiungere 180 millilitri di THB fresco. Dividere equamente la coltura diluita in 10 piastre di coltura rotonde, quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 24 ore. Dopo l'incubazione, agitare delicat

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Zhang, S., et al. Via di infezione intracranica subaracnoide per l'indagine sui ruoli di Streptococcus suis Biofilms nella meningite in un modello di infezione murina. J. Vis. Esp. (2018).Questo video dimostra la rilevazione dell'espressione genica bersaglio nel cervello di un topo infetto da batteri. L'RNA viene estratto, trattato con un enzima degradante del DNA e trascritto inversamente in cDNA. Il cDNA viene amplificato tramite ciclo termico con primer specifici per gene, mentre un...

Rilevamento dell'espressione del genico bersaglio in un cervello di topo infettato da batteri

Fonte: Lenhard, A. et al. Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno dopo la co-infezione virale riproduce la malattia aggravata dall'età. J. Vis. Esp. (2022)Questo video mostra un modello di co-infezione topina in cui il virus influenzale innesca la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno. Descrive le fasi coinvolte nella colonizzazione batterica, nelle infezioni virali e nella progressione della malattia.

Un modello murino per studiare la transizione patogena di Streptococcus pneumoniae dopo la co-infezione virale

In questo video, dimostriamo la somministrazione intracisternale di Neisseria meningitidis in un modello murino per generare l'infezione da meningite.

Somministrazione intracisternale di meningococchi in modelli murini per indurre la meningite meningococcica

Neisseria meningitidis è un agente patogeno specifico umano che infetta i vasi sanguigni. In questo protocollo microvasi umani vengono introdotti in un topo da innesto di pelle umana su topi immunocompromessi. I batteri aderiscono ampiamente ai vasi umani, con conseguente danno vascolare e lo sviluppo del rash purpurica tipicamente osservato in casi umani.

Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

Modelli animali hanno dimostrato di essere strumenti preziosi nella definizione di accoglienza e patogeni meccanismi specifici che contribuiscono allo sviluppo di infiammazione cronica. Qui si descrive un modello murino di infezione orale con il patogeno umano Porphyromonas gingivalis e le metodologie di dettaglio per valutare la progressione di infiammazione nei siti locali e sistemiche.

Un modello di topo per patogeni indotta infiammazione cronica a siti locali e sistemici

Qui, una procedura è descritta per la creazione di infezione sistemica nel ratto neonatale con colture di Escherichia coli K1. Questa procedura non invasiva consente colonizzazione del tratto gastrointestinale, traslocazione del patogeno alla circolazione sistemica, e l'invasione del sistema nervoso centrale al plesso coroide.

Non invasiva Modello di neuropatogeno Escherichia coli L'infezione neonatale nel ratto

Lo Streptococcus pneumoniae forma lesioni microscopiche discrete non purulente nel cuore. Viene delineato il protocollo per un modello murino di formazione di microlesioni cardiache. Vengono fornite istruzioni sulla visualizzazione delle microlesioni mediante microscopia, sulla discriminazione tra microlesioni precoci e tardive e sui metodi per rilevare il rimodellamento cardiaco nei cuori degli animali convalescenti.

Visualizzazione<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Entro cardiache microlesioni e successive rimodellamento cardiaco

Qui, descriviamo un metodo per indurre la meningite meningococcica attraverso una via intracisternale di infezione nei topi adulti. Vi presentiamo un protocollo passo dopo passo dell'infezione da meningococco dalla preparazione dell'inoculum all'infezione intracisternale; quindi registrare la sopravvivenza animale e valutare i carichi batterici nei tessuti murini.

Indurre Meningococcal Meningitis Serogroup C in Topi tramite consegna intracisternale

Questo articolo descrive un nuovo modello murino per la transizione dello pneumococco da colonizzatore asintomatico a patogeno che causa malattie durante l'infezione virale. Questo modello può essere facilmente adattato per studiare le interazioni polimicrobiche e ospite-patogeno durante le diverse fasi della progressione della malattia e tra vari ospiti.

Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno in seguito a co-infezione virale ricapitola la malattia esacerbata dall'età

Il presente protocollo descrive un modello murino che impiega l'impianto dorsale sottocutaneo per studiare le infezioni associate all'impianto, consentendo un'indagine completa dei meccanismi fisiopatologici e supportando lo sviluppo di criteri diagnostici con strategie terapeutiche mirate.

Modello animale di infezioni associate all'impianto nei topi

Qui presentiamo un protocollo per stabilire un modello di immunosoppressione per la sepsi del topo tramite instillazione intranasale di Klebsiella pneumoniae e convalidiamo il modello attraverso vari indicatori.

Stabilimento di un modello di immunosoppressione indotta dalla sepsi nel topo tramite instillazione intranasale di batteri

Scopri un modello di infezione intracranica subaracnoidea nel topo per studiare il ruolo dei biofilm di Streptococcus suis nella meningite batterica e valutare nuove terapie.

Intracranica Subarachnoidal itinerario dellinfezione per indagare ruoli di biofilm di Streptococcus suis nella meningite in un modello di infezione del topo (Video) | JoVE Journal

Intracranica Subarachnoidal itinerario dell'infezione per indagare ruoli di biofilm di Streptococcus suis nella meningite in un modello di infezione del topo

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