Un metodo di preparazione efficiente dei campioni per migliorare i segnali dello ione del carboidrato in spettrometria di massa di Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization

È stata sviluppata una semplice procedura di preparazione del campione per migliorare il metodo convenzionale nella spettrometria di massa a ionizzazione a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice, riformando la morfologia semplice durante il processo di essiccazione. Il vantaggio di questa tecnica è che l'intensità del segnale dei campioni di carboidrati preparati con questo metodo ottimizzato può essere efficacemente migliorata. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la fase di depressurizzazione del metanolo è molto cruciale e deve essere eseguita in una volta sola.

Qualsiasi esitazione ridurrà la qualità dei dati. Per iniziare, indossando guanti in nitrile, utilizzare 100 millilitri di soluzione detergente per lavare a mano la piastra del campione. Usa acqua distillata-deionizzata, o DD, per lavare a mano il piatto.

Quindi, con 30 millilitri di metanolo, sciacquare la sua superficie. Inserire la piastra del campione in un becher da 600 millilitri e riempirla con acqua DD fino a quando la piastra non è completamente immersa. Quindi posizionare il becher in un bagno a ultrasuoni e sonicare la piastra per 15 minuti.

Rimuovere la piastra del campione dal becher e utilizzare azoto pressurizzato per soffiare via le gocce d'acqua. Quindi depositare 0,2 microlitri di metanolo sulla piastra del campione per verificare se si diffonde in altri punti. In tal caso, ripetere il lavaggio, la sonicazione e il trattamento con azoto come appena dimostrato.

Dopo aver preparato la camera di essiccazione secondo il protocollo di testo, premiscelare 0,25 microlitri di soluzione di acido 2,5-diidrossibenzoico e 0,25 microlitri di Sialyl-Lewis A, o soluzione di maltoeptaosio nella provetta della microcentrifuga. Quindi agitare il tubo per tre secondi. Centrifugare la soluzione miscelata nella mini centrifuga a 2000 volte G per due secondi.

Quindi pipettare immediatamente 0,1 microlitri della soluzione premiscelata sulla piastra del campione. Quando il campione si è asciugato, lavorando rapidamente per evitare l'evaporazione, pipettare 0,2 microlitri di metanolo direttamente sul punto del campione. Il campione si dissolverà nuovamente e poi si asciugherà immediatamente.

La fase di deposizione del metanolo è la fase più difficile che determina la qualità e la riproducibilità dei dati. Per garantire le migliori prestazioni, si consiglia all'utente di terminare la deposizione in tre o cinque secondi per evitare una significativa perdita di metanolo per evaporazione. Indossare guanti in nitrile e rimuovere con cautela la piastra del campione dalla camera di essiccazione.

Quindi, al microscopio, esaminare il campione. Se le morfologie dei cristalli non sono quelle previste, ripetere la miscelazione del campione e l'individuazione sulla piastra del campione. Per garantire che i cristalli del campione abbiano la morfologia ottimale dopo la ricristallizzazione, utilizzare sempre un microscopio per esaminarli.

È difficile determinare correttamente la qualità della morfologia dei cristalli ad occhio nudo. Per analizzare un campione da un microlitro, premiscelare 2,5 microlitri di soluzione di acido 2,5-diidrossibenzoico e 2,5 microlitri di soluzione di Sialyl-Lewis A o maltoeptaosio in una provetta per microcentrifuga. Agitare la soluzione premiscelata per cinque secondi.

Centrifugare la soluzione miscelata a 2000 volte G per due secondi, quindi pipettare immediatamente un microlitro della soluzione premiscelata sulla piastra del campione. Dopo che il campione si è asciugato, pipettare 1,5 microlitri di metanolo direttamente sul punto del campione essiccato. Il campione si dissolverà nuovamente e si asciugherà immediatamente.

Rimuovere con cautela il campione dalla camera di essiccazione. Esaminare il campione al microscopio. Se le morfologie dei cristalli non sono quelle previste, ripetere la preparazione della soluzione come appena dimostrato.

Per eseguire la spettrometria di massa, aprire il software di controllo dello spettrometro di massa e inserire la piastra di campionamento nella macchina. Selezionare il metodo di acquisizione dati pre-ottimizzato nel software, quindi utilizzare il software di imaging, registrare l'intera regione del campione per la spettrometria di massa di imaging. Avviare l'acquisizione dei dati in modalità batch del software di controllo.

Al termine dell'acquisizione dei dati, utilizzare il software di imaging per tracciare le immagini ioniche e analizzare i dati secondo il protocollo di testo. Immagini SEM rappresentative di Sialyl-Lewis A miscelato con acido 2,5-diidrossibenzoico preparato utilizzando goccioline essiccate e metodi di ricristallizzazione sono mostrate qui. Una tipica morfologia dell'acido 2,5-diidrossibenzoico è costituita da grandi cristalli aghiformi sul bordo e strutture cristalline fini al centro dei punti del campione.

Dopo la ricristallizzazione da parte del metanolo, il campione ha un'area più ampia ricoperta uniformemente da cristalli fini simili a scaglie. Questa figura mostra i risultati della spettrometria di massa per imaging di Sialyl-Lewis A e maltoeptaosio con e senza ricristallizzazione del metanolo. Dopo la ricristallizzazione, la distribuzione dei segnali di Sialyl-Lewis A e maltoepapoosio corrisponde bene con le immagini in campo chiaro dei punti campione.

Anche l'intensità del segnale dei campioni di carboidrati ricristallizzati è migliorata rispetto ai campioni di goccioline secche convenzionali. Questo grafico confronta l'intensità del segnale dei carboidrati in modalità ionica sodata o positiva e dei carboidrati in modalità ionica deprotonata o negativa di campioni ricristallizzati rispetto a quella dei campioni di goccioline essiccate. In media, la ricristallizzazione dei campioni di Sialyl-Lewis A e maltoeptaosio ha aumentato i segnali sodati di fattori 3,9 e 3,3.

I segnali degli ioni Sialyl-Lewis A deprotonati sono stati potenziati di un fattore di 4,7 dopo la ricristallizzazione. Una volta padroneggiati, i campioni possono essere preparati in 10 minuti utilizzando questa tecnica, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante che la gocciolina di metanolo venga depositata immediatamente e con precisione sul punto del campione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come controllare efficacemente la morfologia cristallina di più campioni per ottenere i migliori segnali ionici per l'analisi di routine.