Name: Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Impara a fabbricare piastre con nanopattern a gradiente tramite nanoimprinting termico per studiare la risposta delle cellule endoteliali umane. Questo metodo riproducibile consente di analizzare gli effetti degli stimoli fisici sul comportamento cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell'istruzione, scienza e tecnologia (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] e Bio & Medical Technology Development Programma della NRF finanziato dal Ministero della scienza, ICT & futuro pianificazione [NRF-2017M3A9C6029563].

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Fabbricazione di un AAO spesso soffre di difetti quali cricche, forme irregolari di pori e la masterizzazione. La ragione principale di questi difetti è chiamata un breakdown elettrolitico, che è fortemente influenzata dalla natura dei substrati metallici essendo anodizzato e la resistività del elettroliti21. Poiché la resistività dell'elettrolito varia a seconda della sua temperatura, eliminando calore continuamente dagli elettrodi è il punto critico per mantenere la temperatura tra piazze dell'e...

Recentemente, la risposta delle cellule dalla stimolazione fisica della topografia superficiale è stato messo in luce nel campo della cella ingegneria1,2,3,4. Di conseguenza, si è concentrati più su nanostrutture tridimensionali al superficie cellulare allegato5. È stato segnalato che l'integrina, che è il dispositivo di riconoscimento superficie della cella, trasmette lo stimolo fisico guidato dalle strutture micro-nano di ECM a Meccano-trasduzione6. Questa stimolazione meccanica regola il comportamento delle cellule attraverso contatto Guida7 e induce la riorganizzazione del citoscheletro di cambiare forma, oltre alle adesioni focali e la rigidità delle cellule8.
Cellule progenitrici endoteliali umane (hEPCs) del corpo interagiscono strettamente con il microambiente circostante ECM9. Questo indica che lo stato fisico del ECM si comporta come un parametro importante per la formazione di complessi di adesione cellula-matrice specifica come shear stress derivato da sangue flusso10. È stato riferito che nanotopography superficie migliora la formazione in vitro di vasto tubo capillare reti di hEPCs11 e che un fattore solubile di ECM/bio sistema combinato consente hEPCs di riconoscere substrati disfunzionale e promuove Wound healing12,13. Tuttavia, il rapporto tra ECM e hEPCs non è chiaro.
Anche se molti ricercatori hanno cercato di chiarire il rapporto tra le risposte delle cellule e fisici spunti da diversi substrati14,15,16, questi studi utilizzati solo la dimensione fissa di una nanostruttura o nanopatterns con regime irregolare che hanno una limitazione per chiarire la relazione tra le dimensioni del comportamento delle cellule e nanostrutture. Il problema qui è una mancanza di idonei strumenti per lo screening delle risposte cellulari che possono sostituire approcci esistenti noiosi e iterativi per trovare la dimensione ottimale della nanostruttura. Di conseguenza, una tecnica semplice è richiesta per le reazioni di cella su stimolazioni fisiche senza ripetizione della selezione.
Qui, descriviamo un metodo utilizzato nella nostra precedente report17,18,19 per produrre un gradiente GNSM in cui il diametro della nanopillars organizzato aumenta progressivamente. Inoltre, abbiamo anche descritto come coltivare e analizzare il comportamento del hECFCs il gradiente GNSM piastre per determinare l'effetto di stimoli fisici sulle cellule. Un lieve anodizzazione, acquaforte graduale e metodo di rivestimento antiaderente strato sono stati utilizzati per fabbricare il gradiente della muffa AAO. Adottando una termica imprinting tecnica di Litografia, identico in polistirolo nanopatterns gradiente sono state prodotte in modo conveniente e facile. Utilizzando nanopatterns gradiente, è fattibile per determinare quale dimensione di nanostruttura ha un grande effetto sul comportamento delle cellule in un unico set di esperimento. Ci aspettiamo che questo gradiente GNSM sarà utile nella comprensione dei meccanismi di interazione tra hECFC derivate dal sangue o altre cellule e varie misure di nanostrutture.

<table><tbody><tr><td>Acido perclorico 60%</td><td>Daejung Chemicals & Metalli</td><td>6512-4100</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico, assoluto 99,9%</td><td>Daejung Chemicals & Metalli</td><td>4118-4100</td><td></td></tr><tr><td>Acido fosforico 85%</td><td>Daejung Chemicals & Metalli</td><td>6532-4400</td><td></td></tr><tr><td>Alcool metilico 99,5%</td><td>Daejung Chemicals & Metalli</td><td>5558-4400</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di cromo (VI)</td><td>Daejung Prodotti chimici e Metalli</td><td>2558-4400</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico 95%</td> <td>Daejung Chemicals & Metalli</td><td>7781-4100</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno 30%</td><td>Daejung Chemicals & Metalli</td><td>4104-4400</td><td></td></tr><tr><td>n-esano 95%</td><td>Daejung Prodotti chimici & Metalli</td><td>4081-4400</td><td></td></tr><tr><td>Toluene 99,5%</td><td>Daejung Prodotti chimici e Metalli</td><td>8541-4400</td><td></td></tr> <tr><td>(eptadecafluoro-1,1,2,2,-tetraidrodecil)dimetilclorosilano</td><td>Gelest</td><td>SIH5840.4</td><td>Sensibile all'umidità</td></tr><tr><td>Metossinonafluorobutano 99%</td><td>Sigma aldrich</td><td>464309</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di collagene</td><td>Stemcell</td><td>#4902</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1890</td><td>Soluzione di rivestimento</td></tr> <tr><td>proteicoFicoll-Paque</td><td>GE Heathcare</td><td>17-1440-03</td><td>Soluzione polisaccaridica idrofila</td></tr><tr><td>EGM-2MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>Mezzo di espansione delle cellule endoteliali</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma aldrich</td><td>G5882-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio</td><td>Sigma aldrich</td><td>201030-1G</td><td></td></tr><tr><td>Esametildisilazano</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Ottilfenolo etossilato...</td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo primario anti-vinculina umana&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Sonda F-actina</td><td>Sonde molecolari</td><td>A12379</td><td>Falloidina coniugata a fluorescenza</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-coniugato anti-topo&nbsp; </td><td>Sonde molecolari</td> anticorpo IgG <td>A11001</td><td>Anticorpo secondario coniugato a fluorescenza&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primario vWF anti-umano&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano&nbsp; Anticorpo primario CD144&nbsp;</td><td>BD Bioscienze</td><td>#555661</td><td></td></tr><tr><td>Eponate 12&commercio; Kit di inclusione, con BDMA</td><td>Ted Pella</td><td>18012</td><td>Resina epossidica</td></tr><tr><td>Acetato di uranile, 25 g</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di piombo, triidrato, 10 g</td><td>Ted Pella</td><td>19312</td><td></td></tr><tr><td>Piastra in alluminio ultra puro</td><td>Goodfellow</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di polistirene</td><td>Goodfellow</td><td>ST313120</td><td></td></tr><tr><td>8,0" wafer di silicone</td><td>Siltron</td><td>29-01024-03</td><td>Lato singolo lucido, 725 &; m spessore</td></tr><tr><td>Essiccatore a vuoto, 4,4 L</td><td>Kartell</td><td>KA.230</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>Aspiratore</td><td>V3. VOP100</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>Unicorntech</td><td>UDP-3003</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>Daihan scientific</td><td>SL. </td><td></td>SMS03022</tr><tr><td>Agitatore ad asta</td><td>Daihan scientific</td><td>HT120DX</td><td></td></tr><tr><td>Circolatore</td><td>Daihan scientific</td><td>WCR-P12</td><td></td></tr><tr><td>Tavolino mobile lineare</td><td>Zaber</td><td>A-LSQ300A-E01-KT07</td><td></td></tr><tr><td>Staffa angolare, 90 gradi</td><td>Zaber</td><td>AB90M</td> Accessorio della pinza PMP del <td>tavolino mobile lineare</td></tr><tr><td>, 145 mm</td><td>Vitlab</td><td>67995</td><td>Pinzetta non metallica</td></tr><tr><td>Bicchiere in PTFE, 250 mL</td><td>Cowie</td><td>CW007.25</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr><tr><td>Taglierina per PCB</td><td>Hozan Tool Dispositivo industriale</td><td>K-110</td><td></td></tr><tr><td>Nanoimprint</td><td>Nanonex</td><td>NX-2000</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di plasma di ossigeno</td><td>Femto Science</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a bassa temperatura</td><td>Lowtem</td><td>Crystal 50</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubatore</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Confoal microscopio a scansione laser</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>JEOL</td><td>JSM6701</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>Hitachi</td><td>H-7500</td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di gnsm gradiente termico nanoimprinting tecnica e screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography può essere trovato in varie matrici extracellulari (ECMs) intorno al corpo ed è conosciuto per avere importanti atti normativi su reazioni cellulari. Tuttavia, è difficile da determinare la relazione tra le dimensioni di una nanostruttura e le risposte delle cellule a causa della mancanza di un'adeguata selezione di strumenti. Qui, ci mostra lo sviluppo delle piastre GNSM gradiente riproducibile ed economica per la manipolazione delle risposte cellulari. Utilizzando ossido di alluminio anodico (AAO) come uno stampo master, gradiente GNSM piastre con nanopillars delle gamme di diametro crescente [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) e 280-360 nm (GP 280/360)] sono stati fabbricati da una termica imprinting tecnica. Queste piastre di gradiente GNSM sono state progettate per imitare le varie dimensioni dei nanotopography in ECM e sono state utilizzate per lo screening delle risposte delle cellule formanti colonie endoteliali umane (hECFCs). In questo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata di fabbricare gradiente GNSM piastre per ingegneria, tecniche di coltivazione hECFCs da sangue periferico umano e hECFCs il GNSM piastre di coltura delle cellule.

La figura 1 Mostra immagini di SEM degli stampi AAO gradienti fabbricati secondo il loro tipo e la posizione. La figura 2 Mostra immagini di SEM di gradiente GNSM piastre con nanopillars regular-arrotondato, e nella figura 3 è dati di quantificazione del diametro nanopillars. La tabella 1 elenca le caratteristiche della nanopillars fabbricato.
<p class="jove_content" fo:keep-...

Qui, presentiamo un protocollo per la fabbricazione di piastre gradiente GNSM via nanoimprinting termica e il metodo di screening risposte di cellule progenitrici endoteliali umane alle nanostrutture. Utilizzando la tecnologia descritta, è possibile produrre un ponteggio che può manipolare il comportamento delle cellule di stimoli fisici.

Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Il vantaggio principale di questa tecnica è che può produrre pattern di gradiente con un'elevata riproducibilità e ha permesso lo screening della risposta cellulare alle strutture osservative dei parassiti. La risposta osservata alla stimolazione fisica non è ancora completamente scoperta. Crediamo che il nostro metodo sarà uno strumento essenziale per scoprire questi meccanismi sconosciuti.Per iniziare, collegare un becher a doppia camicia contenente la soluzione di elettrolucidatura a un circolatore e impostare la temperatura a sette gradi Celsius. Lasciare la soluzione sotto mescolando per almeno 30 minuti fino a quando la temperatura scende a sette gradi Celsius. Immergere la piastra in alluminio ultrapuro e il controelettrodo in carbonio nella soluzione di elettrolucidatura utilizzando clip a coccodrillo e filo di rame.Regolare la posizione della piastra di alluminio nel controelettrodo in carbonio in modo che sia uno di fronte all'altro. Collegare la piastra in alluminio al terminale positivo e collegare il controelettrodo in carbonio al terminale negativo di un alimentatore a corrente continua. Dopo aver applicato una tensione di 20 volt, la piastra di alluminio passa dall'a

fabrication-gradient-nanopattern-thermal-nanoimprinting-technique

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Abbiamo descritto un protocollo per la microfabbricazione del gradiente apparecchio che può generare microfluidi che possono generare gradienti spaziali e temporali ben definite microambiente. In questo approccio, il gradiente di generazione dispositivo a microfluidi può essere utilizzato per studiare la migrazione delle cellule diretto, l'embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi del cancro.

Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

In questo protocollo, dimostriamo la fabbricazione di substrati di coltura cellulare cardiaca biomimetica realizzati con due materiali polimerici distinti utilizzando la litografia a forza capillare.  I metodi descritti forniscono una tecnica scalabile ed economica per ingegnerizzare la struttura e la funzione dei tessuti cardiaci macroscopici per applicazioni in vitro e in vivo.

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Un metodo per l'assemblaggio di gradienti adesivi e solubile in una camera per gli studi di microscopia vivi migrazione cellulare è descritto. L'ambiente di ingegneria combina superfici antivegetative e le tracce adesive con pendenze soluzione e permette quindi di determinare l'importanza relativa di spunti di orientamento.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Segnaliamo su tecniche per micropattern nanoporosi film sottili di oro tramite la stampa stencil e fotolitografia, così come i metodi di cellule di coltura, su modelli di microfabbricati. Inoltre, si descrivono metodi di analisi di immagine per caratterizzare morfologia del materiale e le cellule in coltura mediante scansione elettronica e tecniche di microscopia a fluorescenza.

Microfabrication di Patterns Oro nanoporosi per Cell-materiali Interaction Studies

Descriviamo un protocollo per modificare l'affinità cellulare di una superficie di scaffold in ambiente acquoso. Il metodo sfrutta la fotocatalisi del biossido di titanio per decomporre il film organico nella regione foto-irradiata. Mostriamo che può essere utilizzato per creare microdomini di proteine di impalcatura, sia ex situ che in situ.

Photopatterning proteine ​​e cellule in acquosa ambiente utilizzando TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Fotocatalisi

Questo articolo introduce un approccio semplice per fornire ceppi statici gradiente discontinuo su un idrogel di cella-carichi concentrici per regolare l'allineamento di cella per l'ingegneria tissutale.

Gradiente di deformazione Chip per comportamenti stimolanti cellulari in cella-carichi idrogel

Viene presentato un protocollo per la produzione di una vasta area di substrato nanostrutturato da piccoli stampi nanomodellati per lo studio della modulazione nanotopografica del comportamento cellulare.

Espansione nanostrutturati Substrati utilizzando la tecnica del punto per Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento

Il controllo dei gradienti chimici e di ossigeno è essenziale per le colture cellulari. Questo articolo riporta un dispositivo microfluidico in polidimetilsilossano-policarbonato (PDMS-PC) in grado di generare in modo affidabile combinazioni di gradienti chimici e di ossigeno per studi di migrazione cellulare, che può essere praticamente utilizzato nei laboratori biologici senza strumentazione sofisticata.

Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

Questo articolo descrive la metodologia dettagliata per preparare una matrice Multiplexed artificiale microambiente cellulare (MACME) per manipolazione di alto-rendimento di fisica e chimica di stecche che imita in vivo cellulare microambienti e a identificare l'ambiente cellulare ottima per le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) con l'analisi di singole cellule.

Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

Presentiamo un protocollo per la produzione ad alta produttività di canali vascolari con dimensioni flessibili e modelli desiderati su una piastra standard a sei pozzetti utilizzando la tecnologia di bioprinting 3D, denominata vessels-on-a-plate (VOP). Questa piattaforma ha il potenziale per far progredire lo sviluppo di terapie per i disturbi associati all'endotelio compromesso.

Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli

Impara a fabbricare piastre con nanopattern a gradiente tramite nanoimprinting termico per studiare la risposta delle cellule endoteliali umane. Questo metodo riproducibile consente di analizzare gli effetti degli stimoli fisici sul comportamento cellulare.

Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie (Video) | JoVE Journal

Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie

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