Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie

Il vantaggio principale di questa tecnica è che può produrre pattern di gradiente con un'elevata riproducibilità e ha permesso lo screening della risposta cellulare alle strutture osservative dei parassiti. La risposta osservata alla stimolazione fisica non è ancora completamente scoperta. Crediamo che il nostro metodo sarà uno strumento essenziale per scoprire questi meccanismi sconosciuti.

Per iniziare, collegare un becher a doppia camicia contenente la soluzione di elettrolucidatura a un circolatore e impostare la temperatura a sette gradi Celsius. Lasciare la soluzione sotto mescolando per almeno 30 minuti fino a quando la temperatura scende a sette gradi Celsius. Immergere la piastra in alluminio ultrapuro e il controelettrodo in carbonio nella soluzione di elettrolucidatura utilizzando clip a coccodrillo e filo di rame.

Regolare la posizione della piastra di alluminio nel controelettrodo in carbonio in modo che sia uno di fronte all'altro. Collegare la piastra in alluminio al terminale positivo e collegare il controelettrodo in carbonio al terminale negativo di un alimentatore a corrente continua. Dopo aver applicato una tensione di 20 volt, la piastra di alluminio passa dall'avere una superficie ruvida e priva di lucentezza ad avere una superficie a specchio di colore argento.

Per eseguire l'anodizzazione primaria, versare un litro di elettrolita in un becher a doppia camicia da due litri. Immergere la piastra in alluminio lucidato e il controelettrodo in carbonio nella soluzione con clip a coccodrillo in filo di rame. Installare un albero verticale su un piedistallo a forma di U.

Fissare un agitatore ad asta e una girante utilizzando morsetti metallici. Posizionare l'elica della girante vicino all'estremità inferiore di entrambi gli elettrodi. Impostare la velocità di rotazione dell'agitazione sopra la testa tra 200 e 300 giri/min e applicare una tensione di 195 volt sotto agitazione per 16 ore.

Dopo l'anodizzazione primaria, il colore della piastra di alluminio cambia da argento a grigio. Per eseguire il prurito dell'allumina, immergere la piastra di alluminio anodizzato nella soluzione di mordenzatura. Sigillare la parte superiore del bicchiere con un foglio di alluminio e lasciare mescolare per almeno 10 ore.

Durante la fase di incisione, il colore della lastra di alluminio cambia dal grigio al bianco. Per l'anodizzazione secondaria, impostare le stesse condizioni sperimentali dell'anodizzazione primaria e applicare nuovamente una tensione di 195 volt per sei ore. Dopo l'anodizzazione secondaria, il colore della piastra di alluminio cambia da bianco a grigio.

Per eseguire l'allargamento dei pori a gradiente, collegare prima il becher a doppia camicia contenente una soluzione di acido fosforico al circolatore e impostare la temperatura a 30 gradi Celsius. Posizionare un tavolino mobile lineare verticalmente accanto al becher e fissare una staffa alla parte mobile del tavolino lineare. Impostare la parte mobile del tavolino lineare sulla posizione iniziale.

Fissare la clip della staffa e caricare la piastra in alluminio anodizzato. Manipolare manualmente la posizione della piastra di alluminio in modo che la piastra di alluminio arrivi proprio sopra la superficie della soluzione. Immergere gradualmente la piastra di alluminio nella soluzione a una velocità di quattro virgola otto sei micron al secondo per 120 minuti per realizzare uno stampo AAO da 35 millimetri con un gradiente dimensionale da 120 nanometri a 200 nanometri.

Avvia un cronometro nel momento in cui la piastra di alluminio tocca la superficie della soluzione. Trascorsi 100 minuti, metà dello stampo AAO dovrebbe essere nella soluzione. Per realizzare stampi GP da 200 a 280 e GP da 280 a 360, immergere l'intera area dello stampo GP da 120 a 200 nella soluzione di allargamento dei pori rispettivamente per due o quattro ore.

Immergere lo stampo AAO e la soluzione di piranha per 30 secondi utilizzando una pinzetta non metallica. Sciacquare più volte lo stampo AAO con acqua deionizzata. Immergere lo stampo in acqua deionizzata per 30 minuti e metterlo in alcool metilico per altri 30 minuti.

Asciugare completamente lo stampo AAO sottovuoto per tre ore. Per la deposizione di monostrati autoassemblati, immergere lo stampo AAO in 57 millilitri di filtrato ed esano e in un becher da 100 millilitri. Quindi aggiungere tre millilitri di soluzione madre di HDFS all'esano N per ottenere una soluzione HDFS da 2,9 millimolari e attendere 10 minuti affinché la reazione proceda.

Dopo aver trasferito lo stampo AAO in fresco ed esano, immergere lo stampo AAO in 60 millilitri di metossi-nonafluorobutano. Pulire con gli ultrasuoni lo stampo AAO in un becher per 10 secondi alla volta per rimuovere le molecole di HDFS adsorbite fisicamente. Ripetere la procedura di pulizia 10 volte prima di asciugare lo stampo AAO sotto vuoto per 24 ore.

Taglia un foglio di polistirene di un punto e uno spessore di un millimetro a una dimensione di due virgola nove millimetri di larghezza per tre virgola sette millimetri di lunghezza usando una taglierina per circuiti stampati. Lavorando in camera bianca, tagliare lo stampo AAO a 35 millimetri dal fondo utilizzando una tronchesina. Contrassegnare il nome del campione e il produttore dei dati sul retro.

Pulire un wafer da otto virgola zero pollici con la piccola dose di alcol etilico, quindi mettere i fogli di polistirolo sul wafer e montare lo stampo AAO. Quindi, metti la pellicola inferiore nel cassetto di una stampante termica e attacca la pellicola superiore alla guarnizione, quindi metti il wafer sulla pellicola inferiore e posiziona la guarnizione sul wafer. Assicurarsi che non ci sia polvere sul wafer.

Dopo aver chiuso il cassetto della termica e della stampante, applicare 165 gradi Celsius di calore e 620 virgola cinque/due kilopascal di pressione da 100 secondi. Quindi raffreddare il campione a temperatura ambiente. Una volta raffreddata, sfiatate la camera e la pressione scenderà a zero chili Pascal.

Attorcigliare delicatamente il foglio di polistirolo per rilasciare lo stampo AAO. Raccogli 50 millilitri di sangue umano usando una provetta inibitrice dell'eparina. Mettere sei millilitri di soluzione di polisaccaridi idrofili in una provetta da 15 millilitri e aggiungere otto millilitri di sangue alla soluzione di polisaccaridi idrofili.

Un sangue deve essere raccolto immediatamente e aggiunto lentamente sopra la soluzione polisaccaridica idrofila. Dopo aver centrifugato la provetta a 1020 volte G per 20 minuti per pellettare le cellule, raccogliere lo strato di cellule opaco e trasferirlo in una nuova provetta da 15 millilitri. A 10 millilitri di PBS contenente il 10% di FBS in centrifuga, centrifugare la provetta a 1020 volte G per 10 minuti per pellettare le cellule.

Rimuovere il surnatante e aggiungere il tampone di lisi dei globuli rossi. Dopo l'incubazione su ghiaccio per cinque minuti a PBS contenente il 10% di FBS e centrifugare la provetta a 1020 volte G per cinque minuti per pellettare le cellule. Rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di terreno di espansione delle cellule endoteliali integrato con il 10% di FBS.

Seminare otto virgola zero milioni di cellule per pozzetto per ogni piatto codificato con collagene. Indurre le cellule formanti la colonia umana ed eterea come descritto nel protocollo di testo e far crescere le cellule fino al passaggio sette per ulteriori esperimenti. Quindi, rivestire le piastre con nano pattern a gradiente con un millilitro di soluzione di rivestimento proteico all'uno percento di zero virgola in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.

Effettuare una sospensione di ECFC umane dal piatto di coltura con un metodo standard di scissione cellulare utilizzando la tripsina. Dopo aver diluito la sospensione cellulare per ottenere la confluenza desiderata, seminare le ECFC umane cessano sulle piastre del nano pattern a gradiente in un controllo piatto. Coltivare le cellule su piastre piatte o gradienti per due giorni nell'incubatore.

Queste immagini mostrano gli stampi AAO fabbricati in tre diverse condizioni di allargamento del getto. Un lato con il tempo più breve immerso nella soluzione di mordenzatura con acido fosforico ha la dimensione dei pori più piccola, mentre l'altro lato con il tempo più lungo nella soluzione di mordenzatura ha la dimensione dei pori più grande. Poiché il nano pattern è stato trasferito al polistirene attraverso il metodo dell'imprinting termico, sulla superficie del polistirene vengono generate strutture di nano pilastri e il gradiente dimensionale dello stampo AAO viene mantenuto nelle piastre del nano pattern.

Le ECFC umane confluenti hanno mostrato una tipica morfologia simile a quella dei ciottoli che informa una colonia che può essere facilmente distinta al microscopio a contrasto di fase. Dopo due giorni di coltivazione di ECFC umani in piano in piastre a gradiente nano pattern, è stata osservata una significativa crescita dei filopodi nelle cellule coltivate con GP da 120 a 200. Al contrario, non è stato osservato alcun cambiamento significativo nei GP da 200 a 280 o nei GP da 280 a 360 rispetto al controllo piatto.

Questo risultato indica che la risposta delle cellule è diversa a seconda delle dimensioni della nanostruttura superficiale. Ci sono molti passaggi per fabbricare una piastra nano pattern. Quindi all'inizio può essere complicato, ma una volta padroneggiato, otterrai modelli con il gradiente di dimensioni dei desideri senza alcuna difficoltà.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una grande comprensione di come produrre piastre con modello nano gradiente e la coltivazione per l'uomo e la serie di formazione di colonie più stupida sulla piastra con modello nano. Anche questo metodo è disponibile per vari tipi di serie. Questo metodo può fornire un ponte tra l'ingegneria dei materiali e la biotecnologia che aiuterà a comprendere le iniezioni di cellule e la nanotopografia di superficie.