Name: Stampato Glycan Array: Una tecnica sensibile per lanalisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Impara l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nel siero di piccoli animali mediante tecnologia di microarray di glicani stampati. Questo metodo consente di misurare centinaia di bersagli glicanici con elevata sensibilità utilizzando volumi minimi di campione.

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Questo lavoro è stato supportato da "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) concedere PI13/01098 da Carlos III Health Institute, Ministero della salute spagnolo. DB-G è stato beneficiato da una posizione di post-dottorato di ricerca finanziata dal Unione europea settimo programma quadro (FP7/2007-2013) sotto il 603049 di accordo Grant (TRANSLINK). Lavoro di NK, NS e NB è stato supportato da grant #14-50-00131 di russo Science Foundation. DB-G vuole esprimere la sua gratitudine a Marta Broto, J. Pablo Salvador e Ana Sanchis per l'eccellente assistenza tecnica e Alexander Rakitko per assistenza nell'analisi statistica. Con il supporto della "Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats ho Recerca del Departament aziendali ho Coneixement Gestio Guida de la Generalitat de Catalunya (grant numero 2018 DI 021). Ringraziamo CERCA programma / Generalitat de Catalunya per sostegno istituzionale.

1. Glycochips produzione
<ol><li>
Preparazione di microarray
	<ol>
<li>Stampare i glicani (50 mM) e polisaccaridi (10 µ g/mL) in 300 millimetri di fosfato soluzione salina tamponata (PBS, pH 8.5) alle 6 replica su N-Idrossisuccinimide-derivatizzati vetrini, utilizzo di non-contatto arrayer robotico (drop volume ~ 900 pL). Ogni diapositiva contiene 4 diversi blocchi di sottomatrici (Figura 1A, a colori) ripetuti 6 volte. Ogni singola matrice secondaria è formata da 112 glycan diversi luoghi, tra cui controlli (8 righe × 14 colonne) (Figura 1B). Nota: Informazioni relative alla Glycan sono forniti nel complementare nella tabella 1. La biblioteca di glycan utilizzata per stampa microchip è il risultato di uno sforzo a lungo termine sintetico della squadra Iannuzzi; esempi di sintesi sono descritti nelle pubblicazioni relative29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. La libreria glycan incluso antigeni dei gruppi sanguigni e alcuni tra i più frequentemente d'avvenimento oligosaccaridi terminali, così come motivi di nucleo di mammiferi N - e O-collegata di glicoproteine e glicolipidi, antigeni tumore-collegati del carboidrato, e polisaccaridi da batteri patogeni.</li>
		<li>Incubare i vetrini in casella di umidità (~ 70% di umidità relativa) a temperatura ambiente (25 ° C) per 1 h.</li>
		<li>Blocco di microarrays: Incubare i vetrini per 1,5 h con tampone bloccante a temperatura ambiente (acido borico 100mm, etanolammina 25 mM, 0,2% (v/v) di Tween-20 in acqua ultrapura).</li>
		<li>Lavare la glycochip con acqua ultrapura e asciugarlo in aereo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Controllo di qualità Glycochip
	<ol>
<li>Analizzare due microarrays da ogni batch utilizzando 1mg/mL soluzione di preparazione complessa dell'immunoglobulina (CIP, contenenti IgG, IgM e IgA), 10 µ g/mL di soluzione di immunoglobuline anti-umano di biotinylated capra come un anticorpo secondario (IgM + IgG e IgA), seguita da 1 µ g/mL soluzione del coniugato fluorescente streptavidina corrispondente (tramite il protocollo descritto di seguito, vedere il passaggio 2).</li>
		<li>Scansione e analizzare il glycochips (vedere il passaggio 3, analisi di glycan array).</li>
		<li>Utilizzo di microarray batch con correlazione superiore a 0,9 intra - e inter - chip.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tecnica Glycan Array
<ol><li>
Preparare le seguenti soluzioni acquose (in acqua ultrapura) e conservarle a temperatura ambiente (25 ° C):
	<ul>
<li>Tampone-1: 1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) in PBS, 1% (v/v) di Tween-20 e 0,01% (p/v) NaN3
</li>
		<li>Tampone-2: 1% (p/v) BSA in PBS, 0.1% Tween-20 (v/v) e 0,01% (p/v) di NaN3.</li>
		<li>Tampone-3: 0,1% (v/v) Tween-20 in PBS.</li>
		<li>Buffer-4: 0,001% (v/v) Tween-20 in PBS.</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Glycochip e preparazione di campioni
	<ol>
<li>Mettere il contenitore con le diapositive sul tavolo finché non raggiungono la temperatura ambiente (25 ° C). Nota: Utilizzare guanti in lattice senza polvere. Il glycochip deve essere manipolato da parte inferiore della lastra di vetro, dove si trova il codice a barre. Il codice a barre vi aiuterà a identificare il lato destro, evitando il contatto con la superficie dove i glicani sono stampati.</li>
		<li>Aprire la scatola, prendere la glycochip e posizionarlo nella camera di incubazione (25 ° C), già condizionata con filtro di carta bagnato per mantenere costante l'umidità all'interno della camera.</li>
		<li>Nel frattempo, diluire il siero di topi con Buffer-1 (01:20) in provette da 1,5 mL. Omogeneizzare la soluzione del siero (5 s) con un Vortex. Nota: Il volume necessario per coprire completamente una superficie singola glycochip è di circa 1 mL.</li>
		<li>Dopo l'omogeneizzazione, incubare il siero a 37 ° C per 10 min in un bagno d'acqua per evitare l'aggregazione dell'immunoglobulina. Centrifugare le provette per 3 min a 10.000 x g e a 25 ° C, raccogliere il surnatante e scartare qualsiasi materiale precipitato.</li>
		<li>Posizionare con attenzione il glycochip nella camera di incubazione. Incubare per 15 minuti a 25 ° C con 1 mL di tampone-3 per eliminare qualsiasi materiale residuo sulla superficie della glycochip.</li>
		<li>Tenere il glycochip in posizione verticale e rewash esso con qualche goccia di tampone-3 usando una pipetta di Pasteur plastica. Rimuovere con cautela il buffer dalla superficie glycochip utilizzando carta da filtro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reazione: gli anticorpi associazione
	<ol>
<li>Posto il glycochip nella camera di incubazione. Stendere il campione di siero diluito su glycochip la superficie utilizzando una micropipetta. Incubare con agitazione orbitale (30 giri) a 37 ° C per 1,5 h. Assicurarsi che tutti i secchi dell'area di glycochip è coperto dal campione di siero diluito usando la punta della pipetta.</li>
		<li>Rimuovere qualsiasi campione in eccesso e immergere il glycochip per 5 min in Buffer-3 a 25 ° C. Quindi, spostare il glycochip in un contenitore con Buffer-4 (5 min) e infine lavare (5 min) il glycochip con acqua ultrapura. Centrifugare il glycochip per 1 min a 175 x g e 25 ° C per rimuovere il liquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rilevazione: anticorpo secondario
	<ol>
<li>Posto il glycochip nella camera di incubazione. Si è diffusa su tutta la superficie di glycochip una soluzione (5 µ g/mL) di capra anti-topo (IgG + IgM) coniugato di biotina nel Buffer-2. Incubare con agitazione orbitale (30 giri) a 37 ° C per 1 h.</li>
		<li>La frazione non legata di rimuovere e ripetere i passaggi di lavaggio.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione, incubare la glycochip nel buio a 25 ° C per 45 min (30 giri) con 2 µ g/mL della soluzione di fluorocromo-labeled streptavidin corrispondente (in tampone-2).</li>
		<li>Nel buio, la frazione non legata di rimuovere e ripetere i passaggi di lavaggio.</li>
		<li>Asciugare il glycochip di aria. Nota: Glycochip deve essere analizzato più presto possibile. Ma se è Impossibile eseguire la scansione immediatamente dopo la colorazione, glycochips possono essere memorizzati in un luogo fresco e asciutto nelle tenebre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analisi di Glycan Array
<ol><li>
Scansione della matrice
	<ol>
<li>Lasciare la glycochip sul tavolo finché raggiunge la temperatura ambiente buio. Allo stesso tempo, accendere il scanner per diapositive e il laser (lunghezza d'onda di eccitazione di 633 nm).</li>
		<li>Tenendo il microarray, far scorrere il glycochip nello slot fino a toccare la parte posteriore.</li>
		<li>Acquisire il glycochip ("run easy scan") e salvare la scansione come un ". File TIFF".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificazione di matrice
	<ol>
<li>Quantificare la matrice utilizzando un sistema di analisi ScanArray. Apri immagini, precedentemente acquisite facendo clic su "File" nel "gruppo Configura & File" nella finestra principale (Figura 1B-D)</li>
		<li>Caricare il modello di file matrice corrispondente in formato GAL (disposizione dei glicani stampato su vetrino) (Figura 1).</li>
		<li>Regolare GAL modello allineando attentamente la matrice (griglie) con i punti sull'immagine e avviare quantificazione (Figura 1).</li>
		<li>Selezionare i parametri di quantificazione:<ul>
<li>Tipo di quantificazione: Quant di facile esecuzione.</li>
			<li>Metodo di quantificazione: cerchio fisso</li>
			<li>Trova automaticamente le macchie: deseleziona tutte le opzioni</li>
			<li>Metodo di normalizzazione: LOWESS (localmente ponderata Scatter Plot levigante).</li>
		</ul>
</li>
		<li>Salvare i dati quantificati come ". File CSV"(Figura 1). Trasferire i dati in un file di foglio di calcolo comuni utilizzando Microsoft Excel o un'altra applicazione appropriata.</li>
		<li>Utilizzare lo scarto interquartile (IQR) come il principale metodo di statistico: calcolo della mediana (Quartile 2) di tutti i segnali per ogni ligando e lo scarto interquartile (75 ° e 25 percentili o quartili superiori ed inferiori Q3 e Q1, rispettivamente).</li>
		<li>Eseguire l'esplorazione interattiva dei dati utilizzando un'applicazione Explorer Clustering gerarchico.</li>
		<li>Utilizzo di parametri di clustering: sollevatore medio (UPGMA) e la distanza euclidea come somiglianza distanza di misura. Eseguire il clustering gerarchico di righe senza normalizzazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Nailya Khasbiullinae Alexey Nokel sono dipendenti di Semiotik LLC, che è il fornitore di glycochips utilizzato in questo studio.

Glycan microarrays sono diventati strumenti indispensabili per lo studio di interazioni proteina-glycan40. Il presente lavoro descrive un protocollo basato su tecnologia di PGA per studiare il repertorio della circolazione di anticorpi anti-carboidrati nei topi BALB/c. Dal PGA offre la possibilità ad un gran numero di schermo di glicani biologicamente sconosciuto, è una scoperta eccezionalmente conveniente strumento13,15,<sup cl...

Gli anticorpi gioca un ruolo centrale nella nostra difesa contro agenti patogeni d'invasione neutralizzando direttamente virus1,2 e batteri2,3, attivando il complemento system4,5 e il potenziamento della fagocitosi6. Inoltre, essi sono elementi essenziali nel cancro di targeting e l'eliminazione delle cellule maligne7e omeostasi manutenzione8,9.
I disordini del sistema immunitario possono provocare1110 e cancro, malattie autoimmuni ed infiammatorie. Tutte queste condizioni patologiche richiedono idealmente una diagnosi rapida per un trattamento efficace. Nel caso di disordini autoimmuni, sierologica presenza di autoanticorpi nella maggior parte dei casi è un preannunciatore per sistema diagnostico di autoimmunità10,12. Questi anticorpi reagiscono con la superficie cellulare ed extracellulare autoantigeni e, sono spesso presenti per molti anni prima della presentazione di malattia autoimmune10,12. Cancro e deficit immunitari sono anche diagnosticati con esami del sangue che sia misurare il livello di sistema immunitario elementi quali gli anticorpi, o la loro attività funzionale11.
L'identificazione del repertorio di fare circolare gli anticorpi ed i loro livelli sierologici sono di primaria importanza per impostare una prognosi e valutare la progressione di tutte le citate condizioni patologiche. Precedentemente abbiamo dimostrato le potenzialità della tecnica di PGA per l'analisi degli anticorpi in diverse specie animali13–16, riducendo al minimo l'uso di grandi volumi di campioni sierologici, evitando il problema associato con gli anticorpi cross-reattività17 e profilatura di alto-rendimento consentendo di un vasto repertorio di anticorpi15.
Basato su glycan immunoassays principalmente sono condizionati, tra altri fattori, l'origine e la produzione di carboidrati, che determinano l'affinità e l'associazione di ligandi15,18,19,20 ,21. Basato su glycan test immunologici possono essere sviluppati in sospensione (microsfere)15,21,22 o in superfici piatto-attivato15,21,22, 23,24. L'ultimo includono ELISA (il più convenzionale di questi metodi) e PGA. Non c'è la quantità di dati confrontando queste metodologie la stessa impostazione sperimentale15,25,26,27. In precedenza abbiamo confrontato l'efficacia e la selettività di questi test immunodiagnostici per gli anticorpi anti-glycan profilo in campioni di plasma umano individuale15. Per alcuni anticorpi come quelli gruppo di sangue anti-A/B targeting, tutti i test immunologici potrebbero individuarli con significatività statistica e hanno correlato positivamente con la vicenda15,18,21. Nel frattempo, gli anticorpi anti-P1 principalmente sono stati rilevati da PGA con il più alto potere discriminante, e non c'era correlazione alle determinazioni fatta da diversi basati su glycan immunoassays15,18, 21. queste differenze tra metodi riguardavano principalmente l'antigene/anticorpo rapporto e glycan orientamento15. Le matrici di ELISA e sospensione sono più suscettibili di associazione aspecifici che PGA perché c'è un eccesso di antigene rispetto gli anticorpi in questi metodi15. Inoltre, l'orientamento dei glicani in PGA è più limitato rispetto a ELISA e sospensione matrici15. ELISA è comoda quando lo Studio include un pannello limitato di glicani. Insieme a matrici di sospensione, ELISA offre più ampia flessibilità per quanto riguarda la riconfigurazione di dosaggio. PGA è eccezionalmente conveniente per scoperta approcci15,18,21,28. Nonostante questi chiari vantaggi e svantaggi, i tre test immunologici accennati potrebbero essere utilizzati per studiare diversi aspetti delle interazioni glycan-anticorpo. L'obiettivo finale dello studio è che quello guiderà la selezione della metodologia più adatta.
Il presente lavoro si propone di estendere l'uso della tecnologia di PGA per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-glycan nei piccoli animali. Come un risultato rappresentativo, presentiamo qui un protocollo dettagliato per valutare il repertorio di anticorpi anti-carboidrati naturali in topi BALB/c adulti di PGA.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotinilato capra anti-umano Igs</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Ref. #: 31782</td><td></td></tr><tr><td>capra biotinilata anti-topo IgM + IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: 31807</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5&nbsp;</td><td>Scienion AG, Berlino, Germania</td><td>http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/</td><td></td></tr> <tr><td>Vassoio per coloranti (camera di incubazione per vetrini)</td><td>Simport, Beloeil, QC, Canada</td><td>Rif. #: M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania&nbsp;</td><td>Rif. #: 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>http://www.gilson.com/en/Pipette/</td><td></td></tr> <tr><td>Scanner per vetrini&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, Stati Uniti</td><td>ScanArray GX Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a scuotimento</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, Regno Unito</td><td>Rif. #: SI50</td><td></td></tr><tr><td>Biological samples</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c mice sera Questo</td><td>articolo</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Complex Immunoglobulin Preparation (CIP)</td><td>Immuno-Gem, Moscow, Russia</td><td>http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531</td><td></td></tr><tr><td><forte>Sostanze chimiche, reagenti e glicani&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca dei glicani</td><td>Istituto di chimica bioorganica (IBCh), Mosca, Russia</td><td>N/ A Albumina</td><td></td></tr><tr><td>sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,&nbsp;</td><td>Rif. #: A9418</td><td></td></tr><tr><td>Etanolammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Rif. #: 411000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spagna</td><td>Rif. #: 655204</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfacita (PBS)</td><td>VWR International Eurolab S.L, Barcellona, Spagna</td><td>Rif. #: E404</td><td></td></tr><tr><td>Azoturo di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Rif. #: S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina Alexa Fluor 555 coniugato&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Rif. #: S21381</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy5 coniugato</td><td>GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Regno Unito</td><td>Rif. #: PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-idrossisuccinimide-derivatizzato vetrini H&nbsp;</td><td>Schott-Nexterion, Jena, Germania</td><td>Rif. #: 1070936</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: WHA10347509</td><td></td></tr><tr><td>provette da 1,5 mL</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Rif. #: 0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Software e algoritmi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express Microarray Analysis System</td><td>PerkinElmer</td><td>http://www.per</td><td></td></tr><tr><td>kinelmer.com/microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hierarchical Clustering Explorer application</td><td>University of Maryland, MD, USA</td><td>http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/</td><td></td></tr></tbody></table>

stampato glycan array: una tecnica sensibile per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Il repertorio di anticorpi anti-carboidrati di un dato individuo è spesso associato a sua condizione immunologica. Non solo la condizione immune individuale determina il successo nella lotta contro segnali di minaccia potenziale interne ed esterne, ma anche l'esistenza di un particolare modello di fare circolare gli anticorpi anti-glycan (e la loro variazione di livello sierologica) potrebbe essere un indicatore significativo dell'insorgenza e la progressione di alcune condizioni patologiche. Qui, descriviamo una metodologia basata su stampato Glycan Array PGA che offre l'opportunità di misurare centinaia di obiettivi glycan con sensibilità molto alta; utilizzando una quantità minima di campione, che è un comune restrizione presente quando piccoli animali (ratti, topi, criceto, ecc.) sono utilizzati come modelli per affrontare gli aspetti delle malattie umane. Come un esempio rappresentativo di questo approccio, vi indichiamo i risultati ottenuti dall'analisi del repertorio di anticorpi naturali anti-glycan nei topi BALB/c. Dimostriamo che ogni topo BALB/c coinvolto nello studio, pur essendo geneticamente identico e tenuta sotto le stesse condizioni, si sviluppa un modello particolare di anticorpi anti-carboidrati naturali. Questo lavoro sostiene di espandere l'uso della tecnologia di PGA per studiare il repertorio (specificità) ed i livelli di anticorpi anti-carboidrati, sia nella salute che durante qualsiasi condizione patologica.

Qui, presentiamo una sintesi dei risultati rappresentativi ottenuti dalla quantificazione del repertorio di anticorpi naturali anti-glycan in una popolazione di 20 topi BALB/c. Il glycochips utilizzato in questo studio conteneva 419 glycan diverse strutture. Maggior parte dei glicani sono stati sintetizzati come -CH2CH2CH2NH2 distanziatore-armati O-glicosidi, in diversi casi come -CH2CH2NH2 o - NHCOCH<su...

Questo lavoro Mostra le potenzialità della tecnologia array (PGA) glycan stampato per l'analisi degli anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali.

Stampato Glycan Array: Una tecnica sensibile per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di studiare il profilo degli anticorpi anti-glicina circolanti nel siero di piccoli animali utilizzando una tecnologia basata su array di glicani stampati. Questo approccio ha un potenziale nella diagnosi precoce e nel giusto trattamento in alcune condizioni patologiche in cui gli anticorpi contro le strutture glicenali svolgono un ruolo importante. Il vantaggio principale con questa tecnica, è la possibilità di misurare nella stessa impostazione sperimentale centinaia di bersagli di glicina con una sensibilità molto elevata utilizzando una quantità minima di campione.Per preparare il micro array, utilizzare un arrayer robotico senza contatto. Stampa sei repliche di glicani millimolari e 10 microgrammi per polisaccaridi millilitro e PBS da 300 millimolare, pH 8,5 su diapositive di vetro derivatizzato n-idrossi 6 cinnamici. Ogni diapositiva contiene quattro diversi blocchi di sottoarray ripetuti sei volte.Ogni singolo sottomaschera è formato da 112 diverse macchie di glicani, inclusi i controlli. Incubare gli scivoli in una scatola di umidità a temperatura ambiente per un'ora. Per bloccare i micro array, incubare le diapositive per 1 ora e mezza con tampone di blocco a temperatura ambiente.Quindi lavare il chip glicole con acqua ultra pura e asciugarlo per via aerea. Preparare il buffer da uno a buffer quattro come descritto nel protocollo di testo. Per preparare i trucioli e i campioni di glicole, mettere la scatola di stoccaggio con le diapositive sul tavolo fino a raggiungere la temperatura ambiente.Aprire la scatola e trasferire il chip glicole nella camera di incubazione che dovrebbe essere già condizionata con carta filtrante bagnata per mantenere costante l'umidità all'interno della camera. Nel frattempo, diluire il siero dei topi con tampone uno in 1,5 tubi millilitri. Omogeneizzare la soluzione siere per cinque secondi con un miscelatore a vortice.Dopo l'omogeneizzazione, incubare il siero diluito a 37 gradi Celsius per 10 minuti in un bagno d'acqua per evitare l'aggregazione di immunoglobuline. Quindi centrifugare i tubi per tre minuti a 10.000 volte G e 25 gradi Celsius. Raccogliere il supernatante e scartare qualsiasi materiale precipitato.Posizionare accuratamente il chip glicole nella camera di incubazione. Incubarlo con un millilitro di tampone tre per eliminare qualsiasi materiale residuo sulla superficie del chip glicole. Per 15 minuti, a 25 gradi Celsius.Tenere il chip glicole in posizione verticale e lavarlo di nuovo con alcune gocce di tampone tre utilizzando una pipetta pasteur di plastica. Quindi, rimuovere con cura il tampone dalla superficie del chip glicole utilizzando carta da filtro. Riposizionare il chip glicole nella camera di incubazione.Stendere il campione di siero diluito sulla superficie del chip glicole utilizzando una micro pipetta. Assicurarsi che tutte le aree secche della superficie del chip glicole siano coperte dal campione di siero diluito utilizzando la punta della pipetta. Incubare con agitazione orbitale a 37 gradi Celsius per 1 ora e mezza.Dopo l'incubazione, rimuovere qualsiasi campione in eccesso e immergere il chip glicole per cinque minuti nel tampone tre a 25 gradi Celsius. Passare il chip glicole a un contenitore con tampone quattro e, infine, lavare il chip glicole con acqua ultra pura. Centrifugare il chip glicole per un minuto a 175 volte G e 25 gradi Celsius per rimuovere il liquido.Dopo aver riposizionare il chip glicole nella camera di incubazione, stendere una soluzione di capra anti-topo coniugata alla biotina sulla superficie del chip glicole. Incubare con agitazione orbitale a 37 gradi Celsius per un'ora. Rimuovere la frazione non vincolata e ripetere i passaggi di lavaggio.Dopo la centrifugazione, incubare il chip glicole nell'oscurità a 25 gradi Celsius per 45 minuti con due microgrammi per millilitro della corrispondente soluzione di streptavidina etichettata al fluorocromo nel tampone due. Dopo aver lavorato nell'oscurità per rimuovere la frazione non vincolata e ripetere i passaggi di lavaggio, asciugare il chip glicole per via aerea. Per scansionare l'array, lasciare il chip glicole sul tavolo fino a raggiungere la temperatura ambiente al buio.Allo stesso tempo, accendere lo scanner di diapositive e il laser. Tenendo il micro array, far scorrere il chip glicole nello slot fino a toccarlo. Eseguire la scansione del chip glicole eseguendo EasyScan e salvare la scansione come file tif.Quantificare la matrice utilizzando un sistema di analisi ScanArray. Aprire le immagini digitalizzate in precedenza facendo clic sul file nel gruppo configura e file nella finestra principale. Caricare il modello di file di matrice corrispondente in formato ELENCO che rappresenta la disposizione dei glicani stampati nella diapositiva di vetro.Regolare il modello elenco indirizzi globale allineando accuratamente l'array ai punti dell'immagine e avviando la quantificazione. Selezionare i perimetri di quantificazione in quanto il tipo di quantificazione esegue un facile cerchio fisso del metodo di quantificazione e quantificazione. Deselezionare tutte le opzioni per individuare automaticamente i punti e selezionare lowess per il metodo di normalizzazione.Salvare i dati quantificati come file CSV. Trasferire questi dati in un file di foglio di calcolo comune utilizzando Microsoft Excel o un'altra applicazione appropriata. I topi geneticamente identici non dovrebbero essere considerati equivalenti immunologici perché hanno sviluppato diversi modelli di anticorpi anti carboidrati naturali.Come mostrato qui, solo 12 specificità glicane sono state conservate. Mostrato qui, è un esempio rappresentativo delle immagini ottenute dalla scansione di micro chip utilizzando uno scanner florescent. La griglia viene quindi allineata alle macchie in ogni singola sottomaschera.I florescent vengono rilevati per ogni punto e i risultati vengono trasferiti in un file di foglio di calcolo comune. Dopo l'incubazione con siero di topo, i trucioli di glico sono stati scansionati utilizzando un lettore di array di scansione. I dati sono stati analizzati con un sistema di analisi di micro array e i risultati sono stati espressi in RFU come mediana più di meno la deviazione assoluta mediana.I colori blu e bianco rappresentano segnali di legame di sfondo inferiori a 4000 RFU. Il colore rosso rappresenta segnali di legame positivi maggiori o uguali a 4000 RFU. La maggior parte delle strutture glicenali esposte nei trucioli di glicole non sono state riconosciute dal repertorio degli anticorpi anti glicici circolanti dei topi balp C.Una volta padroneggiata questa tecnica può essere eseguita in cinque ore e 45 minuti se viene eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la tecnologia printer glycon array per indagare il repertorio e i livelli di anticorpi anti carboidrati circolanti nei campioni di siero. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il chip glico deve essere manipolato da una parte inferiore della luce degli occhiali.Dove si trova il codice a barre. In modo da evitare il contatto con i glicani stampati. Inoltre, assicurarsi che tutta l'area secca del chip glico sia coperta dal campione di siero diluito utilizzando la punta della pipetta.Il volume necessario per coprire totalmente una singola superficie di un chip glico è di circa un millilitro. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'array di sospensioni di base della microsfera possono essere fatti al fine di rispondere ad altre domande relative al rilevamento multiplex flessibile del profilo degli anticorpi antiglici. Dopo la sua introduzione questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo delle molecole biomacrali e dell'immunologia per esplorare un'interazione di glicole non proteico nell'insieme dei piccoli animali.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo studio, si descrive un protocollo migliorato per un multiplato ad alta resa microarray anticorpo con metodo di rilevazione lectina che può essere utilizzato in profili glicosilazione di proteine ​​specifiche. Questo protocollo offre nuovi reagenti affidabili e riduce sensibilmente i tempi, i costi e alle attrezzature di laboratorio rispetto alla procedura precedente.

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

Questo video mostra la tecnologia di array di glicani stampati per analizzare gli anticorpi anti-glicani circolanti nel siero di topo. Gli anticorpi nel siero interagiscono con glicani specifici sul chip, il che è confermato dall'immunocolorazione seguita dalla scansione a fluorescenza.

Rilevamento degli anticorpi anti-glicani circolanti con un array di glicani stampato

Utilizzando una strategia di microarray di glicani stampati, è stato miniaturizzato un test convenzionale su piastra a 96 pozzetti per l'analisi dell'avidità e della specificità dell'emoagglutinina del virus dell'influenza A per i recettori contenenti acido sialico.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Descriviamo qui un metodo per generare microarray di antigeni personalizzabili che possono essere utilizzati per la rilevazione simultanea di autoanticorpi sierici IgG e IgM da esseri umani e topi. Questi array consentono il rilevamento quantitativo e ad alto rendimento di anticorpi contro qualsiasi antigene o epitopo di interesse.

Generazione di due colori Antigen microarray per la rilevazione simultanea di autoanticorpi IgG e IgM

Un approccio modulare alla sintesi di N- glicani per il collegamento ad un vetro rivestita di ossido di alluminio diapositiva (ACG) come è stato sviluppato un microarray glycan e suo utilizzo per la profilazione di un HIV anticorpo di neutralizzazione ampiamente è stata dimostrata.

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Un saggio di microarray sialoglycan può essere utilizzato per valutare gli anticorpi anti-Neu5Gc nei sera umani, rendendolo un potenziale analisi diagnostica ad alto rendimento per il cancro e altre malattie umane mediate dall'infiammazione cronica.

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È stato descritto un protocollo dettagliato per la purificazione e la successiva analisi di un anticorpo monoclonale proveniente da fluido di coltura cellulare raccolto (HCCF) di microbiorici automatizzati. Viene inoltre presentato l'uso di analisi per determinare gli attributi di qualità critica (CQA) e massimizzare il volume di campione limitato per estrarre informazioni vitali.

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Il modello di glicosilazione di un anticorpo determina le sue prestazioni cliniche, quindi gli sforzi industriali e accademici per controllare la glicosilazione persistono. Poiché le tipiche campagne di glicoingegneria richiedono molto tempo e lavoro, la generazione di un protocollo rapido per caratterizzare l'impatto dei geni di glicosilazione utilizzando il silenziamento transitorio si rivelerebbe utile.

Glicoingegneria anticorpale rapida nelle cellule ovariche di criceto cinese

La profilazione polimerica microarray (MAPP) è una tecnica ad alto rendimento per l'analisi della composizione dei glicani in campioni biologici.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) per l'analisi dei glicani ad alto rendimento

Un metodo semplice macchia di slot è stato sviluppato per la quantificazione del emoagglutinina e neuraminidasi dell'influenza virale utilizzando anticorpi universali indirizzare le proprie sequenze più conservate identificate attraverso l'analisi bioinformatica. Questo approccio innovativo può fornire una valida alternativa alla determinazione quantitativa di tutti i emoagglutinina e neuraminidasi virale.

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Impara l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nel siero di piccoli animali mediante tecnologia di microarray di glicani stampati. Questo metodo consente di misurare centinaia di bersagli glicanici con elevata sensibilità utilizzando volumi minimi di campione.

Stampato Glycan Array: Una tecnica sensibile per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali

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