Modellazione di Osteosarcoma con la sindrome di Li-Fraumeni paziente-derivato indotto Pluripotent Stem Cells

Questo modello di osteosarcoma basato su iPSC della sindrome di Li-Fraumeni può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sull'osteosarcoma sull'utilizzo delle cellule iP dei pazienti nella modellazione del cancro. Il vantaggio principale di questo modello è che consente la generazione di cellule illimitate in tutte le fasi dello sviluppo dell'osteosarcoma per studi meccanicistici, identificazione di biomarcatori e screening farmacologico. Ruoji dimostrerà la procedura di coltura cellulare e io dimostrerò la procedura animale.

Dopo due settimane di fibroblasti embrionali di topo, o MEF, la co-coltura lava la coltura cellulare iPS confluente all'80-90% con cinque millilitri di DPBS seguita dall'aggiunta di un millilitro di soluzione di distacco cellulare alle cellule per un'incubazione di tre minuti a temperatura ambiente. È fondamentale mantenere le cellule iPS in buone condizioni sui MEF per almeno 14 giorni affinché le cellule siano in grado di attaccarsi a una piastra rivestita di gelatina per la loro differenziazione in cellule staminali mesenchimali. Quando le cellule si sono staccate dal fondo della piastra, aggiungere nove millilitri di terreno di coltura MEF/MSC alle cellule per neutralizzare la soluzione di distacco cellulare e trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri non rivestita.

Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire ai MEF di attaccarsi alla piastra e raccogliere con cura il surnatante contenente cellule iPS non attaccate. Centrifugare la soluzione di cella iPS e risospendere il pellet in sei millilitri di terreno di differenziazione MSE. Quindi seminare due millilitri di cellule in ciascuno dei tre pozzetti rivestiti di gelatina allo 0,1% di una piastra di coltura a sei pozzetti e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 28 giorni, alimentando le cellule con terreno fresco ogni due giorni per rimuovere eventuali cellule non attaccate o morte.

Il giorno 28 saranno visibili grandi masse di cellule differenziate con MSC simili a fibroblasti osservate ai bordi dei cluster. Lavare le colture cellulari con un millilitro di DPBS per pozzetto seguito dal loro distacco con 0,5 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25% per pozzetto a temperatura ambiente. Dopo tre minuti, neutralizzare la tiripsina con 1,5 millilitri di terreno di coltura MEF/MSE per pozzetto e raggruppare le MSE staccate in un'unica provetta conica da 15 millilitri per la loro centrifugazione.

Risospendere il pellet in tre millilitri di terreno di coltura MEF/MSE e seminare le cellule su una piastra da 60 millimetri rivestita di gelatina allo 0,1%, cambiando il terreno ogni due giorni fino a quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza. Dopo aver diviso la coltura confluente al 100% in un rapporto da uno a tre, le MSC prolifereranno rapidamente, dimostrando una morfologia simile ai fibroblasti e formando un modello di coltura a vortice quando la coltura raggiunge un'alta densità. Le MSC derivate da cellule iPS possono anche essere esaminate mediante una colorazione immunofluorescente per i marcatori delle cellule staminali mesenchimali in qualsiasi momento durante la loro differenziazione.

Per differenziare l'MSE in osteoblasti, l'indice di MSE è stato utilizzato per 24 ore, il numero appropriato di MSE da una coltura cellulare confluente al 95% su una piastra di coltura cellulare nel volume appropriato di terreno di coltura MEF/MSC. Quindi iniziare a sostituire il surnatante con il volume appropriato di terreno di differenziazione degli osteoblasti il giorno successivo e ogni due giorni successivi fino alla fine del periodo di coltura. Per rilevare la fosfatasi alcalina associata all'osso prodotta dai preosteoblasti e la deposizione minerale prodotta dagli osteoblasti maturi, eseguire rispettivamente la fosfatasi alcalina e la colorazione con Alizarin Red S, secondo il protocollo del produttore nei punti temporali sperimentali appropriati.

Per impostare un modello di tumorigenesi in vivo con gli osteoblasti differenziati, seminare il numero appropriato di MSC in cinque piastre da 100 millimetri per avviare la differenziazione osteoblastica. Il giorno 14 di differenziazione osteoblastica lavare cinque piastre di coltura di osteoblasti con cinque millilitri di DPBS e trattare le cellule con 1,5 millilitri di soluzione di distacco degli osteoblasti per piatto. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi centigradi, confermare il distacco delle cellule mediante microscopia ottica e neutralizzare la soluzione di distacco con un terreno di differenziazione degli osteoblasti fresco.

Raggruppare le cellule in una provetta conica da 50 millilitri per la loro centrifugazione e risospendere il pellet in 25 millilitri di terreno di differenziazione degli osteoblasti freschi. Filtrare la soluzione cellulare attraverso un colino da 70 micron per rimuovere eventuali cellule aggregate prima del conteggio e mettere da parte da 1 X 10 a 7 cellule per iniezione sottocutanea. Pellettare le cellule mediante centrifugazione e ricostituire le cellule a una velocità di 1 X 10 per 7 osteoblasti per 50 microlitri di concentrazione di DPBS ghiacciata.

Mescolare gli osteoblasti con un volume uguale di matrice di membrana basale priva di rosso fenolo e porre le cellule su ghiaccio fino alla loro iniezione. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi in una femmina di topo nudo immunocompromesso di otto settimane, caricare le cellule in una siringa da un millilitro dotata di ago calibro 27 e iniettare per via sottocutanea 100 microlitri di cellule nel fianco disinfettato dell'animale. Quindi monitorare i topi con palpitazioni settimanali nel sito di iniezione per la crescita delle densità nodulari sottocutanee.

La formazione del tumore deve essere osservata tra le sei e le 10 settimane dopo l'iniezione. I cloni di cellule LFS iPS devono presentare una morfologia tipica delle cellule staminali embrionali umane e dimostrare un'attività positiva della fosfatasi alcalina. Le cellule LFS iPS esprimono anche mRNA del fattore di pluripotenza paragonabili alle linee cellulari staminali embrionali umane e molto più alti dei livelli osservati nei fibroblasti parentali.

Le MSC LFS differenziate con successo esprimono anche marcatori MSC tipici, tra cui CD44, CD73, CD105 e CD166, valutati mediante colorazione con immunofluoresent. Quando le MSC sono sottoposte a segnali di differenziazione osteogenica, le cellule differenziate iniziano a mostrare un'attività positiva della fosfatasi alcalina entro il nono giorno e la deposizione di minerali entro il 21° giorno. Gli osteoblasti differenzianti dimostrano anche un'espressione sovraregolata dei geni pre-osteoblastici e degli osteoblasti maturi durante il loro processo di differenziazione.

Da sei a 10 settimane dopo l'iniezione di osteoblasti, i tumori derivati da osteoblasti LFS dimostrano caratteristiche immature degli osteoblasti, tra cui attività positiva della fosfatasi alcalina, deposizione positiva della matrice di collagene e mineralizzazione negativa. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come differenziare le cellule iPS della sindrome di Li-Fraumeni in osteoblasti e generare un modello di osteosarcoma in vivo utilizzando osteoblasti derivati da pazienti. Oltre all'osteosarcoma, questo modello di malattia basato sulle cellule iPS della sindrome di Li-Fraumeni può essere applicato anche ad altri tumori maligni correlati alla sindrome di Li-Fraumeni come il sarcoma dei tessuti molli, il cancro al seno e i tumori cerebrali.