Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

L'obiettivo generale di questo saggio in vitro della chinasi è quello di identificare i siti di fosforilazione in una proteina di interesse che sono specifici per la chinasi ciclina-dipendente chinasi 1. L'identificazione di siti di fosforilazione specifici per CDK1 è importante in quanto forniscono informazioni meccanicistiche su come CDK1 controlla il ciclo cellulare. La regolazione del ciclo cellulare è fondamentale per la segregazione cromosomica completa di fase e i difetti portano ad aberrazioni cromosomiche e cancro.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che si basa su proteine purificate, quindi può essere applicata a qualsiasi organismo modello e produce risultati affidabili, soprattutto se combinata con studi funzionali nelle cellule. Questo metodo è importante in quanto il numero noto di bersagli CDK1 è ancora basso, nonostante il fatto che CDK1 fosforila circa l'8-13% del proteo. Sebbene questo metodo identifichi siti di fosforilazione specifici per CDK1, può essere modificato per identificare i siti di fosforilazione per altre chinasi, a condizione che la chinasi purificata sia disponibile.

Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le condizioni per il saggio della chinasi devono essere ottimizzate per ogni bersaglio proteico per ottenere un'elevata efficienza di fosforilazione. Preferibilmente al 100%Utilizzare il software IGPS 3.0 e visitare il server web per prevedere i siti di fosforilazione specifici di CDK1 nella sequenza della proteina bersaglio CENP-F. Controllare i siti di fosforilazione rispetto alla sequenza consenso CDK1.

Iniziare l'espressione proteica preparando una pre-coltura. Seguendo le istruzioni del produttore, trasformare un microlitro del plasmide di espressione in 50 microlitri di cellule competenti di E.coli. Dopo aver aggiunto il plasmide, incubare le cellule sul ghiaccio per 30 minuti.

Quindi incubare le cellule per 45 secondi a 42 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, mettere le cellule in ghiaccio per un minuto, quindi aggiungere 400 microlitri di LB alle cellule, quindi incubare la coltura per un'ora a 37 gradi Celsius agitando. Quindi piastra 200 microlitri di coltura su piastre di agar LB, integrate con gli antibiotici di interesse, a seconda del costrutto.

Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 12-20 ore senza agitare. Quindi prelevare una colonia dalla piastra di agar LB e inoculare la colonia in 50 millilitri di terreno LB integrato con la combinazione di antibiotici desiderata. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius agitando a 160-180 giri al minuto per 12-20 ore.

Per ogni litro di LB di terreno aggiungere gli antibiotici e 10 millilitri di soluzione sterile di glucosio filtrato al 40% in peso. A questo mezzo aggiungere 20 millilitri di precoltura densamente cresciuta. Quindi incubare la coltura a 37 gradi Celsius agitando a 160-180 giri al minuto.

Controllare l'assorbanza della coltura a 600 nanometri a intervalli regolari. Una volta che l'assorbanza raggiunge da 0,5 a 0,6, indurre l'espressione proteica aggiungendo 0,2 millimolari di IPTG. Quindi incubare la coltura a 37 gradi Celsius per tre ore agitando.

Dopo tre ore, raccogliere le celle mediante centrifugazione a 4, 100 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, utilizzando un rotore oscillante. Dopo la centrifugazione, espellere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 20 millilitri di tampone legante GST per CENP-F e i suoi sei tamponi leganti per la carioferina alfa per ogni litro di coltura.

Quindi conservare le celle a meno 80 gradi Celsius. Per purificare CENP-F, prima scongelare le cellule con il costrutto CENP-F. Quindi regolare il volume a 20 millilitri con un tampone di legatura GST.

Una volta regolato il volume, aggiungere uno dopo l'altro tutti i riducenti e gli inibitori della proteasi per preparare la sospensione cellulare alla successiva lisi. Quindi trasferire la sospensione cellulare in un becher di vetro e immergere il becher in un bagno di acqua ghiacciata. Quindi sonicare la cultura.

Dopo la sonicazione, aggiungere 250 micromolari di PMSF al lisato, quindi ispezionare il lisato, che in questa fase dovrebbe essere trasparente. Quindi centrifugare il lisato a 12.000-40.000 volte G per 25 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, preparare la colonna aggiungendo due millilitri di glutatione agarosio uno a uno di liquame a una colonna cromatografica monouso.

Per equilibrare la colonna, lavarla prima con 25 millilitri di acqua ultra pura e poi con 25 millilitri di tampone legante GST. Una volta terminata la centrifugazione, decantare il surnatante e filtrare il surnatante attraverso una colata di 0,2 micrometri. Successivamente versare il lisato sulla colonna tappata per la fase di legatura.

Tappare la colonna e incubarla a quattro gradi Celsius per 30 minuti mentre si nutisce delicatamente ed evitare la formazione di schiuma. Dopo 30 minuti trasferire la colonna su una gratella e lasciare depositare la resina. Quindi raccogliere il flusso e lavare la colonna due volte con 25 millilitri di tampone legante GST.

Una volta terminato il lavaggio, tappare nuovamente la colonna. Quindi aggiungere alla colonna 400 microlitri di tampone legante GST e 250 microlitri di stock di proteasi PS con attività di 1000 unità per milligrammo. Di nuovo tappare la colonna e farla roteare delicatamente per risospendere la resina nel tampone, quindi incubare la colonna a quattro gradi Celsius per 16-20 ore.

Al termine del periodo di incubazione, aggiungere quattro millilitri di tampone legante GST per eluire il frammento CENP-F dalla colonna che è stata scissa proteoliticamente. Successivamente, eluire nuovamente il tag GST, collegare la colonna. Quindi aggiungere quattro millilitri di tampone di eluizione GST contenente glutatione alla colonna.

Quindi, incubare la colonna per 10 minuti per eluire il tag GST legato. Dopo 10 minuti raccogliere l'eluato. Quindi eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS per analizzare le frazioni di proteasi PS e di eluizione del glutatione.

Successivamente, per concentrare il campione proteico, pipettare l'eluato di proteasi PS nel compartimento superiore di un'unità filtrante centrifuga con un cutoff di peso molecolare di tre kilodalton. Quindi centrifugare l'eluato a 4, 100 volte G con incrementi di 10-15 minuti a quattro gradi Celsius in un rotore oscillante, per concentrare il campione. Dopo ogni incremento, miscelare il campione di proteine nel filtro di concentrazione pipettando delicatamente verso l'alto e verso il basso per evitare la formazione di un gradiente di concentrazione.

Per purificare CENP-F mediante filtrazione su gel, collegare una colonna di filtrazione su gel a un sistema di cromatografia liquida proteica veloce. Quindi equilibrare la colonna con un volume di colonna di tampone di filtrazione su gel. Quindi centrifugare il frammento CENP-F in una provetta da microcentrifuga a 21, 700 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Al termine della centrifugazione, iniettare il campione sulla colonna, quindi eluire la colonna con un tampone di filtrazione su gel e raccogliere frazioni di 0,6 millilitri del frammento CENP-F. Successivamente, analizza il profilo di filtrazione su gel ed esegui una SDS-PAGE delle frazioni di picco. Frazioni di pool che contengono CENP-F puro.

Quindi concentrare il frammento di CENP-F purificato a 3,3 milligrammi per millilitro. Per determinare la concentrazione proteica, diluire il frammento CENP-F in un rapporto da uno a 100 con acqua ultra pura. Successivamente, registra lo spettro da 220 a 300 nanometri di lunghezza d'onda nello spettrofotometro.

Preparare quindi aliquote di 50 microlitri di CENP-F purificato in microprovette da 0,5 millilitri, quindi congelare le provette in azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Per il saggio della chinasi, mescolare il frammento CENP-F con ATP e CDK1 ciclina B insieme ad altri tamponi in una microprovetta da 0,5 millilitri. Quindi preparare un secondo campione senza CDK1 ciclina B come controllo negativo.

Quindi incubare i campioni in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius per una o 16 ore. Per l'identificazione corretta dei siti di fosforilazione mediante spettrometria di massa, è fondamentale che l'efficienza di fosforilazione sia la più alta possibile, preferibilmente del 100%Per aumentare l'efficienza di fosforilazione, aggiungere più chinasi e aumentare il tempo di incubazione a 16 ore. Quindi aggiungere volumi uguali di soluzione di guanidina cloridrato a sei molari alla restante reazione del saggio chinasico e al controllo negativo ed eseguire la spettrometria di massa per identificare il sito di fosforilazione.

Per ottenere dati di spettrometria di massa di alta qualità, è anche importante che il campione di proteine purificate sia altamente puro e omogeneo. Viene eseguita la prima analisi SDS-PAGE che mostra un chiaro spostamento verso l'alto della banda sul gel per il CENP-F fosforilato rispetto al controllo negativo senza CDK1, indicando che il cNLS di CENP-F è un substrato di CDK1. Successivamente viene eseguita la spettrometria di massa per analizzare il numero e l'efficienza dei siti di fosforilazione CENP-F.

Lo spettro di massa della trappola ionica ESI del CENP-F fosforilato intatto in vitro mostra che ci sono cinque picchi, che indicano quattro siti di fosforilazione e il quinto picco è la proteina non fosforilata. Successivamente, questo profilo di eluizione per esclusione dimensionale mostra che il volume di eluizione del picco alfa della carioferina si sposta verso una massa più elevata con l'aggiunta del CENP-F wild type, che non si osserva con l'aggiunta del mutante CENP-F. Ciò indica che la versione fosfomimetica S3048D di CENP-F indebolisce l'interazione del CENP-F cNLS con la carioferina alfa.

Infine, l'analisi SDS-PAGE mostra che il frammento CENP-F wild type con cNLS intatto eluisce con la carioperina alfa, indicando una forte interazione. Tuttavia, il mutante S3048D di CENP-F e la carioferina alfa eluiscono in picchi separati. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di controllare i siti di fosforilazione ottenuti rispetto alla sequenza di fosforilazione consenso CDK1 e di verificare che il substrato identificato si localizzi nello stesso compartimento cellulare di CDK1.

Seguendo questa procedura, la verifica funzionale deve essere eseguita nelle cellule o nei modelli animali al fine di confermare che i siti di fosforilazione identificati abbiano una funzione fisiologica. Sono disponibili numerosi strumenti per la verifica funzionale, come inibitori specifici di CDK1 e mutazioni fosfomimetiche. A causa dell'elevato numero di substrati di CDK1 nel proteo, molti substrati umani di CDK1 devono ancora essere scoperti e il saggio della chinasi in vitro sarà uno strumento importante per identificare, mappare e verificare questi siti.

L'identificazione di questi siti di fosforilazione consente studi meccanicistici su come CDK1 controlla il ciclo cellulare. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come identificare i siti di fosforilazione specifici di CDK1 e le proteine bersaglio mediante un saggio di chinasi in vitro.