Name: Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Scopri come identificare siti di fosforilazione specifici per Cdk1 con un saggio di chinasi in vitro utilizzando proteine purificate. Questo metodo fornisce informazioni meccanistiche sul controllo del ciclo cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo il Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California a Berkeley per analisi di spettrometria di massa e utili commenti. Si ringrazia il Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, istituti per le scienze biologiche, Accademia delle scienze cinese, Shanghai, Cina per la fornitura di un costrutto di CENP-F full-length. Infine, ringraziamo Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan e Dr. Christof Grewer at Binghamton University per l'accesso alle apparecchiature. Questa ricerca è stata finanziata dalla Fondazione di ricerca per la State University di New York e il dipartimento di chimica, State University of New York at Binghamton.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La nostra analisi in vitro della chinasi sono un metodo molto potente per identificare bersagli molecolari per la chinasi Cdk1, che è un regolatore matrice del ciclo cellulare e regola molti processi cellulari importanti. Il metodo determina se una proteina purificata è un substrato per Cdk1 e permette l'identificazione di siti di fosforilazione specifici. Questo facilita gli studi meccanicistici per regolazione di processi cellulari da fosforilazione attraverso Cdk1.
Il fattore più c...

Le chinasi sono enzimi che regolano molti processi cellulari e trasferiscono gruppi fosfato da ATP su substrati. Questa fosforilazione è reversibile, veloce, aggiunge due cariche negative e memorizza l'energia libera ed è uno delle modificazioni post-traduzionali più comune usate dalle cellule. CDK1, che è anche conosciuto come omologo di proteina 2 ciclo di divisione cellulare (cdc2) è un master controller per il ciclo cellulare in tutti gli eucarioti1,2,3,4,5e fosforila un orario 8-13% del proteoma6,7.
Mentre gli studi di proteomica recenti hanno identificato molti siti di fosforilazione di proteine, nella maggior parte dei casi, la chinasi responsabile di queste modificazioni è sconosciuta. Il numero di bersagli Cdk1 noti, in particolare nelle cellule umane è basso7. L'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici è importante, in quanto consente studi meccanicistici che stabiliscono come Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Regolazione del ciclo cellulare è importante per la segregazione del cromosoma fedele e la divisione cellulare, e una miriade di processi cellulari devono verificarsi per supportare questa importante funzione fisiologica. Questo include arrestare trascrizione e traduzione prima dell'inizio della mitosi, come pure una riorganizzazione drammatica nella struttura cellulare e organizzazione, ad esempio lo smontaggio dell'involucro nucleare, condensazione cromosomica, Assemblea del fuso mitotico e. Deregolamentazione e gli errori in questi processi causano cancro, difetti di nascita o morte cellulare mitotica. Inibitori specifici di Cdk1 come RO-3306 sono stati sviluppati8, che forniscono potenti strumenti per studi funzionali, e alcuni di questi inibitori sono attualmente nei test clinici per il trattamento del cancro (Vedi9 per la revisione).
Qui, descriviamo una in vitro analisi della chinasi che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici. In questo test, disponibili in commercio umano Cdk1/ciclina B è utilizzato per fosforilare un obiettivo purificato della proteina in vitro. Fosforilazione di un substrato aumenta la sua massa e aggiunge due cariche negative; di conseguenza, fosforilazione successo è confermata da uno spostamento verso l'alto della band gel di proteina su SDS-PAGE. Siti di fosforilazione CDK1 specifici sono successivamente identificati dall'analisi di spettrometria di massa della proteina in vitro fosforilato. Per aiutare con disegno sperimentale, esaminiamo anche strumenti computazionali e riferimenti per la previsione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici dalla sequenza della proteina. Inoltre, descriviamo anche protocolli di purificazione che producono preparati proteici altamente puro e omogeneo adatti per l'analisi della chinasi. Infine, i siti di fosforilazione identificata devono essere verificati da studi funzionali e un'analisi di associazione semplice è descritto qui per tale scopo. Combinato, questo è un approccio molto potente che produce siti di fosforilazione Cdk1 specifici e consente studi meccanicistici in modo Cdk1 controlla il ciclo cellulare7,10,11. Poiché questo metodo si basa su proteine purificate, può essere applicato a qualsiasi risultati affidabili di modello, organismo e rendimenti. Tuttavia, è consigliabile verifica funzionale dei siti fosforilazione ottenuti in vitro , come le cellule hanno ulteriori meccanismi di regolamentazione in vigore, come modifiche di posttranslational, partner di interazione o localizzazione cellulare che può rendere siti di fosforilazione accessibile o inaccessibile per il riconoscimento di Cdk1.
CDK1 riconosce un sito di fosforilazione di consenso che si compone di (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), dove X è ogni residuo e una serina o treonina è il sito di fosforilazione. Particolarmente importante per il riconoscimento è la presenza della prolina in posizione + 1. Inoltre, i residui di base sono preferiti nelle posizioni + 2 o + 3, con la maggior parte dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici contenenti un Lys o Arg presso il + 3 posizione6,12.
Attivazione di Cdk1 è strettamente regolato e conduce all'inizio della mitosi1,2,3,4,5. L'attività di chinasi ciclina-dipendenti in generale dipende dalla loro associazione con distinte cicline (ciclina A, B, C, D ed E in esseri umani), che si sono espressi a livelli durante il ciclo cellulare13di oscillazione. L'espressione CDK1 è costante attraverso il ciclo cellulare e la regolazione della sua attività si basa sulla sua associazione con la subunità regolatorie cicline A e ciclina B5,13,14,15, come Beh come modificazioni post-traduzionali. Formazione del complesso Cdk1/ciclina B è necessaria per le chinasi attivazione5,14,15,16,17,18. Nella fase G2, ciclina B è tradotto nel citosol e importato nel nucleo dove si lega a Cdk15,14,15,16,17,18; Tuttavia, Cdk1/ciclina B è detenuto inattivato da fosforilazione in residui Thr14 e Tyr15 dalla chinasi Cdk1-inibitorio umani Myt1 (chinasi cdc2-inibitorio di membrana-collegato della tirosina e treonina-specifiche) e Wee1, rispettivamente19, 20,21. La fine della fase G2, defosforilazione di Thr14 e Tyr15 dalla divisione cellulare ciclo 25 fosfatasi (cdc25) attiva l'attività della chinasi del complesso Cdk1/cyclin B e innesca l'inizio della mitosi12,14, 18 , 20 , 22 , 23. fosforilazione di Thr161 è anche necessaria per l'attivazione di chinasi ciclina Cdk1/B ed è mediato da Cdk7, l'attivazione di Cdk chinasi (CAK)18. Degradazione del cyclin B in anafase inattiva Cdk1, permettendo l'uscita dalla mitosi24,25. L'attivazione della chinasi Cdk1/ciclina B è pertanto un processo complicato. Il protocollo presentato qui viene eseguito con commercialmente disponibili Cdk1/ciclina B. Durante espressione ricombinante di questo complesso in cellule di insetto, essa è attivata in vivo di chinasi endogene14,20 e resta attiva nello stato purificato. La risultante attiva, ricombinante umano Cdk1/ciclina B è adatto per le analisi in vitro della chinasi.
Qui, descriviamo un protocollo per l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici nel centromero umano proteina F (CENP-F)10. CENP-F è una proteina di cinetocore che risiede nel nucleo durante la maggior parte di interfase (G1 e fase S) e viene esportata nel citosol in G2 fase26,27,28 in un dipendente Cdk1 modo10, 11. localizzazione nucleare è conferita da un bipartito cNLS26. cNLSs sono riconosciuti dal trasporto nucleare di fattore α karyopherin, che facilita, insieme a β di karyopherin e RanGDP, l'importazione del cNLS-carico nel nucleo29. Export nucleare nella fase G2 è facilitata tramite un percorso di esportazione sconosciuto10. Una volta CENP-F risiede nel citosol, esso viene reclutato alla busta nucleare e reclute a sua volta il motore della proteina dineina complesso30,31. Questo percorso è importante posizionare il nucleo rispettivo per il centrosoma durante le fasi iniziali di assemblaggio del fuso mitotico in modo dineina-dipendente, che è importante per la corretta fasatura della voce mitotica e per un processo fondamentale nel cervello sviluppo30,31,32. A partire dalla fase G2, CENP-F è anche assemblati nel cinetocore dove ha ruoli importanti per fedele cromosoma segregazione27,28,33,34,35 . Un passo fondamentale di regolamentazione di queste vie è l'esportazione nucleare di CENP-F nella fase G2, che è dipenda Cdk110,11. Descriviamo qui un protocollo per l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici in cNLS CENP-f. Le mutazioni di Phosphomimetic di questi siti rallentano importazione nucleare di CENP-F, suggerendo che Cdk1/ciclina B regola direttamente la localizzazione cellulare di CENP-F da fosforilazione di sua cNLS10.
Nel complesso, questa analisi in vitro della chinasi permette l'identificazione di substrati specifici per proteine chinasi Cdk1. depurata bersaglio sono fosforilati in vitro di commercialmente disponibile Cdk1/ciclina B complesso e i siti di fosforilazione Successivamente vengono identificati mediante spettrometria di massa. L'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici supporta studi meccanicistici che rivelano come Cdk1 controlla il ciclo cellulare.

<table><tbody><tr><td>2800 mL di pallone di Fernbach sfalsato</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampicillina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>benzammidina cloridrato</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>filtro per flaconi</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/ciclina B ricombinante, umano 20.000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/ciclina B (fonte alternativa)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/ciclina B (fonte alternativa)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/ciclina B + 10x tampone PK</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (residui 2987 - 3065) plasmide pGEX6P1</td><td>Disponibile su richiesta.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuga: Heraeus Multifuge X3R, raffreddata, con rotore oscillante TX-1000</td> Unità filtranti centrifughe <td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>: Unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-15, cutoff 3 kDa, membrane Ultracel-PL</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>clorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L metionina</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td></td><td></td>125650010</tr><tr><td>puntali per pipette di desalinizzazione: Puntali Zip</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>colonne per cromatografia monouso, Econo-Pac 1,5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitolo</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS ceppo</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>ionizzazione elettrospray Spettrometro di</td> massa a risonanza ciclotronica <td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>spettrometro</td><td></td><td></td><td></td></tr> di massa a <tr><td>trappola ionica a ionizzazione elettrospray</td><td>Bruker Amazon</td><td></td> rotore ad angolo fisso personalizzato<td></td></tr><tr><td>: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>Sistema FPLC: &Auml; kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di filtrazione in gel: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutatione agarosio</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutatione, ridotto</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>agitatore di incubazione: multitron shaker</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>isopropilico &beta;-D-1-tiogalattopiranoside</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamicina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>carrioferina e alfa; pet-28a pres plasmide</td><td>Disponibile su richiesta.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuga 5418R, refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>microprovette (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>microprovette (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Gel di affinità al nichel: His-Select Gel di affinità al nichel</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plasmide</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetilsulfonile fluoruro Gold</td><td>Biotechnology</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS proteasi: Prescission proteasi</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Phos-tag acrilammide</td><td>Wako Pure Chem.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>gluthathione ridotto</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>provette da centrifuga a fondo tondo (provette Oakridge)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>kit di mutagenesi sito-specifica: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>kit</td><td></td><td></td><td></td>di mutagenesi sito-diretta</tr><tr><td>sonificante: sonificatore Branson S-250D</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC membrana per dialisi (cutoff 6-8 kDa)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>rotore oscillante TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione della chinasi cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi in vitro test

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono un master controller per il ciclo cellulare in tutti gli eucarioti e fosforilano un stimato 8-13% del proteoma; Tuttavia, il numero degli obiettivi identificati per Cdk1, particolarmente in cellule umane è ancora basso. L'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici è importante, in quanto forniscono meccanicistici intuizioni come Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Regolazione del ciclo cellulare è fondamentale per la segregazione del cromosoma fedele, e difetti in questo processo complicato portano ad aberrazioni cromosomiche e cancro.
Qui, descriviamo una in vitro analisi della chinasi che è utilizzata per identificare siti di fosforilazione Cdk1 specifici. In questo saggio, una proteina purificata è fosforilata in vitro di commercialmente disponibile umano Cdk1/ciclina B. Successful fosforilazione è confermata da SDS-PAGE, e siti di fosforilazione sono successivamente identificate mediante spettrometria di massa. Descriviamo anche protocolli di purificazione che producono preparati proteici altamente puro e omogeneo adatti per l'analisi della chinasi e un'analisi obbligatoria per la verifica funzionale dei siti di fosforilazione identificati, che l'interazione tra le sonde un segnale di localizzazione nucleare classica (cNLS) e relativo trasporto nucleare del ricevitore karyopherin α. Per aiutare con disegno sperimentale, passiamo in rassegna gli approcci per la stima dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici da sequenze proteiche. Insieme questi protocolli presentano un approccio molto potente che produce siti di fosforilazione Cdk1 specifici e consente studi meccanicistici in modo Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Poiché questo metodo si basa su proteine purificate, può essere applicato a qualsiasi modello organismo e rendimenti risultati affidabili, specialmente se combinata con studi funzionali delle cellule.

Abbiamo recentemente utilizzato una in vitro analisi della chinasi (Figura 1) per identificare i siti di fosforilazione Cdk1 specifici in un frammento di CENP-F che conteneva un cNLS10. Questo segnale conferisce la localizzazione nucleare di CENP-F durante la maggior parte di interfase. Nella fase G2, CENP-F viene esportato dal nucleo al cytosol in modo Cdk1-dipendente. Per ottenere meccanicistici intuizioni su come Cdk1 regol...

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono attivato nella fase G2 del ciclo cellulare e regola molte vie cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi in vitro della chinasi con Cdk1, che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici per stabilire obiettivi cellulari di questa chinasi importante.

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

L'obiettivo generale di questo saggio in vitro della chinasi è quello di identificare i siti di fosforilazione in una proteina di interesse che sono specifici per la chinasi ciclina-dipendente chinasi 1. L'identificazione di siti di fosforilazione specifici per CDK1 è importante in quanto forniscono informazioni meccanicistiche su come CDK1 controlla il ciclo cellulare. La regolazione del ciclo cellulare è fondamentale per la segregazione cromosomica completa di fase e i difetti portano ad aberrazioni cromosomiche e cancro.Il vantaggio principale di questa tecnica è che si basa su proteine purificate, quindi può essere applicata a qualsiasi organismo modello e produce risultati affidabili, soprattutto se combinata con studi funzionali nelle cellule. Questo metodo è importante in quanto il numero noto di bersagli CDK1 è ancora basso, nonostante il fatto che CDK1 fosforila circa l'8-13% del proteo. Sebbene questo metodo identifichi siti di fosforilazione specifici per CDK1, può essere modificato per identificare i siti di fosforilazione per altre chinasi, a condizione che la chinasi purificata sia disponibile.Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficol

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

FRET basato giornalisti sono sempre più utilizzati per monitorare le attività di chinasi e fosfatasi in cellule vive. Qui si descrive un metodo su come utilizzare FRET-based reporter per valutare ciclo-dipendente delle cellule cambiamenti nella fosforilazione di destinazione.

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

Chinasi Ripetere leucina Rich 2 è una chinasi multidominio grande, le cui mutazioni sono la causa genetica più comune della malattia di Parkinson. Analisi delle attività di questa proteina chinasi ha dimostrato di essere uno strumento fondamentale per comprendere la biologia e la disfunzione di questa proteina. In questo...

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

La fosforilazione delle proteine è una caratteristica centrale del modo in cui le cellule interpretano e rispondono alle informazioni nel loro ambiente extracellulare. Qui, presentiamo un protocollo di screening ad alto rendimento che utilizza chinasi purificate da cellule di mammifero per identificare rapidamente le chinasi che fosforilano uno o più substrati di interesse.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening

Qui, descriviamo come studiare la localizzazione mitocondriale di una chinasi (ciclo cellulare) e come determinare la sua posizione sub-mitocondriale, nonché potenziali substrati/bersagli mitocondriali. L'espressione forzata di proteine nei mitocondri fornisce uno strumento utile per studiare le conseguenze funzionali della localizzazione mitocondriale di una proteina di interesse.

Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

Le chinasi di proteine ​​sono enzimi e stadi di segnalazione altamente evoluti che sono critici per la trasduzione del segnale inter-e intracellulare. Presentiamo un protocollo per la misurazione dell'attività di chinasi mediante l'uso di trifosfato adenosina radiomarcato ([γ-32P] ATP), un metodo affidabile per aiutare a spiegare la regolazione cellulare di segnalazione.

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

I test di concorrenza del peptide sono ampiamente usati in una varietà di esperimenti molecolari ed immunologici. Questo documento descrive un metodo dettagliato per un test in vitro di oligopeptide-concorrenza e le relative procedure di convalida, che possono essere utili per trovare siti specifici di fosforilazione.

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Messa a fuoco isoelettrica capillare è una tecnica di basati su anticorpi, ultrasensibile, alta velocità di trasmissione, consentendo la dettagliata caratterizzazione delle proteine e loro isoforme da campioni biologici estremamente piccoli. Di seguito viene descritto un protocollo per il rilevamento e la quantificazione delle proteine specifiche e loro isoforme in modo automatizzato e robotizzato.

Rilevamento altamente sensibile e quantitativo delle proteine e loro isoforme dal metodo di messa a fuoco isoelettrica capillare

L'obiettivo del presente protocollo è di etichettare, arricchire e identificare i substrati della chinasi di proteina CK2 da un campione biologico complesso come un lysate delle cellule o del tessuto omogeneizzato. Questo metodo sfrutta gli aspetti unici di CK2 biologia per questo scopo.

Identificazione dei substrati di chinasi CK2 romanzo utilizzando un approccio biochimico Versatile

Abbiamo caratterizzato una nuova proteina della chinasi utilizzando robusti approcci biochimici: analisi Western Blot con un anticorpo specifico dedicato su diverse linee cellulari e tessuti, interazioni con esperimenti di coimmunoprecipitazioni, attività della chinasi rilevata da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico per ilfosforo e con l'etichettatura ATP di z[32 P].

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Il presente protocollo evidenzia l'applicazione della tecnica western blotting per studiare le funzioni e le attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2. Il protocollo descrive lo studio della fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi Thr906/1007 tramite western blotting. Inoltre, ulteriori metodi per confermare l'attività di KCC2 sono brevemente evidenziati in questo testo.

Studio delle funzioni e delle attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

Scopri come identificare siti di fosforilazione specifici per Cdk1 con un saggio di chinasi in vitro utilizzando proteine purificate. Questo metodo fornisce informazioni meccanistiche sul controllo del ciclo cellulare.

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Esplora altri video