La prova di infezione di pianta: Spray e ferita-mediata di inoculazione con la pianta patogeno Magnaporthe Grisea
4 agosto 2018
Qui, presentiamo un protocollo per testare la virulenza della pianta con la pianta patogeno Magnaporthe grisea. Questa relazione contribuirà alla proiezione su grande scala di patotipi di funghi isolati e servire come un ottimo punto di partenza per la comprensione dei meccanismi resistenti delle piante durante l'allevamento molecolare.
Questo video può aiutare a istruire i metodi chiave nel campo dell'infezione delle piante, come l'inoculazione mediata gratuita e desiderata con il patogeno delle piante Magnaporthe grisea. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il protocollo di irrorazione e ferita contribuisce allo screening rapido, accurato e su larga scala dei patotipi di funghi isolati. Le implicazioni di questa tecnica riguardano lo studio della fisiologia per combattere i patogeni delle piante perché è molto importante per la prevenzione e il controllo delle malattie delle piante su larga scala.
Questo metodo può fornire informazioni sul meccanismo patogeno della conservazione nei funghi. Può essere applicato anche alle principali varietà di piante agricole come il riso o l'orzo. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è difficile raschiare delicatamente i conidi con i tamponi di cotone sterili.
La dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto è difficile raccogliere ferite da graffio senza penetrare le foglie come mezzo principale per staccare le foglie di riso o orzo. Per iniziare, pesare da 30 a 50 grammi di farina d'avena. Aggiungere la farina d'avena a 800 millilitri di acqua distillata deionizzata e far bollire il composto per 30 minuti in una pentola elettrica.
Quindi filtrare la miscela di farina d'avena bollita attraverso un pezzo di garza in un bicchiere. Quindi aggiungere 150 millilitri di succo di pomodoro e 20 grammi di agar agar nel becher. Aggiungere acqua distillata deionizzata nel becher fino a 1000 millilitri.
Immergere circa 50 semi di riso in acqua distillata deionizzata per 3 giorni, quindi avvolgere i semi in una garza inumidita e farli germogliare su carta da filtro umida in piastre di Petri. Quindi, pianta le piantine in vasi con terriccio autoclavato. Dopo aver annaffiato le piantine, copritele con uno strato di vermiculite.
Metti le piantine in una serra mantenuta a 25 gradi Celsius per una o due settimane. Successivamente, usa le forbici chirurgiche sterili per tagliare tre strati di carta da filtro in cerchi di otto centimetri. Posizionare i cerchi di carta da filtro su piastre di plastica sterili da 100 millimetri.
Aggiungi abbastanza acqua deionizzata distillata a ogni piatto per immergere la carta da filtro. Quindi posizionare due stuzzicadenti sterili a due o tre centimetri di distanza in ogni piatto di coltura. Due settimane dopo la semina raccogli le foglie delle piante di riso tagliando la parte inferiore del fusto.
Utilizzando una coltura termostatica incubatore, la M.grisea filtra su piastre OTA a 25 gradi Celsius per quattro giorni. Quindi utilizzare una pipetta per aggiungere due millilitri di acqua deionizzata distillata a ciascuna piastra. Utilizzando un anello di inoculazione, raschiare i miceli dal tipo selvatico e dai ceppi mutanti nei detriti di miceli.
Raccogli i detriti di micelio e trasferiscili su una nuova piastra OTA. Quindi asciugare i detriti di miceli in un banco pulito. Aggiungere due millilitri di acqua distillata deionizzata alla capsula di micelio coltivato e utilizzare un batuffolo di cotone sterile per raschiare delicatamente i conidi.
Filtrare la sospensione di conidi attraverso due strati di carta per lenti e trasferire la sospensione in un nuovo tubo da 50 millimetri. Quindi centrifugare la provetta per cinque minuti a 5000 volte g. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con la soluzione di Tween-20, ottenendo una concentrazione di 20.000 conidi per millilitro.
Versare la sospensione in uno spruzzatore portatile, quindi spruzzare circa 10 millilitri di sospensione conidiale sulle foglie delle piante di riso di due settimane. Spruzzare le foglie delle piante di controllo con la soluzione Tween-20. Dopodiché, incubare le foglie in una scatola buia e umida per 24 ore.
Quindi trasferisci le foglie in una camera umida con luce fluorescente per 12 ore. Usando un ago anatomico, raschiare tre ferite lunghe due o tre centimetri nelle vene principali delle foglie di riso staccate. Metti le foglie raschiate sugli stuzzicadenti e spruzzale con la soluzione Tween-20.
Quindi tagliare un tappo miceliale di mezzo centimetro per mezzo dalle piastre OTA contenenti ciascun ceppo di M.grisea. Posiziona i tappi sulle foglie ferite e incubali in una camera umida a 25 gradi Celsius per tre-otto giorni. Dopo il periodo di incubazione, esaminare e valutare le lesioni secondo il sistema di punteggio fornito dall'International Rice Research Institute.
Infine, fotografare le foglie malate per valutare l'infettività dei ceppi testati. In questo protocollo, sono stati eseguiti saggi di infezione delle piante utilizzando i ceppi P131 e Com1 di M.grisea su piantine di riso sensibili. Le foglie di tipo selvatico inoculate P131 mostravano le tipiche lesioni robuste dell'esplosione del riso.
Tuttavia, le foglie inoculate con Com1 hanno mostrato evidenti difetti di infezione e non hanno provocato un'infezione completa. Per determinare se M. grisea potesse infettare le cellule ospiti attraverso le ferite, le foglie abrase di piante selvatiche sono state inoculate con tappi miceliali o goccioline conidiali. Le foglie inoculate con spray non hanno mostrato difetti di infezione.
Al contrario, le foglie inoculate tramite tappi miceliali mostravano evidenti difetti. Durante il tentativo di questa procedura è importante raschiare tre ferite lunghe due o tre centimetri nelle vene principali delle foglie di riso staccate. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'inoculazione di agenti patogeni, al fine di identificare e analizzare la resistenza alle malattie delle colture.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dei patogeni delle piante per esplorare la malattia del blasto del riso negli organismi moderni. Non dimenticare che lavorare con Magnaporthe grisea può essere pericoloso e che quando si eseguono queste procedure è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i guanti.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo per il test della virulenza su piante utilizzando il patogeno vegetale Magnaporthe grisea. Il metodo consente un'analisi rapida e su larga scala dei patotipi fungini, contribuendo alla comprensione dei meccanismi di resistenza delle piante.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Patologia Vegetale
- Interazioni Pianta-Microbo
- Patogenesi Fungina
Sfondo
- Magnaporthe grisea è un patogeno vegetale di notevole importanza.
- Comprendere la resistenza delle piante è fondamentale per la protezione delle colture.
- Lo studio dei patotipi fungini contribuisce allo sviluppo di varietà vegetali resistenti.
- Le tecniche di screening su larga scala sono essenziali per una ricerca efficace.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo per il test della virulenza delle piante contro Magnaporthe grisea.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di resistenza delle piante.
- Facilitare lo screening su larga scala di isolati fungini.
Metodi Utilizzati
- Tecniche di inoculazione libera e mediata da ferita.
- Protocolli di irrorazione e feritura per lo screening rapido.
- Utilizzo di bastoncini di cotone sterili per il prelievo di conidi.
- Applicazione a diverse piante agricole come riso e orzo.
Risultati principali
- Il protocollo consente uno screening accurato dei patotipi fungini.
- Fornisce informazioni sui meccanismi di conservazione dei patogeni.
- Il metodo è applicabile a diverse varietà di colture.
- Le difficoltà per i principianti includono la tecnica di raschiamento dei conidi.
Conclusioni
- Questo protocollo è uno strumento prezioso per i ricercatori in patologia vegetale.
- Contribuisce alla comprensione della resistenza delle piante ai patogeni.
- Applicazioni future potrebbero migliorare le strategie di prevenzione delle malattie delle colture.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente uno screening rapido, accurato e su larga scala di patotipi fungini, supportando la validazione degli obiettivi nella selezione di piante resistenti. Isolando le variabili di infezione mediate da ferite, riduce la resistenza all'ingresso dell'ospite, migliorando l'affidabilità predittiva nei saggi di virulenza. Il metodo facilita la riduzione dei rischi meccanicistici nelle interazioni patogeno-ospite per la ricerca traslazionale sulla protezione delle colture.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando l'infezione mediata da ferita per chiarire i meccanismi di virulenza del patogeno.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico mediante inoculazione standardizzata che evita interferenze dovute alla resistenza alla penetrazione dell'ospite.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia sul bersaglio fornendo una valutazione quantitativa delle lesioni per la validazione funzionale dei fattori di resistenza.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi mediante lo screening rapido e su larga scala di isolati di Magnaporthe grisea per patotipo.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso protocolli controllati di ferita artificiale e inoculazione per nebulizzazione.
- Valore di scalabilità: Evidenzia la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma per la valutazione di diverse ceppi fungini su varietà colturali differenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Discute la rilevanza delle malattie e l'allineamento dei biomarcatori traslazionali attraverso sistemi di valutazione delle lesioni associati a fenotipi di virulenza.
- Valore operativo: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo una valutazione coerente della patogenicità.
- Avanzamento basato sul rischio: Supporta le decisioni relative all'isolamento di geni di resistenza e all'incrocio molecolare sulla base della quantificazione dei difetti infettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si posiziona nelle fasi iniziali della scoperta per l'identificazione di fattori determinanti, consentendo la verifica di ipotesi sui fattori di virulenza e la chiarificazione dei percorsi nelle interazioni pianta-fungo.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica di ipotesi, la chiarificazione di percorsi biologici o la riduzione del rischio biologico attraverso l'isolamento mediato da ferita delle variabili di infezione.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità o gli output quantitativi mediante la preparazione standardizzata di sospensioni conidiali e la valutazione delle lesioni.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni, letture o output statistici che aiutano i gruppi di lavoro a confrontare le condizioni utilizzando i sistemi di valutazione dell'International Rice Research Institute.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica o all'allineamento di biomarcatori, associando i fenotipi delle lesioni alla caratterizzazione dei geni di resistenza.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che come una tecnica monouso, adatta ad applicazioni di screening della patogenicità su larga scala.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella valutazione della virulenza.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dello screening dei patotipi fungini tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi di miglioramento genetico per la resistenza delle colture.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su profili quantitativi di virulenza.
Considerazioni relative all'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in patologia vegetale, microbiologia e tecnica asettica per la manipolazione delle conidiospore.
- Le attrezzature e le infrastrutture analitiche necessarie includono incubatori termostatici, centrifughe, camere umidificate e sistemi di acquisizione delle immagini delle lesioni.
- Requisiti di standardizzazione tra i gruppi di lavoro riguardo alla coerenza delle ferite, alla preparazione dell'inoculo e al rispetto del protocollo di valutazione.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, come riso, orzo e altre piante di rilevanza agricola.
- I limiti pratici supportati dalla letteratura includono la difficoltà, per i principianti, di prelevare delicatamente le conidiospore con bastoncini di cotone sterili.
