Isolamento delle cellule stromali dell'endometrio umane per In Vitro decidualizzazione

Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo della medicina riproduttiva sui meccanismi molecolari sottostanti alla decidualizzazione e sulla comprensione dei ruoli di geni specifici nella decidualizzazione delle cellule stromali endometriali. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule stromali endometriali umane e la successiva decidualizzazione artificiale mediante l'integrazione di ormoni ai terreni di coltura. L'espressione dei cambiamenti ormonali, come la prolattina e la proteina legante il fattore di crescita insulino-simile, può essere utilizzata per confermare e quantificare il grado di decidualizzazione.

È importante sottolineare che è stata dimostrata anche la fattibilità di questo protocollo per condurre un knockdown gene specifico. Trasferire la biopsia con pinza sterilizzata in una provetta da 50 millilitri contenente dieci millilitri di HBSF fresco, seguita da centrifugazione a 500x G per 90 secondi. Utilizzando una pipetta da un mL, rimuovere il terreno e aggiungere tre mL di terreno di isolamento hES preriscaldato.

Decantare la biopsia in un piatto di 10 centimetri contenente cinque ml di terreno isolante hES e iniziare a tagliare utilizzando una pinza Dumont 5 e forbici per punti dritti fini per circa 20 minuti. Utilizzando una pipetta da un ml, trasferire la biopsia tagliata in una nuova provetta da 50 ml e aggiungere altri sette ml di terreno isolante hES alla piastra, per trasferire i pezzi rimanenti nella provetta da 50 ml. Quindi centrifugare il campione per due minuti a 800 g e rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta da un mL.

Successivamente, filtrare la miscela di digestione DNasi-1 e collagenasi attraverso un filtro da 0,2 micron collegato a una siringa da 10 millilitri direttamente sul pellet. Quindi agitare il tubo per 10 secondi per risospendere il pellet e incubare per 90 minuti a bagnomaria. Dopo ogni 10 minuti, agitare il tubo per 10 secondi per assicurarsi che il tessuto sia digerito correttamente.

Dopo l'incubazione, filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 40 micron impilato su una nuova provetta da 50 millilitri per recuperare le cellule stromali, quindi centrifugare le cellule raccolte a 800 volte G per 2,5 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere delicatamente il surnatante utilizzando una pipetta da un millilitro, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare. Quindi risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di terreno di isolamento hES fresco, seguito da centrifugazione a 800x G per 2,5 minuti.

Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante e risospendere le cellule in sei millilitri di terreno hES fresco. Quindi, per rimuovere le cellule del sangue, sovrapporre lentamente le cellule risospese su tre millilitri di terreno a gradiente di densità e centrifugare il campione a 400x G per 30 minuti. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante senza disturbare il mezzo di gradiente di densità.

Quindi aggiungere i terreni hES per portare il volume totale a 10 millilitri e centrifugare nuovamente il campione a 800x G per 2,5 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in sei millilitri di terreno hES. Successivamente, piastrate le cellule in un pallone da 75 centimetri aggiungendo sei millilitri di risospensione cellulare e 10 millilitri di terreno hES al pallone, seguito da una delicata miscelazione attraverso l'oscillazione del pallone.

Dopo la piastratura, controllare la densità cellulare al microscopio, quindi coltivare le cellule in un incubatore al 5% di anidride carbonica per tre-cinque giorni, assicurandosi di cambiare il terreno hES ogni due giorni. Dopo 48 ore, le cellule dovrebbero crescere come un monostrato. Generalmente dopo cinque giorni, le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza in un pallone di 75 centimetri.

Per la trasfezione di siRNA, iniziare con la placcatura di 800.000 cellule per pozzetto in una piastra a sei pozzetti in triplicati per ogni condizione e incubare le cellule in un incubatore al 5% di anidride carbonica per due giorni per prepararsi alla trasfezione. Dopo due giorni, aggiungere 150 microlitri di terreno privo di siero Opti-MEM in una provetta da cinque mL, quindi aggiungere cinque microlitri di reagente di trasfezione. Mescolare bene per inversione e incubare per cinque minuti.

Successivamente aggiungere 100 microlitri di terreno privo di siero Opti-MEM in una nuova provetta da cinque mL, seguita dall'aggiunta di 16 nanomoli di siRNA SRC-2. Quindi aggiungere 100 microlitri di terreno privo di siero Opti-MEM in una provetta da cinque mL, seguito dall'aggiunta di 16 nanomoli di siRNA di controllo. Dopo l'incubazione, combinare il reagente di trasfezione diluito con il siRNA SRC-2 e mescolare bene pipettando in avanti e all'indietro.

Quindi combinare il reagente di trasfezione diluito con il siRNA di controllo e mescolare bene pipettando in avanti e indietro. Quindi incubare i complessi per cinque minuti. Durante questa incubazione, aspirare il terreno hES e aggiungere un millilitro di terreno di scambio a ciascun pozzetto.

Dopo cinque minuti di incubazione, centrifugare i complessi a 500x G per due minuti per raccogliere la soluzione. Quindi aggiungere 250 microlitri di complessi di reagenti di trasfezione siRNA a ciascun pozzetto contenente cellule e terreni e mescolare con un leggero dondolo, seguito dall'incubazione in un incubatore al 5% di anidride carbonica per cinque ore a 37 gradi Celsius. Dopo cinque ore, aspirare il terreno e passare al terreno hES, quindi continuare l'incubazione per due giorni in preparazione di un saggio di decidualizzazione in vitro.

Dopo la trasfezione di 48 ore e prima di iniziare il saggio di decidualizzazione in vitro, raccogliere le cellule trasfettate con siRNA di controllo del giorno zero e siRNA SRC-2. Innanzitutto, aspirare il terreno e lavare con un ml di PBS per pozzetto. Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi dell'RNA per pozzetto e incubare per tre minuti.

Dopo tre minuti di incubazione, raccogliere le cellule nel tampone di lisi dell'RNA in una provetta da 1,5 ml per la successiva analisi a valle. Quindi preparare il terreno EPC aliquotando il volume appropriato di terreno di decidualizzazione e aggiungere 10 estradiolo nanomolare, un acetato di medrossiprogesterone micromolare e 50 micromolari di adenosina monofosfato ciclico in una provetta da 50 millilitri. Per i restanti pozzetti del sesto giorno, aggiungere due millilitri di terreno EPC in ciascun pozzetto e incubare le cellule in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per sei giorni, cambiando il terreno EPC ogni 48 ore.

Dopo il sesto giorno, raccogliere i pellet cellulari trasfettati con siRNA di controllo del sesto giorno e SRC-2 del sesto giorno in tampone di lisi dell'RNA per l'analisi a valle utilizzando la PCR in tempo reale. L'induzione della decidualizzazione da parte dell'estrogeno medrossiprogesterone acetato e dell'adenosina monofosfato ciclico, provoca il riarrangiamento citoscheletrico delle cellule stromali da cellule fibroblastiche allungate a cellule epitelioidi arrotondate. La colorazione con falloidina delle cellule stromali endometriali rivela ulteriormente la riorganizzazione del citoscheletro delle fibre attive caratteristica della decidualizzazione dell'hES.

Nelle cellule trattate con veicolo hES, le cellule rimangono fibroblastiche nell'aspetto, mentre nelle cellule trattate con EPC, le hES apparivano simili a quelle epitelioidi. Per confermare l'efficacia del test di decidualizzazione in vitro, sono stati valutati i livelli di trascrizione dell'mRNA dei marcatori di decidualizzazione prolattina e proteina legante il fattore di crescita insulino-simile-1 per un periodo di 6 giorni. Dopo la decidualizzazione delle cellule stromali endometriali umane, i livelli di prolattina e IGFBP1 sono aumentati in modo dipendente dal tempo.

L'aumento tempo-dipendente dei livelli di prolattina secreta è stato confermato anche esaminando i terreni di coltura tissutale hES tramite metodo ELISA. Gli effetti del knockdown specifico del gene sui cambiamenti cellulari e molecolari della decidualizzazione delle cellule stromali endometriali umane sono stati valutati il sesto giorno di coltura dopo la trasfezione di siRNA di 48 ore, con il co-attivatore del recettore steroideo di controllo 2 siRNA. Il siRNA di controllo trasfettato con hES ha dimostrato cambiamenti cellulari e molecolari, coerenti con una corretta decidualizzazione, tra cui un cambiamento morfologico di ciottoli e un aumento dei livelli di trascrizione dei marcatori di decidualizzazione PRL e IGFBP1.

Nel knockdown del siRNA SRC-2, l'hES è rimasto in aspetto fibroblastico rispetto al siRNA di controllo trasfettato e ha mostrato livelli significativamente ridotti di PRL e IGFBP1. I livelli di trascrizione di SRC-2 erano significativamente diminuiti nell'hES trasfettato con siRNA SRC-2 rispetto al siRNA di controllo, indicando la fattibilità di questo metodo per il silenziamento genico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule stromali primarie dalle biopsie endometriali ai fini della decidualizzazione in vitro e dell'abbattimento di un gene specifico di interesse utilizzando la trasfezione siRNA.