Name: Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri il metodo per arricchire e caratterizzare i microambienti immuni e non immuni in tumori murini sottocutanei. Questa tecnica consente il profiling simultaneo delle frazioni cellulari per studiare le risposte al trattamento.

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JMN riconosce sostegno finanziario dal National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) e dal National Institute of Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) entrambi i National Institutes of Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Questo progetto è stato supportato anche dalla citometria e nucleo di ordinamento delle cellule presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti dal NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 e S10 RR024574) e l'assistenza di esperti di Joel M. Sederstrom.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine.
1. digestione e raccolto tumore
Nota: Il tempo richiesto per il raccolto è ~ 3-5 min/tumore e il tempo necessario per l'elaborazione è ~ 1 h + 2-3 min/tumore.
<ol><li>Eutanasia di topi per inalazione di anidride carbonica e spray ogni mouse giù con etanolo al 70% prima della raccolta per evitare la contaminazione di capelli. Chirurgicamente rimuovere tumori sottocutanei dai topi e garantire che i tumori sono privi di qualsiasi tessuto contaminante (cioè, capelli, pelle, peritoneo, ecc.). Posizionare ogni tumore in 1,8 mL di base RPMI-1640 media senza siero bovino fetale (FBS) in una piastra a 24 pozzetti. Per raccolti più abbondanti, mantenere piastre fredde sul ghiaccio per preservare la vitalità cellulare. Nota: Se è richiesta la sterilità, necessario essere eseguita in una cappa di biosicurezza con strumenti chirurgici sterili (cioè, forbici, pinze, ecc.), come pure qualsiasi ulteriore procedura tutte le dissezioni di tumore. I tumori con il diametro più lungo tra 0,5 - 1 cm sono ottimali, e tumori maggiori o minori richiederanno ridimensionamento dei reagenti.</li>
	<li>Usare le forbici per tagliare i tumori in meno di 1 mm3 pezzi all'interno di ciascun pozzetto.</li>
	<li>Preparate un 10 x cocktail di digestione sciogliendo collagenosi sono a 10 mg/mL, collagenasi IV a 2.500 U/mL e dnasi I a 200 U/mL in base RPMI-1640 media (senza FBS). Nota: La digestione cocktail può essere preparata un giorno in anticipo e conservata a-20 ° C; Tuttavia, una conservazione prolungata non è raccomandata come enzimi perderà l'attività nel corso del tempo una volta sciolto.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di 10 x cocktail di dissociazione contenente collagenasi I, IV collagenosi e dnasi I per ciascun pozzetto con il mm 13 pezzi.</li>
	<li>Consentire ai campioni di digerire per 1h a 37 ° C agitando leggermente a 60-100 rpm usando un agitatore orbitale. Nota: L'elevazione della temperatura a 37 ° C durante la digestione enzimatica può causare l'attivazione delle cellule immuni.</li>
	<li>Dopo 1 h, neutralizzare la reazione aggiungendo 1 mL di terreno RPMI-1640 completati con 5% FBS e 2 mM EDTA in ciascun pozzetto.</li>
	<li>In un colino di cella di 40 µm seduto sulla cima di un tubo di centrifuga da 50 mL, pipettare la digestione di tumore e i restanti pezzi di tumore. Nota: Tagliare la punta al largo di punta di una pipetta da 1 mL per il trasferimento più facile della digestione tumore al filtro.</li>
	<li>Utilizzare un pistone della siringa da 10 mL per disaggregare meccanicamente i pezzi del tumore attraverso il colino. Sciacquare periodicamente il filtro con 2 mL di completati RPMI-1640 media (contenente 5% FBS) e ripetere fino a quando il filtro cella è chiaro del tumore. Nota: 4-10 mL circa di media totale dovrebbe essere sufficiente adeguatamente sciacquare il filtro del tumore. Nota: Posizionare il campione sul ghiaccio fino al completamento di questo passaggio per tutti i campioni preservare la vitalità cellulare.</li>
	<li>Regolare ogni 50 mL provetta dello stesso volume utilizzando il supporto di RPMI-1640 completato. Nota: La regolazione del volume è fondamentale per il bilanciamento della centrifuga. Saltare questo passaggio potrebbe provocare lesioni personali o danni della centrifuga.</li>
	<li>Centrifugare le sospensioni delle cellule (5 min, 805 x g, 4 ° C), eliminare i sovranatante e risospendere in 2 mL di completati RPMI-1640 media. Nota: Un aggregato di cellule può formare dopo la centrifugazione che è difficile risospendere. Utilizzare una pipetta sierologica da 5 mL e mescolare velocemente per rompere in su prima di procedere.</li>
</ol>2. separazione delle frazioni cellulari del tumore e immunitario
Nota: Il tempo necessario per questo passaggio è circa 1 h.
<ol><li>Aggiungere 3 mL di terreno di gradienti di densità sul fondo di una provetta da centrifuga da 15 mL. Preparare ed etichettare il numero necessario di provette per ogni tumore.</li>
	<li>Strato da 2 mL di sospensione cellulare del tumore in cima il mezzo di gradienti di densità pipettando lentamente lungo il lato del tubo per evitare la miscelazione dei due strati.</li>
	<li>Posizionare i tubi a più livelli nella centrifuga e spin per 20 min a 805 x g, 20 ° C, con freno non. Nota: È estremamente importante verificare il corretto bilanciamento e assicurarsi che nessun freno viene utilizzato durante la centrifugazione. Qualsiasi interruzione di questo processo si tradurrà in strato di miscelazione e il recupero completo del campione sarà difficile.</li>
	<li>Trasferire con cautela il tumore infiltrante del leucocita (TIL) strato e lo strato superiore media ad un nuovo tubo da 15 mL utilizzando una pipetta di trasferimento. Eliminare tutti i rimanenti densità gradiente terreno e risospendere il pellet di tumore nella parte inferiore del tubo in 2 mL di RPMI-1640 completati. Nota: Dopo la centrifugazione ci saranno quattro livelli visibili dall'alto verso il basso che corrispondono rispettivamente a: media, TILs, densità gradiente medio e pellet cellulare del tumore. Vedere la Figura 2A per un esempio dei vari strati.</li>
	<li>Centrifugare l'entrambi TIL e campioni di tumore in separano tubi (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il campione TIL in 200 µ l e il pellet di tumore in 2 mL di completati RPMI-1640 media. Tenere sul ghiaccio per preservare la vitalità.</li>
</ol>3. placcatura e colorazione
Nota: Il tempo richiesto per la placcatura è 30 s/tumore; il tempo richiesto per la marcatura di superficie è 1h; il tempo necessario per la colorazione intracellulare è 40 min; il tempo necessario per l'analisi di citometria a flusso è 1 - 4 min/tumore.
<ol><li>Preparare e conta di targhetta di identificazione un fondo U 96 pozzetti per ogni immunitario macchiatura pannello e una targhetta supplementare per cella. Nota: In genere, tre piatti sono preparati in totale: un concentrato del linfocita pannello piatto, un piatto di pannello mieloide-messa a fuoco e un piatto di conteggio delle cellule.</li>
	<li>Aliquotare le sospensioni unicellulari in ciascuna della colorazione pannello piastre e un volume impostato nella piastra del conteggio. Nota: La piastra di conteggio viene utilizzata per calcolare il numero totale di celle aggiunte ad ogni pannello di colorazione, consentendo in tal modo i conteggi delle cellule accurata della popolazione. Un citometro a flusso con capacità di campionamento e analisi volumetrica di piastra a 96 pozzetti può fornire il numero di cellule per µ l di ciascun campione e quindi, calcolare il numero di celle aggiunte ad ogni pannello di colorazione. Piastre di conteggio possono essere acquistati il giorno seguente dopo la fissazione durante la notte a 4 ° C, risciacquo con buffer di FACs (tampone fosfato salino (PBS) con 2% FBS) e risospendere in un volume di tampone di FACs.</li>
	<li>Lavare le cellule due volte con 200 µ l di soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) per campione di centrifugazione (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il supernatante tra ogni risciacquo per rimuovere qualsiasi FBS gratis.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di blocco Fc, mescolare i campioni utilizzando una pipetta multicanale e incubare per 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di 2x concentrato anticorpo targeting extracellulare e attuabilità risolvibile macchia miscela, mescolare utilizzando una pipetta multicanale ed incubare per 30 min al buio a RT o 4 ° C. Nota: Le esatte condizioni che macchia per l'anticorpo dipendono le istruzioni del produttore. Tutte le diluizioni di colorazione devono essere in DPBS, con nessun FBS aggiunto per evitare la saturazione della tintura attuabilità risolvibile. Si prega di consultare la Tabella dei materiali/attrezzature per le diluizioni ottimale del pannello di colorazione utilizzata in questo manoscritto. Dell'anticorpo e risolvibile vitalità colorazione soluzione è preparato ad una concentrazione di 2 x per fornire un finale 1 x colorazione concentrazione in 100 µ l di volume totale colorazione quando aggiunto al blocco Fc.</li>
	<li>Lavare i campioni due volte con tampone di FACs centrifugazione (5 min, 805 x g, 4 ° C) ed eliminando i surnatanti tra ogni risciacquo.</li>
	<li>Risospendere in 200 µ l di soluzione di fissazione/permeabilizzazione 1x e incubare per una notte a 4 ° C al riparo dalla luce. Nota: L'esperimento può essere messo in pausa durante la notte a questo punto: conservare i campioni a 4 ° C al riparo dalla luce.</li>
	<li>Il giorno seguente, centrifugare le piastre (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il surnatante.</li>
	<li>Sciacquare una volta con 200 µ l di tampone di permeabilizzazione, centrifugare (5 min, 805 x g, 4 ° C), 1x e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di 1 pannello colorazione x anticorpo intracellulare concentrato preparato in tampone di permeabilizzazione 1x e incubare per 30 min al buio a RT o a 4 ° C (questo dipende dalla colorazione consigli dal produttore).</li>
	<li>Sciacquare una volta con permeabilizzazione 1x buffer (5 min, 805 x g, 4 ° C), scartare il surnatante e risciacquare una seconda volta con buffer di FACs (PBS con 2% FBS).</li>
	<li>Risospendere i campioni a 300 µ l di tampone di FACs (PBS con 2% FBS), trasferire i campioni a tubi di flusso cytometry ed eseguire analisi di citometria a flusso.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il tempo è composto di molecole e componenti cellulari diversi e complessi. La prova recente suggerisce che accurata caratterizzazione di questo ambiente in grado di fornire una migliore comprensione del trattamento esito positivo o negativo e può anche aiutare a identificare i meccanismi di resistenza terapeutica. Ad esempio, aumentando i livelli di intratumoral di varie cellule immunosoppressive (cioè, MDSC, cellule T regolatorie, ecc.) possa attenuare le risposte immunitarie effettrici ed abrogare ef...

Il tempo soppressivo recentemente è stato riconosciuto come un marchio di garanzia di cancro ed è conosciuto per svolgere un ruolo significativo nello sviluppo, progressione e nella protezione dei cancri solidi del tumore così come mitigare la loro suscettibilità all'immunoterapia1. Il tempo è composto di numerosi cellulari sottoinsiemi e fenotipi, che forniscono approfondimenti critici dello stato immunologico del tumore. Questi sottoinsiemi immunologici possono essere ulteriormente stratificati nelle cellule del linfocita o origine mieloide, che insieme costituiscono la maggior parte della risposta immunitaria innata e adattativa2,3. I recenti progressi nel campo dell'immunoterapia del cancro hanno dimostrato che strategie di immunoterapia (cioè, gli inibitori di checkpoint immuni, recettore chimerico antigene T-cellule, ecc.) hanno il potenziale di indurre cancro durevole regressioni; Tuttavia, rimangono relativamente inefficace nel tumore solido cancri4,5. Numerosi gruppi hanno mostrato la transenna critica che il tempo può svolgere il trattamento successo6,7, e così, ci rimane la necessità di valutare con precisione le nuove immunoterapie in ambito pre-clinico, occupandosi in particolare del loro capacità di modulare o superare il tempo8.
Gli sforzi attuali per caratterizzare il tempo in genere utilizzano entrambi microscopia o flusso cytometry insieme strategie per identificare immuni cellulari sottoinsiemi e loro caratteristiche9,10di contrassegno dell'anticorpo. Queste due strategie forniscono informazioni in modo univoco diverse, come la microscopia permette spaziale apprezzamento dei sottoinsiemi cellulare e citometria a flusso fornisce throughput elevato e più ampia quantificazione dei cambiamenti cellulari. Nonostante i recenti miglioramenti in immunoistochimica multisala fluorescente l'ottimizzazione di sistemi di imaging spettrale, che ora possono supportare fino a 7 parametri, dimensioni pannello limitato rendono vasto livello immunitario profilatura difficile e così questa tecnica è spesso riservati per più concentrata di analisi. Di conseguenza, citometria a flusso rimane uno del sistema immunitario più ampiamente usato tecniche di profilatura. Nonostante il suo uso diffuso nella caratterizzazione di tempo, i metodi utilizzati per la lavorazione e colorazione sono molto variabili. Più spesso protocolli utilizzano un tumore dissociando enzima (cioè, collagenasi, DNasi, ecc.) e metodi di dissociazione manuale per raggiungere sospensioni unicellulari, seguita da anticorpo che macchia e analisi7. Nonostante i vantaggi di ciascun metodo, numerosi gruppi hanno dimostrato la notevole variabilità che può essere indotta attraverso queste tecniche11. Questo rende la croce-Studio comparazioni di profilatura di microambiente del tumore estremamente difficile, anche quando valutare lo stesso modello di tumore murino. Inoltre, questi metodi forniscono un potenziale limitato per valutare il tumore cellulare e immunitaria tumore infiltrarsi componenti in modo indipendente, dal momento che entrambi i componenti sono sparpagliati dopo la digestione. Quantità di campione limita quindi multi-pannello di colorazione e di analisi, che diventa un grosso problema durante il tentativo di caratterizzare sottoinsiemi immunologiche rare (cioè, tumore-specifiche cellule T)12. Tecniche più recenti come massa cytometry, o citometria a tempo di volo (CyTOF), permettono di alto-dimensionali analisi fenotipica di sottopopolazioni cellulari con alcuni sistemi di supporto disegni pannello superiore a 42 parametri indipendenti13. Nonostante l'enorme potenza di tecnologia CyTOF in profilatura immuni, resta limitato a causa di spese, competenze di analisi e l'accesso all'apparecchiatura. Inoltre, molti protocolli di CyTOF consiglia di purificazione dei sottoinsiemi immuni per migliorare i rapporti segnale-rumore14, e quindi suggeriamo che il nostro metodo di arricchimento poteva essere utilizzato a monte dell'analisi CyTOF per migliorare la qualità dei dati.
Qui descriviamo una digestione microambiente del tumore e analisi metodo che incorpora immunitaria tumore infiltrarsi separazione. Lo scopo di questo metodo è quello di consentire indipendente high throughput profilatura del si infiltra in sistema immunitario in tumore e frazioni cellulari del tumore per la più ampia caratterizzazione del microambiente tumorale. Utilizzando questo metodo, noi dimostrare ulteriormente l'importanza di eseguire analisi di intero tumore, come un modello di tumore solido sottocutaneo è stato trovato per avere significativa eterogeneità spaziale immunologica. Nel complesso, questo metodo può più accuratamente e costantemente confrontare tra campioni perché arricchisce per sottoinsiemi immuni cellulari all'interno del tumore e permette per la profilatura indipendente delle cellule del tumore e frazioni immunitarie di un tumore.

<table><tbody><tr><td>Topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 12 settimane</td><td>Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Topi utilizzati nei nostri studi sui tumori</td></tr><tr><td>Linea cellulare di cancro singenico murino MEER</td><td>Acquisita dal collaboratore&nbsp;</td><td>N/A</td><td>E6/E7 Linea cellulare di carcinoma epiteliale tonsillare murino che esprime l'antigene HPV&nbsp;</td></tr><tr><td>Alcool isopropilico al 70%&nbsp;</td><td>EMD Milipore&nbsp;</td><td>PX1840</td><td></td></tr><tr><td>Kit di strumenti chirurgici murini</td> World <td>Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td>Principalmente ha bisogno solo di forbici, pinzette e bisturi.</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti&nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>T1024</td><td>O qualsiasi piastra a fondo piatto a 24 pozzetti.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi I&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>234153</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>agitatore orbitale a bassa velocità</td><td>BioExpress (fornitore: Genemate)&nbsp;</td><td>S-3200-LS</td><td>O qualsiasi agitatore orbitale.</td></tr><tr><td>Incubatore termoregolatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-255-27</td><td>O qualsiasi altro incubatore termoregolato</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipetta e puntali</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-032</td><td>O qualsiasi altra pipetta e puntali</td></tr><tr><td>40 um Filtri cellulari</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 ml</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Luer-Lok da 10 mL senza aghi</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep Densità Gradiente Medio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P7212</td><td></td></tr><tr><td>Piastre con fondo a U a 96 pozzetti,</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D8573</td><td></td></tr><tr><td>Set di tamponi di colorazione del fattore di trascrizione FoxP3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td>Tampone di Fissazione/Permeabilizzazione e Tampone di Permeabilizzazione</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Termoregolata Eppendorf&nbsp;</td><td>Citometro a flusso 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Per il conteggio volumetrico di cellule a 96 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Ratto purificato anti-topo CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)&nbsp; Clone 2.4G2&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>553141</td><td>Fc Block</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte blu fissabile, per eccitazione UV</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34962</td> Anticorpo monoclonale CD45 con <td>colorazione di vitalità fissabile</td></tr><tr><td>(30-F11), APC-eFluor 780</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>47-0451-80</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta anticorpo monoclonale (H57-597), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8-&alfa; Anticorpo (KT15), PE</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53473&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale CD4 (GK1.5), PE-Cianina5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>MHC Classe II (I-A/I-E) Anticorpo monoclonale (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>56-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale CD11c (N418), PE-Cianina5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Anticorpo monoclonale (BM8), eFluor 450</td><td>Anticorpo</td> monoclonale ThermoFisher Scientific <td>48-4801-80</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (M1/70), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G (Gr-1) anticorpo monoclonale (RB6-8C5), PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) anticorpo monoclonale (MIH5), PE-cianina 7</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25-5982-80</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale CD273 (B7-DC) (122), Anticorpo monoclonale PerCP-eFluor 710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9972-82</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (B56), BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563755</td><td></td></tr></tbody></table>

arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Microambiente tumorale immuni (tempo) recentemente è stato riconosciuto come un mediatore critico di risposta al trattamento nei tumori solidi, soprattutto per le immunoterapie. Recenti progressi clinici nell'immunoterapia evidenziano l'esigenza di metodi riproducibili caratterizzare accuratamente e completamente il tumore e suoi associati si infiltrano in immuni. Digestione enzimatica del tumore e l'analisi cytometric di flusso permettono ampia caratterizzazione di numerosi sottoinsiemi delle cellule immuni e fenotipi; Tuttavia, profondità di analisi è spesso limitata dalla fluoroforo restrizioni sul design del pannello e la necessità di acquisire campioni di grande tumore di osservare rari popolazioni immuni di interesse. Così, abbiamo sviluppato un metodo efficace e ad alta produttività per la separazione e arricchendo l'infiltrato immune tumore dai componenti del tumore non immune. La digestione di tumore descritto e separazione centrifuga basati su densità tecnica permette separato caratterizzazione del tumore e tumore immuni si infiltra in frazioni e preserva la vitalità cellulare e quindi, fornisce un'ampia caratterizzazione del tumore stato immunologico. Questo metodo è stato usato per caratterizzare la vasta eterogeneità immuni spaziale nei tumori solidi, che dimostra ulteriormente la necessità di tecniche di analisi immunologiche coerente intero tumore. Nel complesso, questo metodo fornisce una tecnica efficace ed adattabile per la caratterizzazione immunologica dei tumori murini solidi sottocutanei; come tale, questo strumento può essere utilizzato per caratterizzare meglio le caratteristiche immunologiche tumorale e nella valutazione preclinica di nuove strategie immunoterapeutiche.

I nostri risultati dimostrano il beneficio significativo di TIL separazione da componenti del tumore non immune, come spiegato nel protocollo. Inoltre, utilizzando il metodo descritto dimostriamo la significativa eterogeneità immunologica dei tumori solidi stabiliti.
Un problema significativo con molte tecniche di dissociazione del tumore è la perdita di vitalità del campione, più spesso a causa delle condizioni difficili digest...

Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l'analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.

Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di fornire un metodo per la profilazione simultanea delle frazioni immunitarie e delle cellule tumorali che contribuiscono al microambiente immunitario dei tumori solidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'immuno-oncologia, come ad esempio quali cambiamenti seriali immunitari e non immunitari si verificano all'interno del tumore dopo un determinato trattamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita l'efficace arricchimento delle componenti immunitarie e non immunitarie del tumore, consentendo una profilazione completa dello stato immunologico del tumore.L'obiettivo generale di questo metodo è quello di profilare in modo efficiente il microambiente immunitario tumorale e identificare i cambiamenti indotti dal trattamento. Dopo aver spruzzato il topo con etanolo al 70% per prevenire la contaminazione dei capelli, rimuovere chirurgicamente i tumori sottocutanei, facendo attenzione che i tumori siano privi di qualsiasi tessuto contaminante. Quindi, posizionare ciascun tumore in 1,8 millilitri di terreno base RPMI 1640 senza siero fetale bovino in pozzetti individuali di una piastra a

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Ricerca sul cancro

In questo rapporto, descriviamo un protocollo per isolare popolazioni altamente purificate di leucociti che infiltrano i tumori. Questo protocollo è stato adattato dal Miltenyi Biotech protocollo per migliorare la resa e la purezza per isolare cellule dal tessuto tumorale complessa.

Isolamento di cellule immunitarie di tumori primari

Questo video illustra i test di terapia adiuvante o aggiuntiva in un modello murino con tumori sottocutanei resecati in modo incompleto. Il topo parzialmente resecato con tumore è trattato con un anticorpo che ha come bersaglio la proteina anti-citotossica delle cellule T regolatorie, riducendo potenzialmente la ricrescita tumorale e suggerendo un'efficace terapia adiuvante.

Una terapia adiuvante in un modello murino con un tumore sottocutaneo non completamente resecato

Questo protocollo descrive un metodo per la valutazione dettagliata dei sottogruppi di leucociti all'interno del microambiente tumorale in un modello tumorale di topo. Le cellule di melanoma B16 che esprimono chemerina sono state impiantate per via sottocutanea in topi singenici. Le cellule del microambiente tumorale sono state quindi colorate e analizzate mediante citometria a flusso, consentendo analisi dettagliate dei sottogruppi di leucociti.

Valutazione del tumore infiltrante leucociti sottoinsiemi in un tumore sottocutaneo modello

Abbiamo adattato un inserto di membrana microporosa permeabile per imitare il microambiente tumorale (TME). Il modello è costituito da una coltura cellulare mista, consente la generazione semplificata di singole popolazioni cellulari altamente arricchite senza l'uso di marcature fluorescenti o di smistamento cellulare e consente di studiare la comunicazione intercellulare all'interno del TME in condizioni normali o di stress.

Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Qui presentiamo un metodo riproducibile per lo sviluppo di un modello murino ortotopico di carcinoma di cellule squamous testa e del collo. I tumori dimostrano clinicamente rilevanti caratteristiche istopatologiche della malattia, compreso necrosi, differenziazione difficile, le metastasi nodali e infiltrazione immune. Topi del tumore-cuscinetto sviluppano sintomi clinicamente rilevanti tra cui disfagia, spostamento mascella e la perdita di peso.

Intramucosa inoculazione delle cellule di Carcinoma di cellule Squamous nei topi per profilatura Immune tumore e valutazione della risposta di trattamento

Questo protocollo descrive la generazione chirurgica di tumori pancreatici ortotopici e la rapida digestione di tumori pancreatici del murino appena isolati. Dopo la digestione, le popolazioni di cellule immunitarie vitali possono essere utilizzate per ulteriori analisi a valle, tra cui la stimolazione ex vivo delle cellule T per il rilevamento della citochina intracellulare mediante citometria di flusso.

Generazione di tumori pancreatici ortotopici e caratterizzazione ex vivo della citotossicità delle cellule T infiltranti di tumore

Qui, presentiamo un protocollo di trapianto tumorale per la caratterizzazione di linfociti infiltrati tumorali intrinseci e periferici derivati dal tumore in un modello di tumore murino. Il tracciamento specifico dell'afflusso di cellule immunitarie derivate dal ricevente con citometria a flusso rivela la dinamica dei cambiamenti fenotipici e funzionali di queste cellule durante le risposte immunitarie antitumorali.

Trapianto di tumore per valutare la dinamica delle cellule T CD8+ infiltranti il tumore nei topi

Viene descritto un protocollo standard per studiare l'attività antitumorale e la tossicità associata di IL-1α in un modello murino singeneico di HNSCC.

Valutazione dell'attività antitumorale in vivo di nanoparticelle di polianidride IL-1α

Questo protocollo delinea la generazione di topi del sistema immunitario umano (HIS) per studi immuno-oncologici. Le istruzioni e le considerazioni nell'uso di questo modello per testare immunoterapici umani su tumori umani impiantati in questo modello sono presentate con un'enfasi sulla caratterizzazione della risposta del sistema immunitario umano al tumore.

Test di immunoterapie del cancro in un modello murino umanizzato che porta tumori umani

Questo studio si concentra sull'induzione sottocutanea in vivo di cellule tumorali colorettali luminescenti in un modello murino e sulla successiva misurazione della luminescenza utilizzando un sistema di imaging. La procedura mira a stabilire un modello di crescita tumorale riproducibile per il monitoraggio in tempo reale e la valutazione terapeutica.

Iniezione sottocutanea di cellule tumorali del colon-retto umano in topi nudi atimici per valutare l'efficacia antitumorale

Con il crescente interesse per l'immunoterapia intratumorale, è essenziale selezionare modelli tumorali accessibili e pratici. I tumori sottocutanei sono facili da stabilire ma difficili da visualizzare e manipolare. In questo protocollo, descriviamo metodi per generare tumori intradermici che offrono una migliore visibilità e accessibilità.

Impianto di tumori intradermici come modello robusto per studi di immunoterapia intratumorale sul cancro delle murine

Scopri il metodo per arricchire e caratterizzare i microambienti immuni e non immuni in tumori murini sottocutanei. Questa tecnica consente il profiling simultaneo delle frazioni cellulari per studiare le risposte al trattamento.

Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

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