Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di fornire un metodo per la profilazione simultanea delle frazioni immunitarie e delle cellule tumorali che contribuiscono al microambiente immunitario dei tumori solidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'immuno-oncologia, come ad esempio quali cambiamenti seriali immunitari e non immunitari si verificano all'interno del tumore dopo un determinato trattamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita l'efficace arricchimento delle componenti immunitarie e non immunitarie del tumore, consentendo una profilazione completa dello stato immunologico del tumore.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di profilare in modo efficiente il microambiente immunitario tumorale e identificare i cambiamenti indotti dal trattamento. Dopo aver spruzzato il topo con etanolo al 70% per prevenire la contaminazione dei capelli, rimuovere chirurgicamente i tumori sottocutanei, facendo attenzione che i tumori siano privi di qualsiasi tessuto contaminante. Quindi, posizionare ciascun tumore in 1,8 millilitri di terreno base RPMI 1640 senza siero fetale bovino in pozzetti individuali di una piastra a 24 pozzetti su ghiaccio.

Quando tutti i tumori sono stati raccolti, utilizzare le forbici per tagliare i campioni in pezzi di meno di un millimetro cubo e aggiungere 200 microlitri di cocktail di dissociazione 10X appena preparato contenente collagenasi-1, collagenasi-4 e DNasi uno a ciascun pozzetto. Dopo un'ora a 37 gradi Celsius, in un agitatore orbitale a piastre da 60 a 100 giri/min, neutralizzare la reazione con un millilitro di terreno RPMI 1640 integrato con FBS al 5% e due EDTA millimolari e utilizzare una punta di pipetta modificata da un millilitro per trasferire ciascun campione di liquame tumorale in singole provette coniche da 50 millilitri sormontate da singoli filtri da 40 micrometri. Utilizzando uno stantuffo a siringa da 10 millilitri, disaggregare meccanicamente i pezzi di tumore attraverso i filtri, risciacquando periodicamente ciascun filtro con due millilitri di terreno RPMI 1640 più il 5% di FBS fino a quando i filtri non sono liberi dal tumore.

Quando tutti i tumori sono stati dissociati, aggiungere terreno a ciascuna provetta se necessario per portare tutti i campioni allo stesso volume e pellettare le cellule mediante centrifugazione. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per risospendere i pellet in due millilitri di terreno integrato con FBS per provetta. Per separare le frazioni di cellule immunitarie e tumorali, aggiungere tre millilitri di terreno di gradiente di densità sul fondo di una provetta conica da 15 millilitri per campione e sovrapporre lentamente due millilitri di sospensione di cellule tumorali lungo il lato di ciascuna provetta su ciascun gradiente.

Fare attenzione a garantire che le sospensioni di cellule tumorali siano ben miscelate prima della stratificazione, che le sospensioni cellulari vengano pipettate lentamente lungo il lato delle provette e che le provette siano maneggiate con cura per evitare che gli strati si mescolino. Separare le cellule mediante centrifugazione a gradiente di densità e raccogliere con cura il terreno superiore e gli strati di leucociti infiltranti il tumore in una nuova provetta da 15 millilitri per campione. Scartare il terreno di gradiente di densità rimanente e risospendere i pellet tumorali in due millilitri di terreno più FBS per provetta.

Quindi, centrifugare tutti i campioni e risospendere i leucociti infiltranti il tumore in 200 microlitri e le cellule tumorali in due millilitri di terreno più FBS per provetta su ghiaccio. Per piastrare, etichettare una piastra con fondo a U a 96 pozzetti per ciascun pannello di colorazione immunitaria più una piastra aggiuntiva per la conta delle cellule e aliquotare le sospensioni di singole cellule in ciascuna delle piastre del pannello di colorazione e nella piastra di calcolo. Lavare le cellule due volte con 200 microlitri di PBS di Dulbecco per campione e bloccare le cellule con 50 microlitri di blocco FC per pozzetto per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione bloccante, aggiungere 50 microlitri di anticorpo mirato extracellulare concentrato 2X e miscela di coloranti di vitalità fissabile a ciascun pozzetto per un'incubazione di 30 minuti al buio. Al termine dell'incubazione per colorazione, lavare i campioni due volte con tampone FACS e risospendere i pellet in 200 microlitri di soluzione di fissazione e permeabilizzazione per una notte a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce. Il giorno successivo, raccogliere le cellule mediante centrifugazione, seguita da un lavaggio con 200 microlitri di tampone di permeabilizzazione per pozzetto.

Etichettare le cellule con 100 microlitri di pannello di colorazione anticorpale intracellulare nel tampone di permeabilizzazione per un'incubazione di 30 minuti al buio, seguita da un altro lavaggio del tampone di permeabilizzazione. Quindi, lavare nuovamente le cellule con tampone FACS e risospendere i campioni in 300 microlitri di tampone FACS fresco per la loro analisi mediante citometria a flusso. La digestione del tumore, come dimostrato, con o senza arricchimento del mezzo di gradiente di densità, si traduce in una popolazione di cellule tumorali intere vitali di circa il 70-90%, valutata mediante citometria a flusso.

L'arricchimento del mezzo con gradiente di densità promuove un aumento di oltre due volte della frazione leucocitaria infiltrante il tumore CD45 positivo, rispetto alle digestioni tumorali non arricchite, nonché a numerosi sottogruppi di cellule immunitarie comunemente osservati negli studi sul microambiente immunitario. La frazione di cellule tumorali CD45 negative può anche essere profilata per numerose caratteristiche tumorali, come la vitalità o l'apoptosi tumorale complessiva, la capacità di proliferazione e l'espressione di vari marcatori immunosoppressivi. Per determinare come variano i sottogruppi immunologici mieloidi e linfocitari in un singolo tumore solido, il tumore può essere diviso in quattro parti uguali in modo tale che ogni sezione contenga regioni intratumorali approssimativamente uguali, nonché porzioni dermiche e peritoneali uguali.

Ogni pezzo può quindi essere digerito separatamente e analizzato, come dimostrato, per la presenza di varie popolazioni di cellule immunitarie. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro-8 ore, a seconda del numero di campioni che hai. Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavorare in modo rapido ma efficiente per preservare la vitalità cellulare.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di dissociazione e separazione coinvolgono tecniche difficili da apprendere con il solo testo scritto. Seguendo questa procedura, la citometria a flusso può essere eseguita per rispondere a ulteriori domande su come cambiano le popolazioni cellulari all'interno di un tumore, sia in termini di abbondanza che di fenotipo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come separare e analizzare sia le componenti immunitarie che quelle non immunitarie di un tumore murino sottocutaneo stabilito utilizzando le tecniche dimostrate di digestione e separazione in gradiente di densità.