Name: Soppressione della segnalazione Pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Scopri la riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti funzionali mediante sovraespressione di fattori di trascrizione e microRNA. Questo metodo raggiunge il 60% di efficienza e supporta la riparazione cardiaca.

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Questa ricerca è stata sostenuta dai fondi da programma della Fondazione Webb-Waring Boettcher Biomedical Research, American Heart Association scienziato Development Grant (13SDG17400031), Università del Colorado, dipartimento di medicina eccezionale carriera iniziale Programma di studioso, Università del Colorado divisione di cardiologia Barlow Nyle endowment e NIH R01HL133230 (di k. s). ASR è stata sostenuta da NIH/NCATS Colorado CTSA Grant numero TL1TR001081 e una borsa di studio pre-dottorato del Consorzio di Università del Colorado per fibrosi ricerca e traduzione (CFReT). Questa ricerca è stata sostenuta anche dal cancro centro supporto Grant (P30CA046934), la pelle malattie ricerca Core Grant (P30AR057212) e il nucleo di citometria a flusso presso l'Università del Colorado, Anschutz Medical Campus.

Tutti gli esperimenti che richiedono gli animali sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la UC Denver Anschutz Medical Campus e istituzionali Animal Care.
1. isolamento di MEFs
<ol><li>Acquistare C57BL/6 topi incinto a E13. Nave durante la notte.</li>
	<li>Eutanasia della madre secondo protocolli approvati IACUC (ex: ~1.3 L/min CO2 fino a quando l'animale appare morto seguita da dislocazione cervicale)</li>
	<li>Spruzzare la madre con etanolo al 70% e aprire la cavità addominale. Rimuovere il corno uterino contenenti embrioni e mettere in un piatto di 10 cm con PBS sterile.</li>
	<li>Praticare un'incisione nel sac di rilasciare embrione embrione. Trasferimento dell'embrione per pulire il piatto di 10 cm con PBS sterile. Sciacquare abbondantemente.</li>
	<li>Tagliare il corpo sotto il fegato e scartare la testa e la parte superiore del corpo. Rimuovere gli organi interni e scartare. Trasferire il tessuto restante ad un piatto pulito 10cm con PBS sterile e trasferire la piastra a un livello di biosicurezza 1 o 2 mobile. Combinare tessuti da tutti gli embrioni in un piatto pulito e asciutto 10cm e tritare in pezzi pregiati.</li>
	<li>Aggiungere 6 mL di 0,25% tripsina/1 mM EDTA agli embrioni macinati. Triturare più volte mediante pipetta per rompere il tessuto. Incubare per 40 min a 37 ˚ c con 5% CO2.</li>
	<li>Risospendere le cellule in coltura (tabella 1). Il volume dei media viene regolato in base al numero di embrioni raccolti. In generale, utilizzare un rapporto di media di sviluppo di circa 25 mL per 1,2 embrioni.</li>
	<li>Piastra 25 mL di sedimento cellule in un piatto di 15 cm. Dopo 24 h, aspirare i media e aggiungere 25 mL di terreno di coltura fresco a ogni piatto.</li>
	<li>Dopo 72 h, aggiungere 2 mL di 0,25% tripsina/1 mM EDTA ad ogni piatto di 15 cm. Quando le cellule si staccano dalla piastra di coltura, inattivare tripsina con 15 mL di terreno di crescita e raccogliere le cellule in provette coniche da 50 mL in polistirolo. Centrifugare le cellule per 3 min a 160 x g a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare in crescita media e filtro attraverso un colino di cella poro 70 µm.</li>
	<li>Contare le celle utilizzando un emocitometro e congelare MEFs in aliquote di 2 milioni di cellule nel mezzo di congelamento (10% DMSO, 25% FBS in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) / alto glucosio) a-80 ° C. Trasferire le cellule a azoto liquido dopo 24 h e negozio fino all'uso. Nota: Espressione genica globale in MEFs è stata profilata isolato usando questo protocollo mediante sequenziamento di RNA (RNA-seq) per garantire l'autenticazione delle cellule. RNA-seq dati dalle celle di codificare MEF sono stati scaricati da NIH Gene Expression Omnibus (GEO) con numero di accessione GSE93454. Dati di espressione genica di RNA-seq per MEFs da noi utilizzati sono stati depositati in NIH GEO con numero di accessione GSE71405. Questi due insiemi di dati sono state fuse secondo simboli comuni di gene. I dati di espressione quindi registro-sono stati trasformati ed un scatterplot dei dati di espressione per i nostri MEFs ed ENCODE MEFs erano generati e misura con una retta di regressione lineare (Figura 1A). MEFs isolati utilizzando questo protocollo sono molecolarmente simili a quelli isolati da altri laboratori.</li>
</ol>2. produzione di Retrovirus e trasduzione di MEFs
Nota: Tutti i passaggi in questa sezione devono essere effettuati in un armadio di 2 livello di biosicurezza. Poiché questo protocollo utilizza trasduzione retrovirale, garantire che la sicurezza Precauzioni tra cui trattare che tutti i rifiuti contenenti mezzi di comunicazione virale con candeggina al 10% per almeno 20 min. fare riferimento alla Figura 1B per un diario per la riprogrammazione.
<ol><li>
Produzione di Retrovirus utilizzando la linea cellulare Platinum E (PE)
	<ol>
<li>Mantenere commercialmente disponibile PE le cellule in PE medio (tabella 1) contenenti Consciousness con puromicina Selezione indicatori e per garantire l'espressione della gag-pol ed env geni per la produzione efficiente delle particelle retrovirali36 . Cellule del passaggio 1:4 o 1:5 ogni due giorni. Fare attenzione a evitare il sovraffollamento delle cellule in quanto questo può ridurre le rese di produzione retrovirali.</li>
		<li>Il giorno -1, circa 5 x 106 cellule per ogni piatto di 10 cm nel terreno di crescita (tabella 1), h 16-20 di semi prima della trasfezione (Vedi tabella 2 per la placcatura di densità per altri formati di cella standard cultura piatto). Scuotere delicatamente piatti avanti e indietro diverse volte e posizionare con cura in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore per garantire anche la distribuzione di placcatura (per densità di placcatura ottimale prima della trasfezione, vedere Figura 1 ). Nota: fare attenzione alle cellule di PE piatto nel mezzo libero di marcatori di selezione prima di transfezione per garantire supporto contenente particelle retrovirali generate non uccide MEFs.</li>
		<li>Il giorno 0, preparare il DNA per la transfezione. Per la transfezione di piatto di 10 cm, aggiungere 2 µ g di ogni fattore di riprogrammazione — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) — in una provetta da 1,5 mL. Nota: Fare riferimento alla tabella 2 per scalare la quantità di DNA necessaria a transfect altre dimensioni piatto cultura standard.</li>
		<li>In un tubo separato da 1,5 mL, aggiungere 360 µ l siero riduttore media. Quindi aggiungere 36 µ l di reagente di transfezione direttamente ai media di siero ridotto. Delicatamente flick il tubo e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Nota: Per evitare di transfezione ridotta efficienza, attentamente aggiungere Reagente di transfezione direttamente ai media riduttori del siero.</li>
		<li>Aggiungere siero riduttore media/transfezione reagente misto al DNA GHMT2m cocktail. Delicatamente flick il tubo e incubare a temperatura ambiente per 15 min. Non centrifugare.</li>
		<li>Aggiungere goccia a goccia la miscela di reazione alle celle di PE, delicatamente turbinio media per 10-15 s e posto in un 37 ° C, 5% CO2 incubator. Nota: Secondo il produttore, PE le cellule generano un titolo medio di 106 107 infettive unità/ml. Questo protocollo genera circa6 infezioni unità/mL da 24 h a 2 x 10 e 6 x 106 infezioni unità/mL di 48 h per una media MOI di 4. Transfezione di GFP/DsRed può essere utilizzata anche come un surrogato per efficienza di trasfezione/trasduzione se lo si desidera; efficienza di trasfezione dovrebbe superare il 90% di 48 h (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trasduzione di MEFs
	<ol>
<li>Il giorno 0, cappotto piatti a base di collagene e posto in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore per almeno 2 h.</li>
		<li>Rimuovere MEFs dal disgelo e azoto liquido. Cellule di piastra 0.2 x 106 per ogni piatto di 60 mm nel mezzo di crescita. Delicatamente piastre di roccia per garantire anche la distribuzione di placcatura e collocare nell'incubatrice (Vedi Figura 1 per densità di placcatura ottimale e la tabella 2 per la placcatura di densità per altri formati di cella standard cultura piatto). Nota: Queste densità di placcatura sono state testate su più batch di isolato MEFs; a meno che MEFs display significativamente compromessa redditività, non è necessario regolare la densità di semina cellulare.</li>
		<li>Il giorno 1, post-trasfezione 24 h, è necessario utilizzare una siringa da 30 mL per raccogliere retrovirale medio generato dalle cellule di PE. Passare il mezzo attraverso un filtro di dimensioni dei pori 0,45 µm in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere il reagente di transfezione di bromuro di hexadimethrine ad una concentrazione finale di 6 µ g/mL. Con attenzione aggiungere 10 mL di terreno di crescita fresco alle celle di PE da pipettaggio media sulla parete della piastra di coltura per impedire lo spostamento delle cellule.</li>
		<li>Aspirare il mezzo da MEFs e aggiungere 4 mL di terreno retrovirale appena raccolte ad ogni piatto. Ritorno MEFs nell'incubatore. Aggiungere candeggina al 10% a tutti i materiali a contatto con il fluido virale per neutralizzare le particelle retrovirali.</li>
		<li>Il giorno 2, post-trasfezione 48h, ripetere i passaggi da 2.2.2 e 2.2.3. Le cellule PE vengono scartate dopo la raccolta di 2nd del mezzo retrovirale. Nota: Aggiungere candeggina al 10% alle scartati PE celle per almeno 20 min neutralizzare i retrovirus indesiderati.</li>
		<li>Il giorno 3, aspirare medio da MEFs e ricostituire con 4 mL di terreno di iCM (tabella 1) contenente 0,5 µM A-83-01, un TGF-β tipo inibitore del recettore. Ricostituire il supporto di iCM che contiene A-83-01 ogni 2 giorni. Nota: Se usando GFP come un controllo di trasduzione, l'espressione è previsto per superare il 90% da questo punto di tempo (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. flusso Cytometry per marcatori cardiaci
<ol><li>Mezzo di aspirato da giorno 9 riprogrammato MEFs e lavaggio (1x) con PBS 1X per rimuovere i detriti e le cellule morte.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL 0,25% tripsina/EDTA per 5 min a 37 ˚ c. Verifica celle utilizzando un microscopio chiaro e agitare piatto; Se le cellule rimangono attaccate, incubi più 5 min a 37 ° c fino a staccano le cellule.</li>
	<li>Lavare le cellule in 1X PBS contenente 5% di FBS e filtro attraverso un colino di cella poro 70 µm.</li>
	<li>Centrifugare a 160 x g per 3 min a temperatura ambiente e liquido aspirato dal pellet. Nota: Per aumentare il rendimento delle celle, lasciare liquido circa 50 µ l sopra il pellet cellulare.</li>
	<li>Lavare le cellule con 500 µ l 1X PBS contenente BSA 1%.</li>
	<li>Difficoltà cellule con 0,2 mL 1 milione cellule soluzione di fissaggio per 20 min sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio/perm ghiacciata di 1x. Nota: La soluzione del produttore è 10x.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 160 x g per 5 min a 4 ° C e aspirare il surnatante.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.7 e 3.8 un tempo supplementare. Dopo il lavaggio 2nd , procedere direttamente al passo successivo o mantenere le cellule a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Bloccare con 100 µ l di siero di capra del 5% e siero di asino in perm/lavaggio 1X per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di anticorpo primario diluito. Nota: Per questo protocollo, le celle sono state etichettate con mouse troponina T (1: 200) e del mouse α-actinina (1: 200) per quantificare la percentuale di cellule positive per componenti chiave del sarcomero cardiaco. Incubare anticorpo primario per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 160 x g per 5 m a 4 ° C, aspirare il surnatante e lavare 2x con tampone di lavaggio/Perm ' ghiacciata.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di anticorpo secondario diluito. Nota: Per questo protocollo, le celle sono state etichettate con anti-topo 647 nm secondaria dell'anticorpo (1: 200). Incubare anticorpo secondario per 45 min a temperatura ambiente su un rotatore di over-fine tubo. Proteggere le cellule dalla luce avvolgendo i tubi in un foglio.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 160 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il surnatante e lavare 2x con tampone di lavaggio/Perm ' ghiacciata.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di 1% BSA in PBS ed eseguire FACS immediatamente. Nota: Generare un grafico a dispersione di forward scatter vs lato al cancello prima cellule vitali durante l'esecuzione di FACS. In alternativa, utilizzare una macchia delle cellule vive/morte commercialmente disponibile prima della posa di cellule per identificare dal vivo e morto popolazioni cellulari.</li>
</ol>4. Immunostaining del MEFs riprogrammate
<ol><li>Mezzo di aspirato da giorno 14 riprogrammato MEFs e lavaggio (1x) con 1 mL 1 x PBS ghiacciata. Nota: Per l'immunocolorazione, riprogrammazione è stato effettuato in 12 piastre a pozzetti per ridurre al minimo i volumi di soluzione di anticorpo. 24 piatti ben possono anche essere utilizzati; semplicemente metà tutto seguendo i volumi.</li>
	<li>Aspirare e fissare le cellule con 500 µ l 2% paraformaldeide per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare e lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS + 1X (5 min a lavaggio a temperatura ambiente).</li>
	<li>Permeabilize le cellule con 500 µ l 0,2% permeabilizzazione reagente in PBS per 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare e bloccare in 500 µ l 10% di siero equino in PBS per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare e incubare con 500 µ l di anticorpo primario diluito per 1 h a temperatura ambiente. Nota: Per questo protocollo, le cellule erano etichettate con mouse troponina T o α-actinina (ogni 1: 400) e co-etichettate con Connexin 43 (1: 400) o della troponina I (1: 400).</li>
	<li>Anticorpo primario di aspirare e lavare tre volte con 1 mL di PBS + 1X (5 min a lavaggio a temperatura ambiente).</li>
	<li>Aspirare e incubare con anticorpo secondario diluito di 500 µ l per 1 ora a temperatura ambiente. Nota: Per questo protocollo, le celle sono state etichettate con anticorpo anti-topo 555 nm secondario (1: 800) riconoscere troponina T o α-actinina e anti-coniglio 488 nm anticorpo secondario (1: 800) riconoscere Connexin 43 o troponina I. Inoltre, i nuclei sono stati macchiati con Hoechst (01:10, 000). Proteggere le cellule dalla luce incubando nel buio.</li>
	<li>L'anticorpo secondario di aspirare e lavare tre volte con 1 mL di PBS + 1X (5 min a lavaggio a temperatura ambiente). Avvolgere la piastra in un foglio per proteggere le cellule dalla luce e conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Immagine utilizzando tre canali epifluorescenza.</li>
</ol>5. il calcio Imaging
Nota: Se imaging presso ingrandimento 10x, piastre e piastre di coltura cellulare standard sono adatti per l'imaging del calcio. La formazione immagine a maggiore ingrandimento richiede che le cellule piastrate su vetrini coprioggetti o piatti di vetro inferiore.
<ol><li>Medio di aspirare e aggiungere 2 mL (per un 6 piastra bene) per volta soluzione di Tyrode (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1mm MgCl2, glucosio di 10 mM, 10 mM HEPES, BSA 0.1% e 1% piruvato, a pH 7,4) contenente 5 µM Fura-2 AM e 0,1% Pluronic F-127 a battere (D14 t iCMs o D20). Incubare per 30 minuti a 37 ° C. Nota: Proteggono le cellule dalla luce per evitare l'estinzione dell'indicatore fluorescente.</li>
	<li>Lavare le cellule in soluzione di Tyrode 2ml per 30 min a temperatura ambiente per permettere de-esterificazione del Fura-2 AM.</li>
	<li>Immagine con filatura la microscopia confocale disco a 340 nm e 380 nm utilizzando Slidebook 5.5 Ca2 + software di imaging. Eseguire l'imaging a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transitori di calcio sono calcolati utilizzando il rapporto di intensità di fluorescenza a 340 nm sopra l'intensità di fluorescenza a 380 nm.</li>
	<li>Se lo si desidera, trattare iCMs con isoproterenolo µM 1 o 2 o 10 µM nifedipina per manipolare dopo formazione immagine transitori di calcio della linea di base di calcio. Aggiungere composti localmente alle cellule ed immagine.</li>
</ol>

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<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485, 593-598 (2012).</li>
<li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+reprogramming+to+transdifferentiate+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+adenoviral+vectors%3A+Implications+for+clinical+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il presente studio delinea una strategia ad alto rendimento per riprogrammare direttamente fibroblasti in iCMs funzionale tramite consegna di GHMT2m riprogrammazione fattori combinati con soppressione delle vie di segnalazione pro-fibrotici. Mediante citometria a flusso, imaging immunofluorescenti, calcio imaging e battendo i conteggi delle cellule, mostriamo la maggior parte delle cellule in questo protocollo subiscono successo riprogrammazione e adottare il destino del lignaggio di CM. Precedentemente abbiamo indicato ...

Cardiopatia ischemica è una causa principale di morte negli Stati Uniti1. Circa 800.000 americani esperienza un primo o ricorrente infarto miocardico (MI) per ogni anno1. In seguito MI, la morte dei cardiomiociti (CMs) e fibrosi cardiaca, depositati dai fibroblasti cardiaci attivati, compromettere cuore funzione2,3. Progressione dell'insufficienza cardiaca dopo MI è in gran parte irreversibile a causa la scarsa capacità rigenerativa di adulto CMs4,5. Mentre le terapie cliniche correnti rallentano la progressione di malattia e fare diminuire il rischio di eventi cardiaci futuri6,7,8,9, terapie non invertire la progressione della malattia dovuto l'incapacità di rigenerare il CMs post-infarto10. Terapie cellulari romanzo stanno emergendo per trattare pazienti che seguono MI. sembrto, sperimentazioni cliniche fornire cellule staminali nel cuore seguito finora MI hanno dimostrato inconcludente rigenerativa potenziali11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
La generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umano-derivato (hiPSCs) dai fibroblasti da sovraespressione di quattro fattori di trascrizione, in primo luogo ha dimostrato di Takahashi & Yamanaka, ha aperto la porta a nuovi progressi nella cella terapia19. Queste cellule possono differenziarsi in tutti i tre strati germinativi19, e diversi metodi altamente efficienti per la generazione di un numero elevato di CMs sono stati indicati in precedenza20,21. CMs HiPSC-derivato (fianchi-CMs) offre una potente piattaforma per lo studio cardiomiogenesi e può avere implicazioni importanti per la riparazione del cuore dopo la lesione. Tuttavia, fianchi-CMs attualmente affrontare ostacoli traslazionali dovuto le preoccupazioni di teratoma formazione22, e loro natura immaturo può essere pro-aritmogenica23. Riprogrammazione di fibroblasti in hiPSCs ha suscitato interesse direttamente riprogrammazione fibroblasti in altri tipi cellulari. Ieda et al hanno dimostrato che la sovraespressione di GATA4, Mef2c e Tbx5 (GMT) nei risultati di fibroblasti in riprogrammazione diretta per linea cardiaca, anche se a bassa efficienza24. Riprogrammazione di efficienza è stata migliorata con l'aggiunta di Hand2 (GHMT)25. Da questi primi studi, molte pubblicazioni hanno dimostrato che alterando il cocktail fattore riprogrammazione con trascrizione ulteriori fattori26,27,28,29, cromatina modificatori30,31, microRNA32,33o piccole molecole34 conduce ad una migliore riprogrammazione efficienza e/o maturazione indotta del cardiomyocyte-come delle cellule (iCMs ).
Qui forniamo un protocollo dettagliato per generare iCMs da fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) con alta efficienza. Precedentemente abbiamo indicato che il GHMT cocktail è notevolmente migliorata con l'aggiunta di miR-1 e miR-133 (GHMT2m) ed è stata ulteriormente migliorata quando vie tra cui trasformando la segnalazione di fattore di crescita β (TGF-β) di segnalazione pro-fibrotici o Rho-associati vie di segnalazione della proteina chinasi (ROCK) sono inibiti35. Usando questo protocollo, ci mostrano che circa il 60% delle cellule express cardiaco troponina T (cTnT), circa il 50% express α-actinina, e un elevato numero di celle di battitura può essere osservato più presto il giorno 11 dopo trasduzione di riprogrammazione fattori e trattamento con il TGF-β tipo inibitore del recettore A-83-01. Inoltre, questi iCMs esprimono proteine di giunzione divario tra cui connexin 43 ed esibiscono contrazione spontanea e transitori di calcio. Questo netto miglioramento nella riprogrammazione efficienza rispetto agli studi precedenti dimostra il potenziale per rigenerare CMs da popolazioni di cellule endogene che rimangono post-nell'infarto cuore.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 Topi</td> Charles <td>River's Laboratory</td><td>027</td><td>Per l'isolamento MEF</td></tr><tr><td>Cellule di platino E (PE) Cell</td><td>Biolabs, INC</td><td>RV-101</td><td>Per la produzione di retrovirus</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Gibco</td><td>SH30022. Componente FS</td><td>di iCM, PE e terreni di crescita</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>Componente di iCM media</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td>Componente di iCM, PE e terreni di crescita</td></tr><tr><td>Siero di cavallo donatore</td><td>Gemini</td><td>100508 500</td><td>Componente di iCM media</td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi essenziali, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>11130051</td><td>Componente di iCM Soluzione</td></tr><tr>di<td>piruvato di sodio, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td>Componente dei terreni iCM e per l'imaging del calcio</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali MEM, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>Componente dei terreni iCM</td></tr><tr><td>Soluzione vitaminica MEM, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11120-052</td><td>Componente dei terreni iCM</td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>Componente del terreno iCM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Componente del terreno iCM</td></tr><tr><td>Penicilina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Componente di iCM, PE e terreni di crescita</td></tr><tr><td>GlutaMAX (integratore di L-glutammina)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Componente di iCM, PE e terreni di crescita</td></tr><tr><td>Blasticidina-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td>Componente dei terreni PE</td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td> Life <td>Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Componente del terreno PE</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Per il distacco di cellule da piastre di coltura</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R& Sistemi D - Tocris</td><td>2939/10</td><td>Trattare le cellule per inibire la segnalazione TGF-&beta - promuove la riprogrammazione ad alta efficienza. Utilizzare a 0,5 & micro; M</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>85190</td><td>Per la diluizione e la conservazione di A-83-01 e del componente del mezzo di congelamento</td></tr><tr><td>SureCoat</td><td>Cellutron</td><td>SC-9035</td><td>Per il rivestimento di piatti su piastre MEF FuGENE</td></tr><tr><td>6 Reagente di trasfezione</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Opti-MEM Terreni di siero ridotto</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>Reagente</td></tr> <tr><td>di trasfezionepBabe-X Myc-GATA4</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenente fattore di riprogrammazione</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Hand2</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenente fattore di riprogrammazione</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Mef2c</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenente fattore di riprogrammazione</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Tbx5</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenente fattore di riprogrammazione</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-1</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenente fattore di riprogrammazione</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-133</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenente fattore di riprogrammazione</td></tr><tr><td>pBabe-X GFP</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenente fattore di riprogrammazione</td></tr><tr><td>Polibrene (bromuro di esadimetrina)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td>Per l'induzione virale. Utilizzare ad una concentrazione di 6 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Filtro sottovuoto + flaconi (0,22 & micro; m pori)</td><td>Nalgene</td><td>&nbsp; 569-0020&nbsp;</td><td>Per i mezzi filtranti</td></tr><tr><td>Siringhe</td><td>Bd Vacutainer Labware&nbsp;</td><td>309654</td><td>Per filtrazione virale</td></tr><tr><td>0,45 &; micro; m Filtri</td><td>Celltreat</td><td>229749</td><td>Per filtrazione virale</td></tr><tr><td>70 &; micro; filtri per cellule m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Per l'isolamento MEF e la citometria a flusso</td></tr><tr><td>Soluzione Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554722</td><td>Per la fissazione e la permeabilizzazione delle cellule per la citometria a flusso</td></tr><tr><td>perm/tampone di lavaggio&nbsp;</td><td>BD</td><td>554723</td><td>Per il lavaggio delle cellule per la citometria a flusso</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td>Per il lavaggio delle cellule</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>VWR</td><td>0332-100g</td><td>Per la citometria a flusso e l'imaging del calcio</td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Per il blocco delle cellule per la citometria a flusso</td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Sigma</td><td>D9663-10mg</td><td>Per il blocco delle cellule per la citometria a flusso</td></tr><tr><td>Troponina T di topo Thermo</td><td>Scientific</td><td>ms-295-p</td><td>1:400 IF, 1:200 Citometria a flusso</td></tr><tr><td>di topo &alfa;-actinina</td><td>Sigma</td><td>A7811L</td><td>1:400 IF, 1:200 Citometria</td></tr><tr><td>a flusso Coniglio Connexin 43</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6219</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Troponina di coniglio I</td><td>PhosphoSolutions</td><td>2010-TNI</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td>1:10000 IF</td></tr><tr><td>Alexa 488, coniglio</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 555, mouse</td><td>Life Technologies</td><td>A-21422</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 647, mouse</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td>Citometro a flusso 1:200 Citometro</td></tr><tr><td>a flusso ZE5 a 27 colori&nbsp;</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>per FACS</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>sigma</td><td>P6148-500mg</td><td>Per il fissaggio di cellule per IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td>Per la permeabilizzazione di cellule per IF</td></tr><tr><td>EVOS&commercio; Sistema di imaging a colori FL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEFC4300</td><td>per IF</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020-5000</td><td>Per imaging del calcio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>395</td><td>Per imaging del calcio</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td>Per imaging del calcio</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>VWR</td><td>97061-352</td><td>Per imaging</td></tr> <tr>del calcio<td>glucosio</td><td>sigma</td><td>G7528-250g</td><td>Per imaging del calcio</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>sigma</td><td>H4034-500g</td><td>Per imaging del calcio</td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Per imaging del calcio</td></tr><tr><td>Fluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250g</td><td>Per l'imaging del calcio</td></tr><tr><td>Nifedipina</td><td>Sigma</td><td>N7634-1G</td><td>Per l'interruzione dei transitori del calcio negli iCM - utilizzare a 10 & micro; M</td></tr><tr><td>Isoproterenolo</td><td>sigma</td><td>I6504-1g</td><td>Per aumentare il numero di transitori di calcio nelle iCM - utilizzare a 1-2 &micro; M</td></tr><tr><td>Marianas Spinning Disk Microscopio confocale</td><td>3i</td><td>Per l'imaging del calcio</td>etanolo <td></td></tr><tr><td></td><td>Decon Laboratories</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>candeggina</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL provette coniche</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr> 227261 <tr><td>15 mL provette coniche</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr> 188271 <tr><td>piastre per colture cellulari da 15 cm</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>piastre per colture cellulari da 10 cm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>piastre per colture cellulari da 60 mm</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>piastre per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura cellulare a 12 pozzetti</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>665180&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura cellulare a 24 pozzetti</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>662160&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

soppressione della segnalazione pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Trans-differenziazione di cellule somatiche un tipo in un altro ha un enorme potenziale per modellare e trattare malattie umane. Studi precedenti hanno dimostrato che il mouse embrionali, fibroblasti cutanei e cardiaci possono essere riprogrammati in funzionale indotta-cardiomyocyte-come le cellule (iCMs) tramite sovraespressione di fattori di trascrizione cardiogeno compreso GATA4, Hand2, Mef2c, e TBX5 sia in vitro che in vivo. Tuttavia, questi studi precedenti hanno dimostrato relativamente bassa efficienza. Al fine di ripristinare la funzione del cuore dopo la lesione, meccanismi che governano la riprogrammazione cardiaco devono essere delucidate per aumentare l'efficienza e la maturazione degli iCMs.
Precedentemente abbiamo dimostrato che l'inibizione di segnalazione pro-fibrotici drammaticamente aumenta l'efficienza di riprogrammazione. Qui, abbiamo dettaglio metodi a raggiungere un'efficienza riprogramma fino al 60%. Inoltre, si descrivono diversi metodi tra cui citometria a flusso, formazione immagine immunofluorescente e calcio imaging per quantificare la riprogrammazione l'efficienza e la maturazione dei fibroblasti riprogrammati. Utilizzando il protocollo dettagliato qui, studi meccanicistici possono essere intrapreso per determinare regolatori positivi e negativi della riprogrammazione cardiaco. Questi studi possono identificare vie di segnalazione che possono essere mirate per promuovere l'efficienza riprogrammante e maturazione, che potrebbe portare a cell novel terapie per trattare la malattia di cuore umana.

Utilizzando la riprogrammazione strategia delineata sopra e in Figura 1B, abbiamo generato iCMs con circa 70% delle cellule che esprimono cardiaco troponina T e circa il 55% delle cellule che esprimono cardiaco α-actinina, quantificato tramite flusso cytometry al giorno 9 seguito di trasduzione di GHMT2m (Figura 2A e B). Inoltre, la maggior parte delle cellule esprime troponina cardiaca T, troponina I e cardiaca ...

Qui presentiamo un metodo affidabile per riprogrammare i fibroblasti embrionali primari in cardiomiociti funzionali tramite sovraespressione di GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) al fianco di inibizione di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo genera pestaggio cardiomyocytes fin dal post-traduzionali di 7 giorni con fino a 60% efficienza.

Soppressione della segnalazione Pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riprogrammazione cardiaca, come l'identificazione di quali percorsi promuovono o riparano la cardio-miogenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo generare cardiomiociti indotti funzionali, con un'efficienza maggiore rispetto ai metodi precedentemente pubblicati. Queste cardiopatie chimiche provocano la perdita di cardiomiociti e una compromissione della funzione cardiaca.Pertanto, questa tecnica può aiutare in un'elevata riparazione, convertendo i fibroblasti in cardiomiociti indotti funzionali. Per iniziare la produzione di retrovirus, coltivare cellule di platino E o PE in terreno PE. Completalo con i pennarelli di selezione in una capsula da 10 cm, in un armadio di livello due di biosicurezza.Ogni due giorni le celle passano da una a quattro, o da una a una a quinta diluizione. Un giorno prima della trasfezione pianificata, seminare le cellule PE in 10 ml di terreno di coltura, in una piastra di coltura da 10 cm, quindi far oscillare delicatamente le piastre avanti e indietro. Posizionare con cura le piastre in un'incubatrice, per consentire una distribuzione uniforme delle cellule, e i

suppression-pro-fibrotic-signaling-potentiates-factor-mediated

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Descriviamo l'uso di un test delle cellule del mouse ES base per identificare le finestre momento critico per Wnt / β-catenina e il segnale di attivazione BMP durante l'induzione cardiogeno. Il metodo fornisce una piattaforma standardizzata che quantifica l'efficienza cardiogeno affidabile, ed è applicabile allo studio di altre linee cellulari.

Modificato il mouse sulle cellule staminali Saggio base per quantificare l&#39;efficienza di induzione cardiogeno

Descriviamo qui un protocollo per la generazione di iCM utilizzando la somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Tbx5 e Mef2c in un costrutto policistico. Questo protocollo produce una popolazione relativamente omogenea di cellule riprogrammate con una migliore efficienza e qualità ed è prezioso per studi futuri sulla riprogrammazione di iCM.

Migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico Esprimendo rapporto ottimale di Gata4, MEF2C e Tbx5

Qui viene mostrato un metodo per visualizzare l'ultrastruttura della matrice extracellulare in tessuti cardiaci decellularizzati.

Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

Questo protocollo descrive un metodo passo-passo per l'isolamento riproducibile e la coltura a lungo termine di cardiomiociti di topo adulto con alta resa, purezza e vitalità.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo attraverso la sovraespressione di un insieme minimo di fattori di trascrizione. Questa tecnologia può essere tradotta nel sistema umano per fornire piattaforme per studi futuri sull'emopoiesi, la malattia ematologica e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

Presentiamo tre protocolli nuovi e più efficienti per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce e un metodo di consegna che migliora l'attecchimento delle cellule trapiantate, combinando l'iniezione di cellule con la consegna citochine patch-mediata.

Pluripotenti cellule staminali derivate cellule cardiache per la riparazione del miocardio

Questo manoscritto descrive un protocollo passo-passo per la generazione e la quantificazione di diversi sottotipi cardiaci riprogrammati utilizzando una somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

In questo protocollo, dimostriamo ed elaboriamo su come utilizzare cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per la differenziazione e la purificazione cardiomiocitati, e ulteriormente, su come migliorare la sua efficienza di trapianto con inibitore della chinasi proteica associata a Rho pretrattamento in un modello di infarzione miocardico del topo.

Migliorare l'innesto dei Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo attraverso un'inibizione transitoria dell'attività di Rho Kinase

Descriviamo qui, l'istituzione e l'applicazione di una linea di reporter del mouse Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (indicata come αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito) per la valutazione della riprogrammazione cardiaca. I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) isolati dal ceppo murino vengono convertiti in cardiomiociti indotti (iCM), consentendo una valutazione comoda ed efficiente dell'efficienza di riprogrammazione e della maturazione funzionale...

Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

Qui descriviamo una procedura basata sull'uso di particelle lentivirali per la modificazione genetica a lungo termine delle cellule staminali neurali e/o delle loro cellule ependimali adiacenti nella nicchia neurogenica ventricolare-subventricolare adulta che consente l'analisi separata degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali.

Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l&#39;analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

Scopri la riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti funzionali mediante sovraespressione di fattori di trascrizione e microRNA. Questo metodo raggiunge il 60% di efficienza e supporta la riparazione cardiaca.

Soppressione della segnalazione Pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti (Video) | JoVE Journal

Soppressione della segnalazione Pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti

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