Soppressione della segnalazione Pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riprogrammazione cardiaca, come l'identificazione di quali percorsi promuovono o riparano la cardio-miogenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo generare cardiomiociti indotti funzionali, con un'efficienza maggiore rispetto ai metodi precedentemente pubblicati. Queste cardiopatie chimiche provocano la perdita di cardiomiociti e una compromissione della funzione cardiaca.

Pertanto, questa tecnica può aiutare in un'elevata riparazione, convertendo i fibroblasti in cardiomiociti indotti funzionali. Per iniziare la produzione di retrovirus, coltivare cellule di platino E o PE in terreno PE. Completalo con i pennarelli di selezione in una capsula da 10 cm, in un armadio di livello due di biosicurezza.

Ogni due giorni le celle passano da una a quattro, o da una a una a quinta diluizione. Un giorno prima della trasfezione pianificata, seminare le cellule PE in 10 ml di terreno di coltura, in una piastra di coltura da 10 cm, quindi far oscillare delicatamente le piastre avanti e indietro. Posizionare con cura le piastre in un'incubatrice, per consentire una distribuzione uniforme delle cellule, e incubare per 24 ore.

Il giorno della trasfezione, aggiungere il cocktail GHMT2M in un tubo da 1,5 ml. Quindi aggiungere 360 microlitri di siero ridotto in un tubo separato da 1,5 ML. Successivamente, aggiungere 36 microlitri di reagente di trasfezione al terreno di siero, ridotto e agitare delicatamente il tubo per mescolare.

Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Il reagente di trasfezione utilizzato in questa fase si lega alla plastica. Per evitare l'efficienza della trasfezione, fare attenzione a pipettare il reagente di trasfezione direttamente nel terreno di coltura sierologico ridotto ed evitare di toccare la punta della pipetta con la parete del tubo.

Quindi aggiungere la miscela di reagenti di trasfezione del terreno di siero ridotto alla provetta, contenente il cocktail di DNA GHMT2M. Agitare delicatamente la provetta per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Infine, aggiungere la miscela di reazione di trasfezione, goccia a goccia, alle cellule PE.

Agitare delicatamente il piatto per 10-15 secondi. Incubare le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius, per 16-20 ore. Ora rivestire i piatti da 60 mm con collagene e incubare a 37 gradi Celsius, per un minimo di due ore.

Quindi erogare fibroblasti embrionali di topo appena scongelati, o MEF, nei piatti rivestiti di collagene. E aggiungi il terreno di crescita in un volume finale, di 4 ml per piatto da 60 mm. Scuoti delicatamente i piatti e mettili nell'incubatrice.

Quando si placcano i MEF, è importante che le celle siano placcate in modo uniforme. Evitare di far roteare i piatti, questo può causare una placcatura irregolare. Invece, fai oscillare delicatamente il piatto avanti e indietro e posizionalo con cura nell'incubatrice.

24 ore dopo la trasfezione delle cellule PE, utilizzare una siringa da 30 ml per raccogliere il terreno retrovirale generato dalle cellule. Passare la prima raccolta di terreno retrovirale attraverso un filtro da 45 micrometri, in una provetta conica da 50 ML. Quindi aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco sulla parete del piatto, facendo attenzione a non spostare le cellule PE.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per altre 24 ore. Quindi aggiungere 7,2 microlitri di 10 mg per millilitro di reagente di trasduzione del bromuro di metrina di esadina al tubo conico da 50 ml contenente il surnatante virale. Ora aspirare il terreno dai MEF e aggiungere 4 ml del terreno retrovirale appena raccolto al piatto.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore. 48 ore dopo la trasfezione delle cellule PE, raccogliere il terreno retrovirale ed eseguire la trasduzione esattamente allo stesso modo, come per la prima raccolta. Scartare le cellule PE dopo la seconda raccolta del terreno retrovirale e aggiungere il 10% di candeggina a tutti i materiali a contatto con il terreno retrovirale.

Dopo l'incubazione, aspirare il terreno retrovirale dai MEF e aggiungere 4 ml di terreno ICM, contenente 05 micromolare, inibitore del recettore TGF Beta di tipo 1. Ogni due giorni cambiare il mezzo ICM, fino a nuovo utilizzo. Per iniziare l'immunocolorazione, aspirare il terreno ICM dai MEF riprogrammati al giorno 14.

Quindi lavare le cellule una volta con 1 ml di PBS ghiacciato 1X, per pozzetto della piastra a 12 pozzetti. Quindi, aspirare il PBS, aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide al 2% per fissare le cellule e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aspirato la paraformaldeide, lavare le cellule tre volte con 1ML di PBS.

Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere 500 microlitri di Triton X 100 allo 02% e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'aspirazione di Triton X 100, bloccare le cellule con 500 microlitri di siero di cavallo al 10%, per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, aspirare il siero di cavallo e aggiungere 500 microlitri di anticorpo primario diluito. Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver aspirato l'anticorpo primario, lavare tre volte con 1 ml di PBS.

Dopo l'ultimo lavaggio di PBS, aggiungere 500 microlitri di anticorpo secondario diluito. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e incubare al buio, per un'ora a temperatura ambiente. Infine, aspirare l'anticorpo secondario e lavare tre volte con 1 ml di PBS.

Avvolgere la lastra in un foglio di alluminio e conservarla a quattro gradi Celsius fino al termine dell'imaging. Questo metodo mostra un'elevata efficienza di conversione dei MEF in cardiomiociti. Un'analisi rappresentativa di citometria a flusso, aggiunta al nono giorno dopo la trasduzione, mostra l'attivazione dell'espressione di troponina T cardiaca, in circa il 70% delle cellule.

Allo stesso modo, l'espressione cardiaca di alfa-actinina è osservata in circa il 55% delle cellule, rispetto al controllo della trasduzione GFP. Inoltre, l'immuno-colorazione per i marcatori cardiaci, eseguita due settimane dopo la trasduzione, mostra che la maggior parte delle cellule esprime troponina I, alfa-actinina e troponina T. La proteina di giunzione gap Cx43 è stata rilevata anche lungo la periferia degli ICM. Inoltre, la co-marcatura di ICM con alfa-actinina, o troponina T e Cx43, rivela la formazione di giunzioni gap tra cellule vicine.

La trasduzione di GHMT2M e il trattamento con A83O1 riprogrammano una frazione di MEF in cellule battitrici entro l'ottavo giorno. Il giorno 11 si osservano circa 10000 cellule battitrici per centimetro quadrato. I transitori spontanei del calcio sono rilevati nei cardiomiociti battitori.

L'aggiunta dell'agonista beta adrenergico isoproterenolo, aumenta significativamente la frequenza dei transitori spontanei del calcio. Al contrario, la sedizione del calcio-antagonista di tipo L nifedipina riduce significativamente la frequenza dei transitori del calcio. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come riprogrammare i fibroblasti, in cardiomiociti funzionali e indotti con alta efficienza.

Seguendo questo protocollo, altri metodi, tra cui il sequenziamento dell'RNA e il sequenziamento dei chip, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come l'espressione genica globale e lo stato della cromatina, che vengono alterati durante la riprogrammazione cardiaca. Non dimenticare che lavorare con il retrovirus può essere pericoloso. Durante l'esecuzione di questo protocollo, devono essere sempre implementate precauzioni, come lavorare in un armadio di livello di biosicurezza di livello due, indossare dispositivi di protezione individuale e smaltire correttamente tutti i rifiuti retrovirali.