Ottimizzato Scratch test per test In Vitro della migrazione cellulare con una fotocamera ottica automatizzata
8 agosto 2018
Qui descriviamo una procedura per verificare la migrazione cellule in vitro con un microscopio ottico automatizzato fotocamera. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato ampiamente usato dove la chiusura del graffio è seguita per un periodo determinato. Il microscopio ottico consente un rilevamento affidabile e a buon mercato della migrazione cellulare.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile osservare le cellule in tempo reale con il microscopio ottico automatico. Le implicazioni di questo trattamento si estendono a una terapia delle ferite croniche o del cancro in cui la migrazione gioca un ruolo cruciale in queste malattie. Iniziare lavando due volte una coltura confluente di cellule HaCaT con cinque millilitri di PBS sterile privo di magnesio e calcio per lavaggio.
Successivamente, incubare le cellule con un millilitro di tripsina in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per cinque-otto minuti. Dopo aver confermato il distacco al microscopio ottico, interrompere la reazione enzimatica con nove millilitri di terreno di coltura integrato con FBS. E diluire le cellule a 7,5 volte 10 per le quarte cellule per 250 microlitri di terreno più la concentrazione di FBS.
Successivamente, seminare 250 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti a fondo tondo e far scorrere delicatamente la piastra da un lato all'altro per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente sul fondo del pozzetto. Quindi trasferire la piastra in un incubatore per colture cellulari. Quando le colture hanno raggiunto una confluenza del 90-95%, sostituire il surnatante in ciascun pozzetto con 250 microlitri di terreno appena preparato integrato con 10 microgrammi per millilitro di mitomicina C e rimettere la piastra nell'incubatore per altre due ore.
Al termine dell'incubazione lavare le cellule con 250 microlitri di PBS e aggiungere 250 microlitri di PBS fresco in ogni pozzetto. Quindi utilizzare un puntale per micropipetta da 200 microlitri per eseguire un graffio verticale in ciascun monostrato cellulare. Quando tutti i monostrati sono stati graffiati, sostituire il PBS in ogni pozzetto con 250 microlitri con lo stimolo peptidico di interesse e montare la piastra in un sistema di telecamere ottiche con il coperchio intatto.
Per configurare la telecamera ottica, aprire la finestra di acquisizione e selezionare Guarigione ferite. Selezionare il tipo di piastra e deselezionare i pozzetti non in uso. Quindi fare clic su abilita e fare clic con il pulsante destro del mouse su uno dei pozzetti per regolare la messa a fuoco in modo che si adatti alla posizione delle celle.
Impostare il periodo di tempo per le immagini sotto l'intervallo dell'immagine e impostare il numero di ripetizioni per adattarle al periodo desiderato. Quindi selezionare il tipo di analisi appropriato. Quindi fare clic su Avvia per iniziare l'imaging delle cellule.
Quando si verifica una ferita, le cellule della pelle iniziano a proliferare e a migrare attraverso il letto della ferita per chiudere la ferita, un processo che può essere osservato attraverso la telecamera ottica. Dopo un'incubazione di 48 ore, il trattamento con fattore di crescita endoteliale induce una chiusura della ferita di quasi il 95%, rispetto a una chiusura del 38% nei pozzetti di controllo non trattati e del 33 e 62% rispettivamente nelle colture di lattoferrina e lattoferricina. La percentuale di chiusura della ferita determinata dalle variazioni dell'ampiezza dello spazio dal graffio iniziale può anche essere tracciata per ogni stimolo di crescita.
Questo video descrive un protocollo semplice ed efficiente per studiare la migrazione dei cheratinociti attraverso un graffio realizzato in un monostrato di cellule sane. Sebbene le cellule utilizzate in questo test siano cellule HaCaT, il metodo può essere applicato anche su altre linee cellulari, funghi o persino batteri, purché siano aderenti al fondo della piastra per microtitolazione.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una procedura per testare la migrazione cellulare in vitro utilizzando un microscopio ottico con camera automatica. Il saggio del graffio è presentato come un metodo affidabile per osservare la migrazione cellulare nel tempo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Microscopia
- Tecniche in vitro
Sfondo
- Il saggio del graffio è una tecnica ampiamente utilizzata per lo studio della migrazione cellulare.
- I microscopi ottici automatizzati permettono l'osservazione in tempo reale delle cellule.
- Comprendere la migrazione cellulare è fondamentale per le terapie contro le ferite croniche e il cancro.
- Questo metodo è economico e affidabile per rilevare il movimento cellulare.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per valutare la migrazione cellulare.
- Esplorare le implicazioni della migrazione cellulare nel trattamento delle ferite croniche e nella terapia del cancro.
- Utilizzare la microscopia ottica automatizzata per l'analisi in tempo reale.
Metodi Utilizzati
- Lavaggio di colture confluenti di cellule HaCaT con PBS.
- Incubazione delle cellule con tripsina per il distacco.
- Arresto della reazione enzimatica mediante mezzo di coltura.
- Diluzione delle cellule a una concentrazione specifica per l'analisi.
Risultati principali
- È stata ottenuta un'osservazione in tempo reale della migrazione cellulare.
- Il metodo si è rivelato efficace per il monitoraggio della chiusura del graffio.
- I risultati possono fornire indicazioni per strategie terapeutiche relative a ferite croniche e cancro.
- La microscopia automatizzata migliora l'affidabilità delle valutazioni della migrazione.
Conclusioni
- Il microscopio ottico automatizzato è uno strumento prezioso per lo studio della migrazione cellulare.
- Questa tecnica può far progredire la ricerca nei settori della guarigione delle ferite croniche e delle terapie contro il cancro.
- Studi futuri potrebbero ampliarne le applicazioni in diversi contesti biologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Gli saggi di migrazione cellulare sono fondamentali per valutare candidati terapeutici nella guarigione delle ferite e nell'oncologia, ma i saggi di graffio tradizionali presentano artefatti ai bordi e colli di bottiglia nell'analisi manuale. Questo protocollo ottimizzato affronta le sfide relative alla riproducibilità eliminando l'accumulo cellulare mediato dai cationi e integrando un'acquisizione d'immagini automatizzata, consentendo letture quantitative e costanti della migrazione. L'approccio supporta la validazione precoce dei bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici fornendo dati affidabili in tempo reale su composti pro- e anti-migratori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando le variazioni nella migrazione in risposta a stimoli come la lattoferrina o i fattori di crescita.
- Valore operativo: Riduce la variabilità derivante dall'analisi manuale del graffio e dalle fluttuazioni di temperatura mediante imaging ottico automatizzato.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Produce metriche quantitative standardizzate di chiusura della ferita a partire da sezioni di graffio identiche nel tempo.
- Valore operativo: Elimina il ciclaggio e l'analisi laboriosa delle immagini, migliorando la produttività per lo screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Utilizza cheratinociti HaCaT pertinenti alla malattia per modellare la migrazione epiteliale, favorendo l'allineamento di biomarcatori traslazionali.
- Valore operativo: Garantisce la continuità del saggio dalla fase di scoperta alla valutazione preclinica mediante flussi di lavoro automatizzati e riproducibili.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta, supportando la verifica delle ipotesi nella fase iniziale della scoperta e consentendo l'identificazione quantitativa di composti promettenti attraverso l'inibizione o la stimolazione misurabile della migrazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici isolando la migrazione come variabile dipendente in risposta a trattamenti con peptidi o citochine.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili (ad esempio, % di chiusura della ferita) che consentono il confronto tra librerie di composti o varianti proteiche.
- Analisi: Genera dati di migrazione in serie temporali adatti per analisi statistiche e modellizzazione dose-risposta.
- Ricerca traslazionale: Stabilisce un collegamento con la rilevanza preclinica attraverso l'uso di cellule cheratinocitiche umane e il contesto della guarigione delle ferite.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile e automatizzata per saggi di migrazione in diversi progetti e tipi cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nei saggi di migrazione.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità grazie all'acquisizione automatica di immagini e alla preparazione uniforme del graffio.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati quantitativi affidabili sulla migrazione già nelle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei composti in base agli effetti sulla migrazione validati, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare e nella tecnica asettica per la preparazione del monolayer.
- È dipendente da sistemi ottici automatizzati con funzionalità di time-lapse e analisi.
- Necessita della standardizzazione della larghezza del graffio e dei tempi tra i diversi pozzetti per ottenere dati confrontabili.
- Richiede l'ottimizzazione dei passaggi di lavaggio con PBS per prevenire artefatti ai bordi in diverse linee cellulari.
- È limitato a cellule aderenti compatibili con l'adesione al fondo di piastre microtitolazione.
