Ottimizzato Scratch test per test In Vitro della migrazione cellulare con una fotocamera ottica automatizzata

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile osservare le cellule in tempo reale con il microscopio ottico automatico. Le implicazioni di questo trattamento si estendono a una terapia delle ferite croniche o del cancro in cui la migrazione gioca un ruolo cruciale in queste malattie. Iniziare lavando due volte una coltura confluente di cellule HaCaT con cinque millilitri di PBS sterile privo di magnesio e calcio per lavaggio.

Successivamente, incubare le cellule con un millilitro di tripsina in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per cinque-otto minuti. Dopo aver confermato il distacco al microscopio ottico, interrompere la reazione enzimatica con nove millilitri di terreno di coltura integrato con FBS. E diluire le cellule a 7,5 volte 10 per le quarte cellule per 250 microlitri di terreno più la concentrazione di FBS.

Successivamente, seminare 250 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti a fondo tondo e far scorrere delicatamente la piastra da un lato all'altro per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente sul fondo del pozzetto. Quindi trasferire la piastra in un incubatore per colture cellulari. Quando le colture hanno raggiunto una confluenza del 90-95%, sostituire il surnatante in ciascun pozzetto con 250 microlitri di terreno appena preparato integrato con 10 microgrammi per millilitro di mitomicina C e rimettere la piastra nell'incubatore per altre due ore.

Al termine dell'incubazione lavare le cellule con 250 microlitri di PBS e aggiungere 250 microlitri di PBS fresco in ogni pozzetto. Quindi utilizzare un puntale per micropipetta da 200 microlitri per eseguire un graffio verticale in ciascun monostrato cellulare. Quando tutti i monostrati sono stati graffiati, sostituire il PBS in ogni pozzetto con 250 microlitri con lo stimolo peptidico di interesse e montare la piastra in un sistema di telecamere ottiche con il coperchio intatto.

Per configurare la telecamera ottica, aprire la finestra di acquisizione e selezionare Guarigione ferite. Selezionare il tipo di piastra e deselezionare i pozzetti non in uso. Quindi fare clic su abilita e fare clic con il pulsante destro del mouse su uno dei pozzetti per regolare la messa a fuoco in modo che si adatti alla posizione delle celle.

Impostare il periodo di tempo per le immagini sotto l'intervallo dell'immagine e impostare il numero di ripetizioni per adattarle al periodo desiderato. Quindi selezionare il tipo di analisi appropriato. Quindi fare clic su Avvia per iniziare l'imaging delle cellule.

Quando si verifica una ferita, le cellule della pelle iniziano a proliferare e a migrare attraverso il letto della ferita per chiudere la ferita, un processo che può essere osservato attraverso la telecamera ottica. Dopo un'incubazione di 48 ore, il trattamento con fattore di crescita endoteliale induce una chiusura della ferita di quasi il 95%, rispetto a una chiusura del 38% nei pozzetti di controllo non trattati e del 33 e 62% rispettivamente nelle colture di lattoferrina e lattoferricina. La percentuale di chiusura della ferita determinata dalle variazioni dell'ampiezza dello spazio dal graffio iniziale può anche essere tracciata per ogni stimolo di crescita.

Questo video descrive un protocollo semplice ed efficiente per studiare la migrazione dei cheratinociti attraverso un graffio realizzato in un monostrato di cellule sane. Sebbene le cellule utilizzate in questo test siano cellule HaCaT, il metodo può essere applicato anche su altre linee cellulari, funghi o persino batteri, purché siano aderenti al fondo della piastra per microtitolazione.