Valutare la fattibilità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia ospite-microbo In Vitro Gut

Questo modello è il passo successivo nell'impostazione delle microdirezioni dell'ospite per il tratto digestivo superiore. Permette di affrontare le questioni della ricerca meccanicistica e offre molte opportunità per l'industria alimentare, farmaceutica e nutraceutica e anche per la tossicologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina un modello del sistema gastrointestinale con la micro interfaccia ospite, inclusa una complessa comunità microbica.

È molto applicabile ed è anche molto flessibile. Questa metodologia può essere adottata utilizzando altri tipi di cellule per valutare la vitalità del patogeno e le informazioni successive. I cambiamenti possono anche essere utilizzati per aiutare la capacità di colonizzazione delle miscele probiotiche e, in ultima analisi, il potenziale effetto dei batteri sulla circolazione sistemica.

Per iniziare, sterilizzare in autoclave il terreno, quindi aggiungere cinque microgrammi per millilitro di emen e un microgrammo per millilitro di menadione. Erogare nove millilitri di terreno nelle provette Hungate e chiudere le provette con un tappo di gomma e un tappo di alluminio. Quindi sciacquare i tubi con una miscela di azoto al 90% e anidride carbonica al 10%.

Utilizzare la siringa per recuperare un millilitro di terreno anaerobico e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Raccogli singole colonie di ciascuna specie batterica e rimettile in sospensione nel terreno. Quindi trasferire le colonie nel BHI anaerobico modificato e incubarle a 37 gradi Celsius per 48 ore.

Dopo l'incubazione, utilizzare PBS sterilizzato filtrato per diluire le colture a 10-5 cellule per millilitro. Quindi utilizzare la citometria a flusso con la colorazione di ioduro di propidio verde cibernetico per misurare il numero di cellule. La valutazione della composizione e della vitalità della comunità del microbioma è essenziale per evitare distorsioni nel nostro esperimento.

Rimuovere il terreno di coltura cellulare dai flaconi, quindi utilizzare cinque millilitri di PBS senza calcio o magnesio per lavare le cellule una volta. Aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina EDTA alle cellule. Distribuire la soluzione muovendo delicatamente il pallone.

Quindi rimuovere 1,5 millilitri della soluzione di tripsina e incubare il pallone a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver controllato al microscopio se le cellule si sono staccate, aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura cellulare integrato al pallone per inattivare la tripsina e pipettare su e giù per ottenere una sospensione omogenea di una singola cellula. Miscelare immediatamente un'aliquota di 50 microlitri della sospensione cellulare con una soluzione sterile di blu di tripano allo 0,4% in una proporzione 1:1 tra volume e volume per le cellule KCO2 per un rapporto 1:5 tra volume e volume per HT29MTX.

Miscelare mediante pipettaggio e caricare la sospensione in una camera di conteggio prima di contare le cellule al microscopio. Dopo aver preparato le sospensioni di KCO2 e HT29MTX cellule secondo il protocollo di testo, omogeneizzare le sospensioni e aggiungere il volume corrispondente di KCO2 e cellule HT29MTX in un contenitore sterile preriempito con terreno di coltura cellulare integrato. Aspirare il terreno pre-incubato dal lato apicale della camera precedentemente preparata.

Miscelare delicatamente la sospensione cellulare mediante pipettaggio e trasferire 1,5 millilitri nello scomparto apicale degli inserti della camera, mescolando la sospensione cellulare ogni uno o tre pozzetti per garantire un'omogeneizzazione costante. Muovi delicatamente le piastre avanti e indietro e poi da destra a sinistra per distribuire uniformemente le cellule nel pozzetto. Trasferire le piastre nell'incubatrice e ripetere il movimento delle piastre.

L'alloggiamento delle cellule deve essere effettuato con un'omogeneizzazione costante della sospensione cellulare per garantire una diffusione uniforme nel pozzetto. Per misurare l'integrità della barriera epiteliale prima di iniziare l'ASA, assicurarsi che l'apparecchiatura di livello sia completamente carica prima di iniziare le misurazioni. Scollegare l'apparecchiatura di livello dall'alimentazione e coprirla con un sacchetto di plastica per autoclave.

Praticare un foro nel sacchetto per introdurre l'elettrodo nella porta di ingresso dello strumento. Quindi spruzzare la sacca con etanolo al 70% prima di trasferire l'attrezzatura a più livelli nell'armadio di flusso. Per disinfettare l'elettrodo, immergere le punte degli elettrodi in etanolo al 70% per 15 minuti.

Lasciare asciugare le punte all'aria per 15 secondi, quindi utilizzare il terreno di coltura cellulare per risciacquare l'elettrodo. Lasciare che le celle raggiungano la temperatura ambiente all'interno della cabina di flusso. Assicurarsi che lo strumento sia scollegato dal caricabatterie, quindi impostare l'interruttore di modalità su Ohm e accendere l'interruttore di alimentazione.

Misurare la resistenza della cella immergendo l'elettrodo con la punta più corta nell'inserto e la punta più lunga fuori dal pozzetto. Tenere l'elettrodo a un angolo di 90 gradi rispetto all'inserto della piastra. Per simulare la digestione orale, trasferire tre millilitri della comunità batterica in una provetta sterile da 50 millilitri e mescolare con tre millilitri di liquido salivare simulato o SSF.

Aggiungere 75 unità per millilitro di alfa-amilasi dalla saliva umana di tipo 9A e due grammi per litro di mucina dallo stomaco suino di tipo 2. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius e 100 giri/min per due minuti. Raccogliere un campione da due millilitri per l'estrazione del DNA e la quantificazione con citometria a flusso.

Per simulare la digestione gastrica, aggiungere quattro millilitri di liquido gastrico simulato o SGF a tre millilitri di batteri. Utilizzare un molare di HCl per regolare il pH a tre, se necessario. Incubare il campione a 37 gradi Celsius e 100 giri/min per due minuti.

Quindi raccogliere un campione da due millilitri. Per la digestione dell'intestino tenue, aggiungere quattro millilitri di liquido intestinale simulato o SIF ai batteri. Se necessario, utilizzare idrossido di sodio per regolare il pH.

Quindi incubare il campione a 37 gradi Celsius e 100 giri/min per due minuti. E raccogli un campione da due millilitri. Dopo aver lavato e regolato la densità cellulare della digestione dell'intestino tenue secondo il protocollo di testo, rimuovere il mezzo apicale dal sistema transwell e aggiungere 1,5 millilitri di sospensione batterica.

Co-coltura del sistema in condizioni generali di coltura cellulare per due ore. Dopo l'incubazione, misurare i valori del livello per valutare l'integrità della barriera epiteliale, come dimostrato in precedenza nel video. Aggiungere 0,5 millilitri di n-acetilcisteina 10 millimolari e HPSS per solubilizzare il muco prodotto dal HT29MTX e recuperare i batteri aderiti.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per un'ora sotto agitazione. Recuperare il NAC HPSS in una provetta da microcentrifuga e utilizzare un millilitro di DPBS per lavare le cellule due volte. Aggiungere 0,5 millilitri di triton-x100 allo 0,5% sopra i monostrati e disgregare le cellule mediante pipettaggio.

Quindi recuperare rapidamente il liquido in vortice per un minuto. La velocità è fondamentale per evitare di danneggiare le cellule batteriche con il detergente. Analizzare i campioni secondo il protocollo di testo.

Come riportato qui, la conta delle cellule intatte dei singoli ceppi era di circa 10-8 cellule per millilitro prima della creazione della comunità sintetica, mentre il microcosmo multispecie conteneva oltre il 90% di cellule vitali durante la creazione della comunità. Sulla base della quantificazione vivo-morto, la vitalità batterica diminuisce dopo ogni fase di digestione a causa del pH acido durante il passaggio gastrico e dei bio-sali contenuti nei fluidi di digestione dell'intestino tenue. Le dure condizioni della digestione dello stomaco e dell'intestino tenue possono trasformare i batteri in cellule vitali ma non in coltura che sono batteri vivi che non crescono né si dividono.

Come dimostrato in questa figura, le cellule vitali recuperate dall'interfaccia mucosa sono colorate in blu nel grafico di citometria a flusso. Tuttavia, non è stata osservata alcuna crescita durante la placcatura di questi campioni di muco. La frazione in cui i batteri mostrano tassi di vitalità più elevati sono i detriti cellulari, come rivelato dal conteggio delle piastre.

Il numero di colonie può essere variabile, ma la presenza di batteri metabolicamente attivi si riscontra nei campioni meno diluiti. Dopo questo sviluppo, questa tecnica può essere utilizzata da ricercatori nel campo della nutrigenomica o della farmacomicrobiomica per studiare l'ospite microcosmicamente. Seguendo questo protocollo, è possibile eseguire altre tecniche come il trascrittoma o l'analisi metabolica per ottenere una comprensione meccanicistica del processo di colonizzazione di successo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire un modello in vitro complesso rappresentativo dei processi digestivi, incluso il cross-talk tra le cellule ospiti e il resto del microbioma. Non dimenticare che lavorare con batteri patogeni può essere estremamente pericoloso ed è importante considerare le precauzioni di biosicurezza.