Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'endocrinologia, così come nel campo delle neuroscienze, come la nostra ricerca per rivedere le risposte del cervello ai segnali endocrini. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile esaminare gli effetti diretti dei segnali endocrini sul cervello separato dagli altri tessuti. Per iniziare questa procedura, utilizzare una pinza per graffiare il centro inferiore di un piatto di coltura in plastica per creare un'ammaccatura per facilitare il montaggio del ganglio ventrale del cervello larvale dopo la dissezione.

Con uno stuzzicadenti, metti una piccola goccia di supercolla su entrambi i lati dell'ammaccatura e attacca un'asta di tungsteno alla colla. Quindi, usando un piccolo pezzo di adesivo riutilizzabile simile a uno stucco, crea una parete circolare che circonda l'ammaccatura. Per sezionare il cervello larvale, da 90 a 120 ore dopo la deposizione delle uova, raccogliere le larve e lavarle almeno tre volte con acqua distillata per rimuovere i residui di cibo aderenti.

Quindi, posiziona una larva su un vetro quadrato da un pollice e mezzo pieno di PBS ghiacciato. Usa un paio di pinze per afferrare delicatamente la parte centrale della larva. Usa un altro paio di pinze per afferrare e tirare delicatamente i ganci della bocca per separare la parte anteriore della larva contenente il cervello dal resto del corpo.

Quindi, tieni la punta anteriore con la pinza e capovolgi la larva. Rimuovere i tessuti estranei attaccati al cervello, come i dischi immaginali, i corpi adiposi e la ghiandola anulare. Separa delicatamente il cervello dalle parti della bocca.

Successivamente, applicare 200 microlitri di PBS all'interno dell'anello adesivo preparato in precedenza nella camera di imaging. Aspirare delicatamente il cervello sezionato con PBS in una pipetta Pasteur e trasferirlo nella camera di imaging. Nella camera di imaging, afferrare le fibre muscolari che si estendono dai gangli ventrali e inserire delicatamente il cervello nell'ammaccatura sotto il filo di tungsteno.

Quindi, tirare leggermente il filo di tungsteno verso l'alto per posizionare il cervello nella posizione corretta per l'imaging. Per acquisire immagini a fluorescenza del calcio, posizionare al microscopio la camera di imaging contenente l'espiante cerebrale. Abbassare la lente dell'obiettivo fino a toccare il PBS e, in condizioni di illuminazione a campo chiaro, posizionare il cervello e metterlo a fuoco.

Passa alla luce fluorescente e regola la messa a fuoco sulle celle etichettate con successo GCaMP. Avviare l'acquisizione a 250 ms/fotogramma, con una risoluzione di 512 x 512 pixel in modalità raffreddata ad acqua. Quindi, regolare il tempo di esposizione per ottenere i valori di fluorescenza all'interno della gamma dinamica della telecamera CCD, ma non inferiori a 1000 unità arbitrarie con immagini a 16 bit.

Una volta determinati i parametri di imaging, scattare le immagini per un minuto prima della somministrazione del peptide per rilevare l'intensità del segnale di base. Successivamente, applicare direttamente il peptide di prova, pipettando 100 microlitri della soluzione peptidica preparata nel bagno larvale. Registrare l'emissione di successo GCaMP per alcuni minuti.

Per analizzare i dati, aprire il software di analisi e utilizzare il primo fotogramma precedente all'applicazione del peptide come immagine di riferimento. Quindi, seleziona Plugin, TurboReg. Scegli il file di immagine seriale come Origine e l'immagine di riferimento come Destinazione.

Quindi, controlla Corpo rigido e Accurato rispettivamente per il metodo di lavorazione e la qualità. Successivamente, fare clic su Batch per avviare l'elaborazione delle immagini. Seleziona più aree di interesse utilizzando Analizza, Strumenti, Gestione ROI, nella barra delle immagini.

Quindi, misurare l'intensità dei pixel facendo clic su Altro, Multi Measure, OK, nella finestra ROI Manager. In questo esperimento, il cervello di tipo selvatico è stato esposto a CCHa2, grelina e nocicettina, mentre il cervello mutante del recettore CCHa2 è stato esposto a CCHa2. I segnali GCaMP6 nelle cellule produttrici di insulina sono stati rilevati mediante microscopia confocale a 250 ms/frame, e qui sono riportate le immagini fisse dei punti temporali selezionati.

È stato tracciato il rapporto tra la variazione dell'intensità del ROI e l'intensità del segnale di base in ogni punto temporale. Le ROI sono state impostate sui corpi cellulari che sono stati rilevati sullo stesso piano focale. Le linee continue indicano la media da cinque a 10 campioni e le linee tratteggiate segnano i limiti superiore e inferiore dell'errore standard della media.

Le aree ombreggiate indicano la variazione dei segnali negli esperimenti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare rapidamente il campione di cervello, per evitare danni ad esso.

Questa procedura può essere combinata con la genetica per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sulla specificità del recettore. Il sistema utilizzato in questo protocollo è facile da preparare e riutilizzabile. Pertanto, questo protocollo sarà utile, come nello screening.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'endocrinologia e delle neuroscienze per esplorare le reti ormonali che controllano la funzione cerebrale in Drosophila.