Name: Un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-PCR amplificazione per ampliconi di DNA Single-Stranded (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Scopri un metodo di microfluidica a goccia con microsfere di poliacrilammide per l'amplificazione PCR, che produce DNA a filamento singolo senza separazione aggiuntiva. Utile per diagnosi e terapia.

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Questo studio è supportato da un progetto intitolato "programma di ricerca cooperativa per agricoltura Science & Technology Development (progetto n ° PJ0011642) "finanziato dal governo di sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Questa ricerca è stata sostenuta in parte anche da una sovvenzione (NRF-2017R1A2B4012253) del programma di ricerca scienza base attraverso la Fondazione di ricerca nazionale (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT & futuro pianificazione, Repubblica di Corea. Questa ricerca è stata anche sostenuta da una sovvenzione (N0000717) del programma di educazione per creativi e convergenza industriale finanziato dal Ministero del commercio, industria ed energia, Repubblica di Corea.

1. realizzazione di una piattaforma di Microfluidic PDMS
<ol><li>Preparare 20 mL di liquido prepolimero PDMS con polimero di base e catalizzatore in un rapporto di volume di 10:1. Versare 10 mL del liquido PDMS su uno stampo SU-8 preparato su un wafer di silicio per la parte superiore della rete microfluidica. Per la parte inferiore piatta, versare lo stesso volume di liquido PDMS sul wafer di silicio senza una struttura di stampo. Nota: La rete di microfluidica è progettata in un programma CAD e poi convertita in un photomask al fine di fabbricare un master utilizzando il processo di fotolitografia tipico (vedere Figure supplementari). Questo master è composto lo stampo di SU-8 photoresist negativo sui wafer di silicio11.</li>
	<li>Posizionare due wafer di silicio rivestito con liquido prepolimero PDMS sulla piastra calda e della cura a 75 ° C per 30 min.<ol>
<li>Manualmente rimuovere lo strato PDMS curato dallo stampo SU-8. Allineare un diametro di 1,5 mm tondo attrezzo di perforazione del foro per il porto di olio sulla rete replicata microfluidici per l'interfaccia dei canali di flusso micron-scala con i campioni di liquido macro. Pugno l'attraverso-foro manualmente.</li>
		<li>Ripetere questo processo tre volte per la formazione delle due soluzioni e la porta di uscita di punzonatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire trattamento superficiale idrofilico sulla tomaia e strati di PDMS fondo utilizzando un palmare corona treater12 per alcuni secondi per campione.<ol>
<li>Stack due trattati del plasma PDMS strati e calore a 90 ° C per 30 minuti utilizzando una piastra calda per il processo di incollaggio PDMS-a-PDMS. Fornire l'acqua pressurizzata utilizzando la pompa a siringa in tre porte di ingresso per l'incollaggio strutturale e la prova di perdita del dispositivo fabbricato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. produzione di poliacrilammide Oligo-microsfere
<ol><li>Preparare la miscela di microsfere indicata nella tabella 1.</li>
	<li>Vortice e brevemente centrifuga la coprocoltura standard ssDNA etichettati sonda (Ap, 100 μM) e acrylamide:bis (19:1) soluzione di riserva.</li>
	<li>Preparare soluzione ho mescolando 25 μL di 40% di acrilammide bis soluzione, 10 μL di ssDNA (coprocoltura sonda), 10 μL di tampone di x TBE 5 (1,1 M Tris; borato di 900 mM e 25 mM EDTA) e 5 μL di acqua. Preparare soluzione II con 50 μL di persolfato dell'ammonio 20%.</li>
	<li>Preparare due siringhe individualmente riempito con soluzione soluzione II e io e montarli sulla pompa per introdurre flussi di soluzione nella piattaforma microfluidica. Preparare l'olio minerale mescolato con 0,4% TEMED per solidificazione superficiale delle microsfere. Nota: TEMED è ben noto come stabilizzatore del radicale libero. I radicali liberi possono accelerare il tasso di formazione del polimero con ammonio persolfato (APS) al fine di catalizzare la polimerizzazione di acrilammide.</li>
	<li>Riempire una bottiglia di vetro con 4 mL di olio minerale per generare un flusso continuo.</li>
	<li>Inserire due tubi a due porte nel tappo della bottiglia di vetro come un serbatoio di microfluidica: il raccordo pneumatico per l'applicazione dell'aria compressa in bottiglia di vetro dal compressore d'aria e la porta di fluido per fornire l'olio pressurizzato alla rete micro canale dalla bottiglia di vetro. Collegare i tubi tra la bottiglia di vetro e la porta di olio nel dispositivo microfluidico.<ol>
<li>Collegare i tubi ai porti due soluzione nel dispositivo microfluidico al fine di fornire le due soluzioni dalle pompe a siringa. Inserire tubi di mandata al fine di trasferire la microsfera generato nel becher.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare la portata della pompa a siringa a 0,4 - 0,7 mL/h. regolare aria compressa la pressione del compressore utilizzando un regolatore (82-116 kPa). Impostare la velocità di rotazione (500 giri/min) della barra di agitatore magnetico in bicchiere di vetro su un piatto caldo. Azionare la pompa a siringa e fornire l'aria compressa generata da un compressore esterno nella bottiglia di vetro utilizzando il controllo ON/OFF di una valvola elettromagnetica13.</li>
	<li>Osservare la formazione di microsfere nella geometria del flusso-messa a fuoco e solidificazione delle microsfere generate in bicchiere di vetro con un microscopio digitale. Nota: La dimensione e velocità di produzione delle microsfere dipendono la portata delle soluzioni e la pressione applicata per il flusso di olio minerale (tabella 2).
</li>
</ol>3. esecuzione di poliacrilammide Oligo-microsfere conta
<ol><li>Per la quantificazione di un emocitometro, prendete una piccola quantità (circa 100 µ l) di soluzione acquosa di poliacrilammide oligo-microsfere e posto sul vetro emocitometro e riempire delicatamente la sospensione di microsfere fino al pozzo della camera del conteggio. Nota: Per ulteriori dettagli, vedere http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.</li>
	<li>Utilizzare un microscopio e mano tally contatore per contare le microsfere in un unico set di 16 quadrati. Spostare l'emocitometro al gruppo successivo della camera, quindi portare il conteggio fino a quando tutte le quattro serie di 16 angoli sono contati.</li>
	<li>Determinare il numero medio di microsfere e calcolare il numero delle microsfere in sospensione originale perlina.</li>
	<li>Trasferire 100 μL di microsfere a un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Rimuovere il sopranatante mediante centrifugazione (400 x g) dolce e pipettaggio.</li>
</ol>4. eseguire l'ibridazione del DNA sulla superficie del poliacrilammide Oligomicrosphere
Nota: Un'identico DNA sonda con un 5'-NH2-gruppo invece di 5'-acrytide modifica viene aggiunto nella soluzione ho e testato per Ap-contenente microsfere in parallelo. Risultati di ibridazione del DNA sono mostrati nella Figura 2. La soluzione di sonde (PAC) di oligonucleotidi complementari Cy3-etichetta dovrebbe essere posizionata in una stanza buia.
<ol><li>Risospendere Cy3-cAp con 100 μL di tampone 1xTE (buffer di TE: 10 mM Tris e 1μM EDTA, pH 8.0) al fine di ottenere una concentrazione finale di 100 μM. Ad esempio, risospendere 1 pmol PAC in 100 mL di buffer di TE e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga coperta con carta stagnola. Nota: Per le sequenze di strand, vedere la tabella 3.</li>
	<li>Aggiungere 100 μM di Cy3-PAC a un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL contenente microsfere Ap-copolimerizzati.</li>
	<li>Toccare il tubo di un paio di volte per mescolare e incubare a temperatura ambiente al buio per 1 h.</li>
	<li>Scartare il surnatante e rimuovere residui buffer tramite il pipettaggio.</li>
	<li>Lavare tre volte con 500 μL di tampone di TE.</li>
	<li>Risospendere le microsfere toccando delicatamente il tubo del microcentrifuge. Quindi, ripetere il passaggio 4.4.</li>
	<li>Posizionare le microsfere sul vetrino (75 x 50 mm) e coprire con un foglio di alluminio prima di formazione immagine.</li>
</ol>5. asimmetrica PCR per amplificare ssDNA
<ol><li>Preparare una miscela di reagenti PCR asimmetrica per amplificare ssDNA per essere analizzati. Scongelare i reagenti in tabella 4 su ghiaccio. Non tenere l'enzima polimerasi di Taq (50 U / µ l) sul ghiaccio, ma piuttosto conservare a-20 ° C fino a quando necessario.</li>
	<li>Vortice di delicatamente tutti i reagenti e quindi brevemente Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 s.</li>
	<li>Combinare tutti i reagenti come descritto tabella 4.
</li>
	<li>I campioni in un termociclatore e avviare la PCR asimmetrica nelle seguenti condizioni: 25 cicli (95 ° C per 30 s, 52 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s), 85 ° C per 5 min, tenere a 4 ° C.</li>
</ol>6. microsfere-PCR per amplificare ssDNA
Nota: Questa sezione descrive il protocollo per l'amplificazione ssDNA in una provetta di reazione di PCR. Reazioni di microsfere-PCR sono state effettuate in 50 µ l di volume di reazione. Le sequenze dettagliate utilizzate per amplificare ssDNA sono elencate nella tabella 5. In questo caso, Ap sulla superficie di microsfere può tempri casuale modelli del DNA in modo complementare. Si tratta di un passo molto importante per la produzione di filamenti di DNA complementare (filo del DNA antisenso, Figura 3). Il DNA esteso è usato come un modello per l'amplificazione di PCR di microsfere.
<ol><li>Preparare la miscela reagente microsfera-PCR. Scongelare i reagenti in tabella 6 su ghiaccio; Tuttavia, non tenere l'enzima della polimerasi di Taq sul ghiaccio. Conservare a-20 ° C fino a quando necessario.</li>
	<li>Vortice di delicatamente tutti i reagenti e quindi brevemente Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 s.</li>
	<li>Ottenere circa ~ 25 microsfere attraverso conteggio al microscopio. Nota: Il numero delle microsfere in provetta di uno reazione vengono calcolato utilizzando un microscopio con ingrandimento 40x. Circa 25 ~ microsfere sono utilizzate per l'amplificazione di PCR di microsfere. Informazioni più dettagliate sono nel passaggio 3.</li>
	<li>Combinare tutti i reagenti come descritto tabella 6.
</li>
	<li>I campioni in un termociclatore e avviare la PCR asimmetrica nelle seguenti condizioni: 25 cicli (95 ° C per 30 s, 52 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s), 85 ° C per 5 min, tenere a 4 ° C.</li>
	<li>Amplificazione di seguente, aggiungere 8 μL di 6 x buffer di caricamento e caricare 15 µ l di ciascun campione in gel di agarosio al 2%. Quindi, eseguire l'elettroforesi a 100 V per 35 min in 1 x TAE (Tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8.2) buffer.</li>
</ol>7. microscopio confocale acquisizione
Nota: I risultati dell'ibridazione della sonda di microsfere-DNA sono imaging sotto un microscopio confocale. Analisi dell'immagine viene eseguita utilizzando ImageJ.
<ol><li>Difficoltà ibridate microsfere sul palco del microscopio in un supporto.</li>
	<li>Selezionare il laser (laser a Elio/Neon, 543 nm linea) e accenderlo a controllo laser.</li>
	<li>Selezionare la lente dell'obiettivo nel controllo del microscopio.</li>
	<li>Selezionare il filtro desiderato per Cy3 e canale a controllo di configurazione.</li>
	<li>Iniziare l'esperimento e osservare il campione. Impostazioni per il microscopio confocale sono riassunti nella tabella 7.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li>
<li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+%28AIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li>
<li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li>
<li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li>
<li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777(2016).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1537519">Formation of dispersions using &#34;flow focusing&#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045793014002217">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li>
<li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6(2003).</li>
<li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Contaminanti di dsDNA sono un problema importante in ssDNA amplificazione. Rimane difficile minimizzare dsDNA amplificazione in convenzionale di amplificazione in PCR asimmetrica15. Inoltre, anche se miglioramenti tecnici per la generazione di ssDNA hanno permesso di aumentare l'efficienza di rendimento del campione, ssDNA isolamento è ancora problematico a causa di suoi alti costi e rendimenti di depurazione incompleta.
PCR asimmetrica è uno dei più impegnativi metodi ...

DNA a singola elica (ssDNA) è stato ampiamente considerato come un elemento di riconoscimento molecolare (MRE) grazie alle sue proprietà intrinseche per l'ibridazione DNA-DNA1,2. Lo sviluppo di sistemi sintetici ssDNA può portare ad applicazioni biologiche quali DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostica e molecolare di rilevamento integrato basato su interazioni complementari4,5.
Fin qui, le particelle di polimero di scala micrometrica sono state dimostrate con successo utilizzando dispositivi microfluidici. Diverse tecniche di microfluidica hanno dimostrati di essere potente per la produzione di microsfere altamente omogenee il flusso continuo in ambiente microchannel6,7.
Nello studio di Lee et al. 8, una piattaforma di microfluidica gocciolina-basato per la sintesi di microfluidica di amplificazione oligo-microsfere e ssDNA qui è stato segnalato. La piattaforma microfluidica è costituito da due strati PDMS (polidimetilsilossano): una parte superiore con una rete di canali microfluidici per la generazione di microsfere e un fondo piatto a parte. Questi consistono di tre tipi di canali fluidici PDMS: 1) un flusso di canale per la generazione di goccia, 2) un canale serpeggiante per la miscelazione di due soluzioni e 3) un canale di polimerizzazione sequenziale per solidificazione di microsfere di messa a fuoco. Una volta due flussi immiscibili vengono introdotti in un singolo canale fluidico PDMS, i flussi possono essere forzati attraverso la struttura di orifizio stretto. I comportamenti di flusso come geometria del canale, portata e viscosità influiscono sulla dimensione e la morfologia delle microsfere. Pertanto, il principale flusso di liquido può essere diviso in Microscala monospheres9,10.
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato microsfera-PCR per l'amplificazione di ssDNA. In primo luogo, un processo di progettazione di dispositivi microfluidici basati su goccia è descritto. Quindi, è spiegato il modo in cui poliacrilammide microsfere possono essere funzionalizzate con modello casuale di DNA in maniera complementare. Infine, un protocollo di microsfere-PCR per amplificare ssDNA è mostrato.

<table><tbody><tr><td>polidimetilsilossano liquido, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>Componenti del chip</td></tr><tr><td>40% Acrilammide: soluzione bis (19:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610140 Componenti dell'oligo-microsfera copolimerizzabile</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio, APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Indurente di acrilammide:bis soluzione</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiammina, TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Catalizzatore di persolfato di ammonio</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td>Tabella 1. Soluzione III. Componente dei reagenti a microsfera</td></tr>: <tr><td>sonde oligonucleotidiche complementari marcate con Cy3</td>, <td>sintetizzato</td><td>da Bioneer</td><td>, Tabella 3. Informazioni sulla sequenza&nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda marcata con acridito ssDNA</td><td>sintetizzata Bioneer</td><td>Tabella</td><td>1. Soluzione I. Componente dei reagenti a microsfere</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosesang</td><td>&nbsp; T1016</td><td>Componenti del tampone TE, soluzione tampone pH</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>Componenti del tampone TE, rimozione dello ione (Ca2+)</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>Microscopio confocale per amplificazione del DNA</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Identificazione dell'esposizione degli oligonucleotidi della superficie della microsfera</td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>eclipse 80i</td><td>Calcolo del numero di microsfere</td></tr><tr><td>Termociclatore T100</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td>amplificazione del DNA</td></tr> Trattamento <tr><td>Corona portatile</td><td>Electro-Technic</td><td>BD-20AC Laboratorio Trattamento Corona Trattamento</td> superficiale <td>idrofilo</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Come una</td> piastra riscaldante <td>HI-1000</td><td>per l'indurimento di PDMS liquido</td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>kd Scientific</td><td>78-1100</td><td>Flusso uniforme del compressore della Soluzione I e della Soluzione II</td></tr><tr><td>Kohands</td><td></td><td>KC-250A</td><td>Controllo del flusso dell'ematocitometro</td></tr><tr><td>a linea chiara</td> della Soluzione III <td>Sigma</td><td>Aldrich Z359629</td><td>Calcolo del numero di microsfere</td></tr></tbody></table>

un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-pcr amplificazione per ampliconi di dna single-stranded

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Basato su goccia microfluidica consentono la produzione affidabile di microsfere omogenee nel canale di microfluidica, fornendo controllata, dimensioni e morfologia delle microsfere ottenute. Una microsfera copolimerizzato con una sonda di DNA coprocoltura con successo è stato fabbricato. Diversi metodi quali la PCR asimmetrica, digestione esonucleasi e isolamento su biglie magnetiche rivestite con streptavidina possono essere utilizzati per sintetizzare DNA a singola elica (ssDNA). Tuttavia, questi metodi non possono utilizzare in modo efficiente grandi quantità di altamente purificato ssDNA. Qui, descriviamo un protocollo di PCR di microsfere dettagliare come ssDNA può essere amplificato in modo efficiente e separato da dsDNA semplicemente pipettando da una provetta di reazione di PCR. L'amplificazione di ssDNA può essere applicato come potenziali reagenti per i microarray del DNA e DNA-SELEX (sistematica evoluzione di ligandi di arricchimento esponenziale) processi.

La piattaforma di fabbricato polimerici microfluidici basati su gocciolina è costituito da due strati PDMS (Figura 1a). Vengono utilizzati tre tipi di reti di canali microfluidici per la generazione di microsfere: geometria 1) flusso di messa a fuoco, come mostrato in Figura 1b, 2) un canale serpeggiante per miscelare la soluzione io e soluzione II e 3) un canale di polimerizzazione per microsfere solidificazione. L'altezza di tu...

Questo lavoro fornisce un metodo per la realizzazione di piattaforme microfluidici basati su gocciolina e l'applicazione di microsfere di poliacrilammide per l'amplificazione di PCR di microsfere. Il metodo di microsfere-PCR permette di ottenere single-stranded DNA ampliconi senza separare DNA double-stranded.

Un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-PCR amplificazione per ampliconi di DNA Single-Stranded

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella tecnica combinatoria del sistema microfluidico e nel campo della biotecnologia molecolare, come i dispositivi microfluidici e il metodo PCR dell'asimmetria. I principali vantaggi di questa tecnica sono la generazione efficiente di microsfere altamente omogeneizzate e la produzione di DNA monofoto senza ulteriori fasi di separazione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi o la terapia di varie malattie.Poiché la generazione di DNA a singolo filamento è fondamentale per i test ap-ta-mo-sis, può essere utilizzata per il rilevamento e il trattamento. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul sistema microfluidico tridimensionale nel MEMS, può anche essere applicato ad altri sistemi utilizzati per il rilevamento e il trattamento delle malattie. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a controllare correttamente i fluidi dal fluire nella direzione inversa.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per osservare la formazione della microsfera nella geometria di messa a fuoco del flusso e la solidificazione delle microsfere generate. In primo luogo, p

a-droplet-based-microfluidic-approach-microsphere-pcr-amplification

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Bioingegneria

Piattaforme microfluidica gocce a base sono candidati promettenti per la sperimentazione ad alto rendimento in quanto sono in grado di generare picolitri, auto-compartimenti imbarcazioni a buon mercato a prezzi kHz. Attraverso l'integrazione con veloce, sensibile e ad alta risoluzione metodi di spettroscopia di fluorescenza, la grande quantità di informazioni generate all'interno di questi sistemi possono essere estratte in modo efficiente, sfruttato ed utilizzato.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

In questo video, presentiamo una procedura passo-passo per generare nano-goccioline emulsionate per rilevare gli acidi nucleici bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi digitale o dPCR.

Reazione a catena della polimerasi digitale a goccioline: un metodo per generare reazioni di PCR con nanogocce per rilevare rare mutazioni tumorali

Questo video descrive la tecnica di amplificazione del DNA a singolo filamento utilizzando microsfere polimeriche rivestite di oligonucleotidi in una reazione a provetta singola. Questo processo produce DNA puro a filamento singolo, che può essere ulteriormente utilizzato per il sequenziamento del DNA e l'analisi di microarray.

Reazione a catena della polimerasi a microsfera per amplificare il DNA a filamento singolo

Questo video dimostra la tecnica di reazione a catena della polimerasi a goccioline multiplex per la quantificazione simultanea di regioni di DNA metilato in diverse popolazioni di globuli bianchi come biomarcatore precoce per la diagnosi clinica e la prognosi.

Reazione a catena della polimerasi Multiplex Droplet per rilevare la metilazione del DNA nei leucociti

Questo video dimostra l'utilità della PCR digitale in un formato chip-in-a-tube per il rilevamento di variazioni di singoli nucleotidi nei campioni di DNA. Una singola reazione di PCR è suddivisa in camere che agiscono come reazioni PCR indipendenti e il rilevamento dei segnali di fluorescenza dai bersagli amplificati nelle camere viene utilizzato per calcolare la frequenza dell'allele variante nel campione.

PCR digitale basata su chip-in-a-tube per la quantificazione di varianti a singolo nucleotide

Descriviamo un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura semplificata (analogica). Misuriamo la fluorescenza di massa di saggi digitali basati su goccioline utilizzando una macchina qPCR standard piuttosto che una strumentazione specializzata e confermiamo i nostri risultati mediante microscopia.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Cella singola sequenza rivela eterogeneità genotipica nei sistemi biologici, ma le attuali tecnologie mancano la velocità effettiva necessaria per la profonda analisi della funzione e della composizione della Comunità. Qui, descriviamo un workflow di microfluidica per sequenziamento &gt; 50.000 unicellulare genomi da diverse popolazioni cellulari.

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le alterazioni genetiche multiple di una regione di destinazione in una singola reazione usando drop-off ddPCR e un paio di idrolisi sonde uniche.

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Marcatori epigenetici sono utilizzati per sottotipi di globuli bianchi (WBC) attraverso la quantificazione dei modelli di metilazione del DNA. Questo protocollo presenta un metodo di reazione a catena di polimerasi a goccia multiplex (mdPCR) utilizzando un dispositivo microfluidometro termoplastico (TPE) per la generazione di droplet che consente una quantificazione mirata precisa e multiplex specifica della metilazione dei conteggi differenziali WBC.

Metilazione specifica Multiplex Droplet PCR utilizzando Polymer Droplet Generator Device per la diagnostica ematologica

I saggi di goccioline acqua-in-olio sono utili per la chimica analitica, l'evoluzione enzimatica e l'analisi di singole cellule, ma in genere richiedono microfluidica per formare le goccioline. Qui, descriviamo l'emulsificazione modellata con particelle, un approccio privo di microfluidi per eseguire saggi di goccioline.

L'emulsione con modellazione di particelle consente saggi di goccioline prive di microfluidi

Scopri un metodo di microfluidica a goccia con microsfere di poliacrilammide per l'amplificazione PCR, che produce DNA a filamento singolo senza separazione aggiuntiva. Utile per diagnosi e terapia.

Un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-PCR amplificazione per ampliconi di DNA Single-Stranded

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