Facendo indotta da coniugazione PEGylated Virus-come le particelle fluorescenti di chimica Dibromomaleimide-disolfuro
27 maggio 2018
Qui, presentiamo una procedura per funzionalizzare fluorescente disolfuri su Qβ VLP con dibromomaleimide. Descriviamo Qβ espressione e purificazione, la sintesi di molecole dibromomaleimide-funzionalizzate e la reazione di coniugazione tra dibromomaleimide e Qβ. La particella coniugata fluorescente gialla risultante utilizzabile come una sonda a fluorescenza all'interno delle cellule.
L'obiettivo generale di questo metodo di bioconjugazione è quello di funzionalizzare in modo fluorescente particelle simili a virus contenenti disolfuri. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la reazione di bioconjugazione per particelle simili a virus che presentano un numero limitato di residui amminoacidici suscettibili di funzionalizzazione. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che, mediante una singola reazione, è possibile introdurre nuovi gruppi funzionali e formare contemporaneamente fluorofori indotti dalla coniugazione. Oltre al Q-Beta, riteniamo che questa reazione possa essere applicata a qualsiasi particella simile a virus che possieda legami disolfuro.
Prima di iniziare la procedura per l'espressione del batteriofago Q-Beta, pulire l'area del bancone con una soluzione di candeggina:etanolo 1:1. In un ambiente asettico, preparare due colture iniziali da tre millilitri aggiungendo singole colonie di E.coli BL21 in terreno SOB. Far crescere le colture in una stanza a 37 gradi Celsius e umidità relativa 0% con agitazione a 250 giri al minuto per tutta la notte. Il giorno successivo, rimuovere entrambe le colture iniziali da tre millilitri dallo shaker e, in un ambiente asettico, versare ciascuna coltura iniziale in un matraccio Erlenmeyer da due litri con deflettori contenente un litro di terreno SOB fresco. Posizionare i due matracci con terreno inoculato su uno shaker a 250 giri al minuto nella stanza a 37 gradi Celsius e umidità relativa 0%. Far crescere i batteri fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri, o OD 600, compresa tra 0,9 e 1,0. Ciò richiede solitamente circa cinque ore. Quando le colture hanno raggiunto l'OD 600 desiderato, utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere un millilitro di IPTG uno-molare a ciascun matraccio per indurre l'espressione proteica. Lasciare i matracci sullo shaker nella stanza calda per tutta la notte.
La mattina seguente, rimuovere i flaconi dall'agitatore, trasferire il contenuto di ciascun flacone in una bottiglia da un litro e centrifugare a 20.621 ×g a quattro gradi Celsius per un'ora per raccogliere le cellule. Al termine della centrifugazione, scartare il soprannatante versandolo in un flacone con circa cinque millilitri di candeggina per uccidere i batteri.
Per raccogliere il pellet cellulare, utilizzare una spatola per raschiare il pellet dal fondo della provetta da centrifuga e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.
Per iniziare la procedura di purificazione del Q-Beta, risospendere ogni pellet cellulare con 20-30 millilitri di tampone fosfato di potassio 0,1 molare, pH 7. Assicurarsi che la risospensione non contenga grumi. Lisare le cellule utilizzando un processore microfluidizzatore seguendo il protocollo del produttore. Lisare le cellule almeno due volte per aumentare il rendimento delle particelle. Trasferire i lisati in bottiglie da centrifuga da 250 millilitri e centrifugare a 20.621 ×g a quattro gradi Celsius per un'ora. Misurare il volume del soprannatante in millilitri. Moltiplicare tale valore per 0,265 e aggiungere al soprannatante la quantità corrispondente in grammi di solfato di ammonio. Aggiungere una barretta magnetica e agitare su un agitatore magnetico a 200 giri al minuto a quattro gradi Celsius per almeno un'ora per precipitare le proteine. Centrifugare in bottiglie da 250 millilitri a 20.621 ×g a quattro gradi Celsius per un'ora. Scartare il soprannatante e risospendere il pellet con circa 40 millilitri di tampone fosfato di potassio 0,1 molare, pH 7. Aggiungere al campione grezzo volumi uguali di cloroformio:n-butanolo 1:1 e mescolare mediante vortex per alcuni secondi. Trasferire la miscela in un tubo da 38 millilitri. Centrifugare a 20.621 ×g a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzare una pipetta per recuperare lo strato acquoso superiore. Prestare attenzione a non prelevare alcuna parte dello strato gelatinoso formato tra gli strati acquoso e organico.
Successivamente, scongeliare gradienti di saccarosio pre-confezionati dal 65 al 40%. Caricare circa due millilitri dell'estratto su ciascun gradiente.
Ultracentrifugare a 99.582 ×g a quattro gradi Celsius per 16 ore con decelerazione libera. Al termine dell'ultracentrifugazione, illuminare con una luce a diodo a emissione luminosa ogni provetta per verificare la presenza di una banda blu. Utilizzare una siringa con ago lungo per recuperare queste particelle. Ultracentrifugare nuovamente le particelle a 370.541 ×g a quattro gradi Celsius per 2,5 ore. Il pellet risultante di particelle purificate dovrebbe essere trasparente. Scartare il soprannatante e risospendere il pellet con tampone fosfato di potassio 0,1 molare, pH 7.
Questo schema mostra la coniugazione che verrà dimostrata. Per ridurre tutti i disolfuri e generare le capside Q-Beta ridotte a temperatura ambiente in un'ora, si utilizzano 10 equivalenti di Tris(2-carbossietil)fosfina o TCEP rispetto ai disolfuri presenti in un milligrammo di Q-Beta. Poco prima della riduzione dei disolfuri su Q-Beta, preparare una soluzione fresca di TCEP.
Sciogliere 0,002 grammi di TCEP e un millilitro di acqua ultrapura per preparare una soluzione madre 100X. Aggiungere 200 microlitri di Q-Beta a cinque milligrammi per millilitro in un tubo da microcentrifuga. Successivamente, aggiungere 20 microlitri della soluzione madre di TCEP 100X nel tubo da microcentrifuga. Incubare a temperatura ambiente per un'ora.
Nel frattempo, preparare la soluzione di dibromo-maleimide polietilene glicole o DB-PEG per la successiva reazione di ri-bridging dei disolfuri ridotti. Sciogliere 0,0017 grammi di DB-PEG in 100 microlitri di dimetilformammide. Aggiungere 680 microlitri di soluzione di fosfato di sodio 10 millimolare, pH 5. Successivamente, aggiungere il Q-Beta ridotto alla soluzione di DB-PEG e osservare il processo di mescolamento sotto una lampada UV portatile a 365 nanometri. Immediatamente dopo il mescolamento, dovrebbe rendersi visibile una fluorescenza giallo brillante. Lasciare procedere la reazione a temperatura ambiente su un agitatore rotante per tutta la notte.
La mattina seguente, purificare la miscela di reazione mediante filtro centrifugo utilizzando PBS 1X a 3.283 ×g a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Infine, monitorare la coniugazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS in condizioni non riducenti ed elettroforesi su gel di agarosio nativo.
La coniugazione di DB-PEG su Q-Beta è stata confermata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS in condizioni non riducenti, con rilevamento in UV e colorazione con blu di Coomassie. Tutte le bande fluorescenti si sovrappongono alla colorazione con blu di Coomassie, indicando una coniugazione avvenuta con successo. L'integrità dei coniugati Q-Beta-PEG è stata confermata mediante elettroforesi su gel di agarosio nativo e microscopia elettronica a trasmissione.
L'immagine superiore mostra Q-Beta-maleimide o Q-Beta-M e l'immagine inferiore mostra Q-Beta-PEG. La spettroscopia di fluorescenza di Q-Beta-M e Q-Beta-PEG in tampone fosfato di potassio 0,1 M ha evidenziato un massimo di eccitazione intorno a 400 nanometri e un massimo di emissione compreso tra 540 e 550 nanometri. Quando Q-Beta-PEG è stato incubato con cellule di macrofagi murini in mezzo DMEM privo di siero, seguito da colorazione nucleare, le immagini di co-localizzazione mostrano che le particelle fluorescenti gialle sono state internalizzate dalle cellule e possono essere tracciate dopo quattro ore di incubazione.
Al contrario, le particelle simili a virus Q-Beta non funzionalizzate mostrano una fluorescenza trascurabile.
Questo protocollo può aiutare i ricercatori a purificare il Q-Beta in quattro giorni ed eseguire la reazione di coniugazione a ponte incrociato durante la notte. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la reazione di coniugazione funziona meglio in condizioni acide, come un pH di 5.
Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come purificare il VLP Q-Beta e ricostituire i legami disolfuro con composti dibromo-maleimide per ottenere un VLP marcato con un fluorocromo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha fornito ai ricercatori un ulteriore sito funzionale che può essere utilizzato per funzionalizzare in modo doppio la superficie esterna del batteriofago Q-Beta.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un metodo di bioconiugazione per funzionalizzare in modo fluorescente particelle simili a virus contenenti disolfuro, in particolare le VLP di Qβ. La tecnica consente l'introduzione di nuovi gruppi funzionali e la formazione di fluorofori indotti da coniugazione in un'unica reazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biocongiugazione
- Particelle simili a virus
- Etichettatura fluorescente
Sfondo
- I legami disolfuro nelle particelle simili a virus limitano le opzioni di funzionalizzazione.
- I sonde fluorescenti sono essenziali per gli studi cellulari.
- Il batteriofago Qβ funge da modello per questo metodo.
- Le tecniche asettiche sono fondamentali per esperimenti di successo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per funzionalizzare i disolfuri su VLP Qβ.
- Permettere lo studio di reazioni di bio-coniugazione in particelle simili a virus.
- Creare sonde fluorescenti per applicazioni cellulari.
Metodi Utilizzati
- Espressione e purificazione del batteriofago Qβ.
- Sintesi di molecole funzionalizzate con dibromomaleimide.
- Reazione di coniugazione tra dibromomaleimide e Qβ.
- Utilizzo di tecniche asettiche nella preparazione della coltura iniziale.
Risultati principali
- Funzionalizzazione fluorescente riuscita di VLPs Qβ.
- Formazione di particelle coniugate fluorescenti gialle.
- Potenziale applicazione del metodo ad altre particelle simili a virus.
- Dimostrazione di una singola reazione che introduce multipli gruppi funzionali.
Conclusioni
- Il metodo etichetta in modo efficace con fluorescenza particelle simili a virus contenenti ponti disolfuro.
- Questa tecnica può migliorare lo studio della bioconiugazione in virologia.
- Applicazioni future potrebbero estendersi a varie particelle simili a virus dotate di legami disolfuro.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale per gli Esperti
Questo metodo consente la doppia funzionalizzazione di particelle simili a virus introducendo ligandi sintetici e generando fluorescenza intrinseca in un unico passaggio, risolvendo il problema delle limitate opzioni di bioconiugazione disponibili su VLP ricchi di disolfuri. I sonde fluorescenti ottenute supportano studi sull'assorbimento cellulare e il tracciamento in tempo reale in vitro, migliorando le procedure di validazione del bersaglio e di sviluppo dei saggi. Espandendo il toolkit chimico per la modifica delle VLP, la tecnica aumenta l'affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sul rilascio del carico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante funzionalizzazione sito-specifica di legami disolfuro esposti al solvente sui VLP.
- Valore operativo: Combina l'attacco del ligando e la generazione del fluoroforo in una singola reazione, semplificando la sintesi di sonde per studi sull'interazione con il bersaglio.
- Valore predittivo: Produce VLP fluorescenti tracciabili che supportano saggi di internalizzazione cellulare e modellizzazione della biodistribuzione.
Screening e Sviluppo di Saggi
- Valore scientifico: Produce lotti standardizzati di VLP marcati con fluorescenza, adatti per analisi ad alto contenuto e saggi di legame.
- Valore operativo: Utilizza set di filtri disponibili in commercio (eccitazione ~400 nm, emissione 540–550 nm) per una rilevazione semplice, senza necessità di strumentazione personalizzata.
- Scalabilità: Consente la preparazione di librerie di sonde per studi sulle relazioni struttura-attività nelle interazioni ligando-recettore.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: I VLP fluorescenti dimostrano un'internalizzazione cellulare in modelli di macrofagi, supportando la caratterizzazione della biodistribuzione e della farmacocinetica.
- Riduzione del rischio: Consente la valutazione delle modifiche superficiali sulla stabilità dei VLP e sul riconoscimento immunitario prima di studi in vivo.
- Allineamento con biomarcatori: Permette di correlare la localizzazione dei VLP con marcatori cellulari nei flussi di lavoro di imaging di co-localizzazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla produzione di VLP all'identificazione del capostazione, consentendo una rapida generazione di sonde funzionalizzate per analisi di screening a valle e studi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo una doppia modificazione dei VLP con gruppi funzionali per il tracciamento e attività terapeutiche.
- Screening: Genera VLP fluorescenti standardizzati per saggi quantitativi di legame e internalizzazione.
- Analisi: Fornisce letture basate sulla fluorescenza per quantificare le interazioni tra VLP e cellule e l'efficienza di coniugazione.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici attraverso la valutazione dimostrata dell'assorbimento da parte dei macrofagi e della stabilità.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma modulare per la funzionalizzazione dei VLP applicabile a diversi sistemi contenenti disolfuri.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo consentendo sonde VLP precise e tracciabili per studi sul meccanismo d'azione.
- Valore operativo: Standardizza la coniugazione in condizioni acide definite (pH 5) per garantire riproducibilità tra diversi lotti.
- Valore strategico: Riduce la necessità di fasi separate di marcatura e purificazione, migliorando l'efficienza del capitale nello sviluppo delle sonde.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce un avanzamento ponderato rispetto al rischio fornendo dati funzionali precoci su costrutti basati su VLP.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nell'espressione proteica, nella purificazione e nella manipolazione anaerobica di proteine contenenti disolfuri.
- Necessita dell'accesso a microfluidizzatori, ultracentrifughi e sistemi di rilevamento della fluorescenza dotati di set di filtri appropriati.
- Richiede tecnica asettica e consapevolezza riguardo agli endotossini per applicazioni cellulari.
- Potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione nell'estensione alle VLP con diversa accessibilità dei disolfuri o carica superficiale variabile.
- Limitazione pratica: l'efficienza dipende dal mantenimento di condizioni riducenti durante il ripristino dei ponti disolfuro e dall'evitare il degrado ossidativo.
