Facendo indotta da coniugazione PEGylated Virus-come le particelle fluorescenti di chimica Dibromomaleimide-disolfuro

Qui, presentiamo una procedura per funzionalizzare fluorescente disolfuri su Qβ VLP con dibromomaleimide. Descriviamo Qβ espressione e purificazione, la sintesi di molecole dibromomaleimide-funzionalizzate e la reazione di coniugazione tra dibromomaleimide e Qβ. La particella coniugata fluorescente gialla risultante utilizzabile come una sonda a fluorescenza all'interno delle cellule.

L'obiettivo generale di questo metodo di bioconiugazione è quello di funzionalizzare in modo fluorescente particelle simili a virus contenenti disolfuro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella reazione di bioconiugazione per particelle simili a virus che hanno un numero limitato di residui di amminoacidi che possono essere funzionalizzati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizzando una reazione possono essere introdotti nuovi gruppi funzionali e allo stesso tempo possono essere formati fluorofori indotti dalla coniugazione.

Oltre a QBeta, riteniamo che questa reazione possa essere applicata a qualsiasi particella simile a un virus che possieda legami disolfuro. Prima di iniziare la procedura per l'espressione del batteriofago QBeta, pulire l'area del banco con una soluzione 1:1 di candeggina:etanolo. In un ambiente asettico, effettuare due colture starter da tre millilitri aggiungendo singole colonie di E.coli BL21 in terreni SOB.

Coltiva le colture in una stanza a 37 gradi Celsius e 0% di umidità relativa con agitazione a 250 giri/min durante la notte. Il giorno seguente, rimuovere entrambe le colture starter da tre millilitri dall'agitatore e in un ambiente asettico versare ciascuna coltura starter in un pallone di Erlenmeyer deflettore da due litri con un litro di terreno SOB fresco. Posizionare i due palloni di terreno inoculato su un agitatore a 250 giri/min nella stanza a 37 gradi Celsius e 0% di umidità relativa.

Far crescere i batteri fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri o OD 600 da 0,9 a 1,0. Questo di solito richiede circa cinque ore. Quando le colture hanno raggiunto l'OD 600 desiderato, utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere un millilitro di IPTG a un molare a ciascun pallone per indurre l'espressione proteica.

Lasciare le fiasche sullo shaker nella stanza calda per una notte. La mattina seguente, rimuovere i palloni dall'agitatore, trasferire il contenuto di ogni pallone in una bottiglia da un litro e centrifugare a 20,621 volte la gravità a quattro gradi Celsius per un'ora per raccogliere le cellule. Al termine della centrifugazione, scartare il surnatante versandolo in un pallone con circa cinque millilitri di candeggina per uccidere i batteri.

Per raccogliere il pellet della cella, utilizzare una spatola per raschiare il pellet della cella dal fondo del flacone della centrifuga e trasferire il pellet in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Per iniziare la procedura di purificazione QBeta, risospendere ogni pellet cellulare con 20-30 millilitri di tampone fosfato di potassio 0,1 molare, pH 7. Assicurati che la risospensione non abbia blocchi.

Lisi le cellule utilizzando un processore microfluidizzatore secondo il protocollo del produttore. Lisi le cellule almeno due volte per aumentare la resa delle particelle. Trasferire i lisati in flaconi da centrifuga da 250 millilitri e centrifugare a 20, 621 volte la gravità a quattro gradi Celsius per un'ora.

Misurare il volume del surnatante in millilitri. Moltiplica quel valore per 0,265 e poi aggiungi al surnatante quella quantità in grammi di solfato di ammonio. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare su una piastra di agitazione a 200 giri/min a quattro gradi Celsius per almeno un'ora per far precipitare le proteine.

Centrifugare in bottiglie da 250 millilitri a 20,621 volte la gravità a quattro gradi Celsius per un'ora. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con circa 40 millilitri di tampone fosfato di potassio 0,1 molare, pH 7. Aggiungere al campione grezzo volumi uguali di cloroformio:n-butanolo 1:1 e mescolare agitando per alcuni secondi.

Trasferire il composto in un tubo da 38 millilitri. Centrifugare a 20, 621 volte la gravità a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzare una pipetta per recuperare lo strato acquoso superiore.

Fai attenzione a non prendere lo strato gelatinoso che si è formato tra gli strati acquosi e organici. Quindi, scongelare sei gradienti di saccarosio preconfezionati dal 5 al 40%. Caricare circa due millilitri di estratto su ogni gradiente.

Ultracentrifuga a 99, 582 volte la gravità a quattro gradi Celsius per 16 ore con decelerazione libera. Al termine dell'ultracentrifugazione, posizionare una luce a diodo emettitore di luce sotto ciascun tubo per confermare che sia visibile una banda blu. Utilizzare una siringa ad ago lungo per recuperare queste particelle.

Ultra-pellet le particelle a 370, 541 volte la gravità a quattro gradi Celsius per 2,5 ore. Il pellet risultante di particelle purificate deve essere trasparente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con tampone fosfato di potassio 0,1 molare, pH 7.

Questo schema mostra la coniugazione che verrà dimostrata. 10 equivalenti di Tris(2-carbossietil)fosfina o TCEP relativi ai disolfuri in un milligrammo di QBeta vengono utilizzati per ridurre tutti i disolfuri e generare i capsidi QBeta ridotti a temperatura ambiente in un'ora. Poco prima della riduzione dei disolfuri su QBeta, preparare una nuova soluzione di TCEP.

Sciogliere 0,002 grammi di TCEP e un millilitro di acqua ultrapura per ottenere una soluzione madre 100X. Aggiungere 200 microlitri di cinque milligrammi per millilitro QBeta in una provetta da microcentrifuga. Quindi, aggiungere 20 microlitri della soluzione madre 100X TCEP alla provetta per microcentrifuga.

Incubare a temperatura ambiente per un'ora. Nel frattempo, preparare la soluzione di polietilenglicole dibromomaleimmide o DB-PEG per la successiva reazione di ricollegamento dei disolfuri ridotti. Sciogliere 0,0017 grammi di DB-PEG in 100 microlitri di dimetilformammide.

Aggiungere 680 microlitri di soluzione di fosfato di sodio da 10 millimolari, pH 5. Quindi, aggiungere il QBeta ridotto alla soluzione di DB-PEG e osservare il processo di miscelazione sotto una lampada UV portatile a 365 nanometri. Dopo la miscelazione, dovrebbe essere immediatamente visibile una fluorescensità giallo brillante.

Lasciare che la reazione proceda a temperatura ambiente su un girarrosto per una notte. La mattina seguente, purificare la miscela di reazione mediante filtro centrifugo utilizzando 1X PBS a 3, 283 volte la gravità a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Infine, monitorare la coniugazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS non riducente ed elettroforesi nativa su gel di agarosio.

La coniugazione di DB-PEG su QBeta è stata confermata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS non riducente mediante colorazione UV e blu di Coomassie. Tutte le bande fluorescenti sono co-localizzate con la colorazione blu di Coomassie, rappresentando una coniugazione di successo. L'integrità dei coniugati QBeta-PEG è stata confermata dall'elettroforesi su gel di agarosio nativo e dalla microscopia elettronica a trasmissione.

La micrografia in alto mostra QBeta-maleimmide o QBeta-M e la micrografia in basso mostra QBeta-PEG. La spettroscopia di fluorescenza di QBeta-M e QBeta-PEG in 0,1 molari di tampone fosfato di potassio ha mostrato un massimo di eccitazione intorno ai 400 nanometri e un massimo di emissione intorno ai 540-550 nanometri. Quando QBeta-PEG è stato incubato con cellule macrofagiche di topo in terreno DMEM privo di siero seguito da nucleocolorazione, le immagini di co-localizzazione mostrano che le particelle fluorescenti gialle sono state assorbite dalle cellule e possono essere tracciate dopo quattro ore di incubazione.

Al contrario, le particelle simili al virus QBeta non funzionalizzate mostrano fluorescense trascurabile. Questo protocollo può aiutare i ricercatori a purificare QBeta in quattro giorni ed eseguire la reazione di coniugazione re-bridging notturna. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la reazione di coniugazione funziona meglio in condizioni acide, come il pH 5.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare QBeta VLP e ricollegare i legami disolfuro con composti dibromomaleimmide per creare un VLP marcato in fluorescenza. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha fornito ai ricercatori un'ulteriore maniglia funzionale che può essere utilizzata per funzionalizzare la superficie esterna del batteriofago QBeta.