Name: Facendo indotta da coniugazione PEGylated Virus-come le particelle fluorescenti di chimica Dibromomaleimide-disolfuro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Scopri un metodo di bioconiugazione per funzionalizzare fluorescentemente le particelle simil-virali contenenti disolfuro usando Qβ. Questa tecnica introduce nuovi gruppi funzionali e forma fluorofori in una sola reazione.

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J.J.G. riconosce la National Science foundation (DMR-1654405) e cancro Prevenzione Research Institute del Texas (CPRIT) (RP170752s) per il loro sostegno.

1. preparazione
<ol><li>Fare agar di brodo (LB) di Lisogenesi e versate piastre12.</li>
	<li>
Trasformare BL21 (DE3) con un plasmide pET28 contenente la sequenza della proteina di wtQβ cappotto.
	<ol>
<li>Scongelare e. coli BL21 (DE3) cellule competenti in un bagno di ghiaccio. Mettere 50 μL di cellule in un tubo del microcentrifuge.</li>
		<li>Aggiungere 2 μL del plasmide in una provetta e flick delicatamente il tubo. Quindi Incubare in ghiaccio per 30 min.</li>
		<li>Shock termico delle celle per 45 s in un bagno di acqua che è esattamente a 42 ° c. Collocare la provetta nel bagno di ghiaccio subito dopo calore-scioccante e incubare per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere 950 μL di LB media che non contiene alcun antibiotico.</li>
		<li>Scuotere la cultura a 200 giri/min per 60 min a 37 ° C.</li>
		<li>Piatto 100 μL della coltura su piastre di agar LB (con kanamicina) e incubare la piastra durante la notte a 37 ° C. Selezionare colonie bianchi quando necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fai Super ottimale brodo (SOB) media.
	<ol>
<li>Autoclave due 2 L sconcertato matracci di Erlenmeyer su un ciclo di superdry.</li>
		<li>In un ambiente asettico, pesare e aggiungere 20,0 g di tryptone, Estratto di 5,0 g di lievito, 2,469 g di solfato di magnesio anidro, 0,584 g di cloruro di sodio e 0,186 g di cloruro di potassio in ciascuno dei palloni.</li>
		<li>Portare il volume a 1 L con acqua ultrapura in ogni boccetta ed autoclave sul ciclo liquido.</li>
		<li>Una volta che i media SOB ha raggiunto la temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di kanamicina (100 mg/mL) per ogni litro di media e conservare a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare il tampone di fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
	<ol>
<li>Fanno 1 M potassio monobasico soluzione sciogliendo 68,045 g di potassio monobasico in 500 mL di acqua ultrapura.</li>
		<li>Fanno 1 M potassio bibasico soluzione sciogliendo 87,09 g di potassio bibasico in 500 mL di acqua ultrapura.</li>
		<li>Aggiungere 38,5 mL di soluzione di potassio monobasico e 61,5 mL di potassio bibasico per una bottiglia da 1 litro.</li>
		<li>Regolare il pH a 7.00 se necessario e portare a un volume di 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fai 5 – 40% pendenze del saccarosio in tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
	<ol>
<li>In provette da 50 mL centrifuga, preparare soluzioni con saccarosio 5 – 40% (in aumento in incrementi del 5%) dissolto in tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).</li>
		<li>Deposito 3,3 mL di soluzione di 5% di saccarosio nella parte inferiore di un tubo di policarbonato di turno-fondo 38 mL utilizzando una siringa ago lungo e ripetere questa operazione per cinque altri tubi.</li>
		<li>Depositare con attenzione 3,3 mL di soluzione di saccarosio di 10% nella parte inferiore del tubo e rimuovere con cautela l'ago per non disturbare la sfumatura. Ripetere per gli altri cinque tubi. 
		 </li>
	</ol>
</li>
	<li>Continuare depositare strati di 3,3 mL delle soluzioni di saccarosio, in aumento dal 15% al 40% in ogni provetta, pur essendo prudente per non disturbare la sfumatura.</li>
	<li>Al termine, coprire le cime dei gradienti con lamina e conservare a-80 ° C.</li>
</ol>2. espressione di Qβ
<ol><li>Pulire la zona di panca con 1:1. candeggina/etanolo.</li>
	<li>Fai due colture starter di 3 mL in ambiente asettico aggiungendo singole colonie di e. coli BL21 (DE3) in 3 mL di media SOB in ambiente asettico.</li>
	<li>Crescere su un agitatore a 250 rpm in una stanza 37 ° C e 0% di umidità relativa (rH) durante la notte.</li>
	<li>
Inoculare coltura starter media SOB:
	<ol>
<li>Togliere entrambe colture starter 3ml shaker e, in un ambiente asettico, versare ogni coltura starter in uno dei due 2 L sconcertato matracci di Erlenmeyer con 1 L di fresco media SOB in ciascuno.</li>
		<li>Posizionare il supporto di inoculate su un agitatore a 250 rpm in una camera di 37 ° C e 0% rH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescere i batteri su un agitatore a 250 rpm in una camera di 37 ° C e 0% rH OD600 fino a 0,9-1,0.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di 1 M isopropilico β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) usando una pipetta P1000 per indurre l'espressione della proteina.</li>
	<li>Lasciare i media sull'agitatore a 250 rpm in una camera di 37 ° C e 0% rH durante la notte.</li>
	<li>Rimuovere dal shaker la mattina seguente e centrifuga utilizzando flaconi da 1000 mL a 20.621 × g per 1 h a 4 ° C per raccogliere le cellule.</li>
	<li>
Scartare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare.
	<ol>
<li>Versare il surnatante in una boccetta con circa 5 mL di candeggina per uccidere i batteri. Si tratta di rifiuti.</li>
		<li>Utilizzare una spatola per raschiare il pellet cellulare dalla parte inferiore della bottiglia della centrifuga e mettere la pallina in una provetta da centrifuga 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. purificazione di Qβ
<ol><li>Risospendere il pellet cellulare con ~ 20 – 30 mL di tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).</li>
	<li>Assicurarsi che la risospensione non ha nessun blocchi e lisare le cellule utilizzando un processore microfluidizer secondo il protocollo del produttore (Vedi Tabella materiali). Lisare le cellule almeno due volte per aumentare la resa delle particelle.</li>
	<li>Centrifugare il lisato in flaconi da 250 mL Centrifuga a 20.621 x g per 1 ora a 4 ° C.</li>
	<li>Scartare il pellet e misurare il volume del surnatante in mL. Moltiplicare tale valore per 0,265 e aggiungere che la quantità di g di solfato di ammonio al supernatante.</li>
	<li>Mescolare a 4 ° C per almeno 1 h su una zolla di mescolare a 200 giri/min per precipitare le proteine.</li>
	<li>Centrifugare in flaconi da 250 mL a 20.621 x g per 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminare il surnatante e risospendere il sedimento con circa 10 mL di tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).</li>
	<li>Aggiungere volumi uguali di 1:1 cloroformio/n-butanolo campione grezzo e mescolare nel Vortex per pochi secondi.</li>
	<li>Centrifugare a provette mL 38 a 20.621 × g per 30 minuti a 4 ° C.</li>
	<li>Recuperare lo strato acquoso superiore utilizzando una pipetta Pasteur. Fare attenzione a non prendere uno qualsiasi del gel come strato che si è formata tra lo strato acquoso e organico.</li>
	<li>Scongelare i sei pendenze del saccarosio pre-fatte di 5-40% e caricare circa 2 mL di estratto su ciascuno.</li>
	<li>Ultracentrifuga a 99.582 x g per 16 h a 4 ° C con decelerazione gratis.</li>
	<li>Brillare di una luce che emettono luce a diodi (LED) sotto ogni tubo e una banda blu dovrebbe diventare visibile. Recuperare queste particelle con una lungo ago siringa.</li>
	<li>Ultrapellet le particelle a 370.541 x g per 2,5 ore a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminare il supernatante e risospendere il pellet trasparente delle particelle purificate con tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).</li>
</ol>4. quantificazione e conferma del prodotto
<ol><li>Utilizzare analisi di Bradford per quantificare il prodotto13.</li>
	<li>Esecuzione di riduzione e non riducenti sodio dodecil solfato elettroforesi del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) per confermare il prodotto14. Nota: Riduzione dello SDS-PAGE viene utilizzato per confermare il peso molecolare della proteina del cappotto; non-riduzione dello SDS-PAGE è quello di confermare la struttura di ordine superiore.</li>
</ol>5. coniugazione composti DB su Qβ
<ol><li>
Ridurre disolfuri su Qβ.
	<ol>
<li>Sciogliere 0,0020 g di tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) in 1 mL di acqua ultrapura per rendere una soluzione stock di 100 x. Nota: Preparare fresco TCEP prima riduzione.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di Qβ (5 mg/mL) in un tubo del microcentrifuge.</li>
		<li>Seguire con l'aggiunta di 20 µ l di soluzione madre di 100 x TCEP.</li>
		<li>Incubare a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ri-ponte disolfuro ridotta utilizzando dibromomaleimide polietilenglicole (DB-PEG).
	<ol>
<li>Sciogliere 0,0017 g dibromomaleimide-polietilenglicole (DB-PEG) in 100 µ l di DMF.</li>
		<li>680 µ l di soluzione di sodio fosfato 10 mM (pH 5,00).</li>
		<li>Aggiungere ridotto Qβ nella soluzione di DB-PEG e osservare il processo di miscelazione sotto una lampada a UV 365 nm. La fluorescenza gialla luminosa possa essere visualizzata immediatamente con una lampada palmare UV 365 con la miscelazione di nm.</li>
		<li>Lasciare che la reazione procedere durante la notte a temperatura ambiente (TA) su un girarrosto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificare la miscela di reazione dal filtro centrifugo (COMW = 10 kDa) tre volte utilizzando 1X PBS a 3.283 x g per 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Monitorare la coniugazione non riducenti SDS-PAGE e l'elettroforesi del gel dell'agarosi nativo. Nota: VLP eseguire come particelle intatte in gel di agarosio nativo, e sono separati base alla loro carica, dimensione e forma.</li>
</ol>

<ol><li>Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Virus-Based+Polymer-Protein+Nanoparticles+by+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).</li>
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<li>Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functionalized+Bacteriophage+Q%CE%B2+as+a+Photocaged+Drug+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier.</a> Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Rispetto al più piccolo purificazione della proteina, un unico passo a depurare il batteriofago Qβ è la centrifugazione in gradiente di saccarosio. Dopo la fase di estrazione di cloroformio/n-butanolo, Qβ viene ulteriormente purificato usando 5-40% pendenze del saccarosio. Durante la centrifugazione, le particelle vengono separate in base alle loro dimensioni. Le particelle più grandi in viaggio per la regione di densità superiore, mentre le particelle più piccole soggiorno nella regione più bassa densità. Qβ viaggia al ...

Utilizzando nano-dimensioni capsidi virali è emerso come un campo emozionante, che mira ad ampliare la portata delle applicazioni nella ricerca biomedica1,2,3. Recombinantly espresse particelle simili al virus (VLPs) sono strutturalmente derivate dai virus, ma mancano il materiale genetico virale originale che li rende non infettive nanoparticelle proteinica. Come le caratteristiche della superficie sono geneticamente programmate e ogni capside è espresso in modo identico a quelli prima e dopo di esso, è possibile conoscere la posizione e il numero delle catene laterali reattivi degli aminoacidi con precisione atomistica. In molti casi, entrambe le superfici interne ed esterne possiedono molti generi di solvente esposta dell'amminoacido residui che possono essere funzionalizzati concretamente attraverso reazioni di bioconjugation - reazioni che formano legami covalenti tra una biomolecola e un sintetico molecola4,5.
Reazioni di bioconjugation aiutano biomolecole di interesse hanno funzionalità più diversificata in modo relativamente semplice. Molecole di interesse, come farmaci terapeutici6, fluorescente tag7 e polimeri8,9 possono essere pre-sintetizzati e caratterizzati prima sono attaccati sulla superficie di VIP. Un VLP particolarmente comune in biomedica e biomateriali la ricerca è stata la VLP basato su batteriofago Qβ, che, come recombinantly espresso, è un 28 nm icosaedrica del capside virale10. I più comuni siti di reazione su Qβ sono lisine con un ampio margine, anche se recentemente abbiamo comunicato la coniugazione successo11 dibromomaleimide composti per la ridotte disolfuri che costeggiano i pori di Qβ tramite una reazione di Haddleton-Baker. La reazione procede con una buona resa e, altrettanto importante, senza perdere la stabilità termica delle particelle. Allo stesso tempo, questa reazione genera fluorescenza indotta da coniugazione, che può essere utilizzato per monitorare l'assorbimento di queste particelle nelle cellule. In questo lavoro, dimostriamo la coniugazione di polietilenglicole (PEG) sulla superficie del Qβ attraverso la reazione di Haddleton-Baker, che si traduce in un fluoroforo giallo brillante. Queste particelle possono essere monitorate quindi come si sono presi dalle cellule. Il protocollo qui aiuterà i ricercatori a generare nuova pegilato fluorescente proteinica nanoparticelle basate su Qβ, anche se i suoi principi sono applicabili ad uno di molti altri VIP contenente solvente disolfuri esposte.

<table><tbody><tr><td>LB Brodo (Miller)&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Triptone, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio anidro</td><td>P212121</td><td>CI-06808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (cristallino/certificato ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di Potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Elga PURELAB Flex 3 Sistema di Purificazione Acqua</td><td>Fisher Scientific</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di Potassio Monobasico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di Potassio Bibasico Anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S25590B</tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX rotore...</td><td>Fisher Scientific</td><td>096-041053</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>P212121</td><td>KW-0066-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Alfa Aesar</td><td>32614-M6</td><td></td></tr><tr><td>1-butanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td></td></tr><tr><td>SW 28 Ti Rotore, benna oscillante, alluminio</td><td>Beckman Coulter</td><td>342204: SW 28 Ti Rotore / 342217: Set</td><td></td>di secchi</tr><tr><td>Tipo 70 Ti Rotore, angolo fisso, Titanio, 8 x 39 mL,</td> <td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Dosaggio delle proteine</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23200</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Cloridrato</td><td>Research Products International</td><td>T60050-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiammina</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63734-AC</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>2 3-Dibromomaleimmide 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>553603-5G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilene Glicole</td><td>Alfa Aesar</td><td>41561-22</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424375000</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide/bis-acrilammide</td><td>P212121</td><td>RP-A11310-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-100</td><td></td></tr><tr><td>FV3000 microscopio a scansione laser confocale</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV3000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Revolver Rotatore Regolabile&nbsp;</td><td>Thomas Scientific&nbsp;</td><td>1190P25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Flacone Sorvall ad alte prestazioni da 1000 mL, PC, con tappo in alluminio.</td><td>Thermo Scientific</td><td>010-1459</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Flaconi per centrifuga con tappi, polipropilene copolimero</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Provette a fondo tondo; 38 mL; PC</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380</td><td></td></tr> 2 <tr><td>L Palloni Erlenmeyer a bocca stretta con bordo per impieghi gravosi</td><td>Pyrex</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Unità di filtraggio centrifugo</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>M-110P Microfluidizer Materials Processor</td><td>Microfluidics</td><td>M-110P</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Provette per centrifuga a fondo tondo in policarbonato ad alta velocità</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia, con tappo assemblato,</td><td>Policarbonato Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>cilindro, graduato - Polipropilene 250 mL</td><td>PolyLab</td><td>80005</td><td></td></tr><tr><td>533LS-E Series Sterilizzatori</td><td>a vapore Getinge</td><td>533LS-E</td><td></td></tr><tr><td>TrueLine, piastra per colture cellulari, trattata, PS, 96 pozzetti, con coperchio</td><td>LabSource</td><td>D36-313-CS</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per centrifuga conica Falcon 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentifughi: 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>VWR Os-500 Agitatore orbitale</td><td>VWR Scientifc Products</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi Tetra Handcast</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilene, 250 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3300</td><td></td></tr><tr><td>Ago Lungo&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7693</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Siringhe da 5 a 6 cc Luer Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-46</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>P100 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipetman</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>F144802</tr><tr><td>Pesata Intel PM-100 Bilancia da laboratorio classica ad alta precisione</td> Tecnologia <td>di ponderazione intelligente</td><td>IWT_PM100</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per centrifuga conica Falcon 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Gel Mini-PROTEAN TGX, 10 pozzetti, 50 & micro; l</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1084</td><td></td></tr></tbody></table>

facendo indotta da coniugazione pegylated virus-come le particelle fluorescenti di chimica dibromomaleimide-disolfuro

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

Il recente aumento in particelle simili al virus (VLPs) in biomedica e ricerca dei materiali può essere attribuito alla loro facilità di biosintesi, dimensioni discrete, genetica programmabilità e biodegradabilità. Mentre sono altamente suscettibili di reazioni bioconjugation per l'aggiunta di ligandi sintetici sulla loro superficie, la gamma bioconjugation metodologie su questi capsidi nata acquose è relativamente limitata. Per facilitare la direzione della ricerca di biomateriali funzionali, sono da considerarsi reazioni bioconjugation non tradizionali. La reazione descritta in questo protocollo utilizza dibromomaleimides per introdurre nuove funzionalità nel solvente legami bisolfurico esposte di un VIP basati su Qβ del batteriofago. Inoltre, il prodotto finale è fluorescente, che ha il vantaggio di generare una sonda rintracciabile in vitro utilizzando un set di filtri disponibili in commercio.

I derivati di dibromomaleimide possono essere sintetizzati attraverso la reazione di condensazione tra anidride dibromomaleimide e ammine primarie15. In alternativa, un metodo sintetico mite16 utilizzando N-metossicarbonile attivato 3,4-dibromomaleimide è stata sfruttata qui reagendo con metossipolietilen glicole (PEG) a rendimento DB-PEG (Figura 1). NMR è stato utilizzato per identificare la struttura composta ...

Qui, presentiamo una procedura per funzionalizzare fluorescente disolfuri su Qβ VLP con dibromomaleimide. Descriviamo Qβ espressione e purificazione, la sintesi di molecole dibromomaleimide-funzionalizzate e la reazione di coniugazione tra dibromomaleimide e Qβ. La particella coniugata fluorescente gialla risultante utilizzabile come una sonda a fluorescenza all'interno delle cellule.

Facendo indotta da coniugazione PEGylated Virus-come le particelle fluorescenti di chimica Dibromomaleimide-disolfuro

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

L'obiettivo generale di questo metodo di bioconjugazione è quello di funzionalizzare in modo fluorescente particelle simili a virus contenenti disolfuri. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la reazione di bioconjugazione per particelle simili a virus che presentano un numero limitato di residui amminoacidici suscettibili di funzionalizzazione. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che, mediante una singola reazione, è possibile introdurre nuovi gruppi funzionali e formare contemporaneamente fluorofori indotti dalla coniugazione. Oltre al Q-Beta, riteniamo che questa reazione possa essere applicata a qualsiasi particella simile a virus che possieda legami disolfuro.Prima di iniziare la procedura per l'espressione del batteriofago Q-Beta, pulire l'area del bancone con una soluzione di candeggina:etanolo 1:1. In un ambiente asettico, preparare due colture iniziali da tre millilitri aggiungendo singole colonie di E.coli BL21 in terreno SOB. Far crescere le colture in una stanza a 37 gradi Celsius e umidità relativa 0% con agitazione a 250 giri al minuto per tutta la notte. Il giorno successivo, rimuovere entrambe le colture

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Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella

Approfittando dei progressi nello sviluppo fluoroforo e tecnologia di imaging, un metodo semplice di Alexa Fluor etichettatura dei virus dengue è stato ideato per visualizzare le prime interazioni tra virus e cellule.

Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura

Particelle di adenovirus sono progettati per contenere l'innaturale azidohomoalanine analogo dell'acido amino o lo zucchero...

Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal

Nanoparticelle vegetali virali (VNPs) sono promettenti piattaforme per le applicazioni in campo biomedico. Qui, descriviamo le modalità di propagazione delle piante VNP, purificazione, caratterizzazione e bioconjugation. Infine, mostriamo l'applicazione di VNPs per homing tumore e immagini utilizzando un modello di xenotrapianto mouse e imaging di fluorescenza.

Nanoparticelle virali per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Tumore

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Fonte: Natilla, A., e Hammond, R. W. Analisi della disponibilità al solvente dei residui di cisteina su particelle simili a virus del Maize rayado fino prodotte in piante di Nicotiana benthamiana e legame incrociato di peptidi alle particelle simili a virus. J. Vis. Exp. (2013)Questo video dimostra l'etichettatura fluorescente specifica per sito di particelle simili a virus (VLPs) mutate prodotte in Nicotiana benthamiana mediante un colorante reattivo verso i tioli, seguita da purificazione ed...

Marcatura dei residui di cisteina accessibili in superficie in particelle simil-virali ingegnerizzate

Fonte: Chen, Z., et al. Produzione di particelle simili a virus PEGilate fluorescenti indotte da coniugazione mediante chimica dibromomaleimidica-disolfuro. J. Vis. Exp. (2018)Questo video illustra il metodo per l'espressione controllata della proteina del capside del batteriofago Qβ in E. coli ingegnerizzati. Le proteine risultanti si assemblano autonomamente in particelle simili a virus, che vengono raccolte per la successiva bioconiugazione.

Produzione di particelle simili a virus in E. coli ingegnerizzati

Fonte: Chen, Z., et al. Produzione di particelle tipo virus PEGilate fluorescenti indotte da coniugazione mediante chimica dibromomaleimide-disolfuro. J. Vis. Exp. (2018)Questo video dimostra la funzionalizzazione fluorescente di particelle simili a virus mediante il ripristino di disolfuri ridotti con un legame di polietilenglicole (PEG), producendo coniugati stabili e tracciabili adatti all'imaging cellulare e al rilascio mirato in applicazioni biomediche.

Funzionalizzazione fluorescente di particelle simil-virali tramite ri-ponte dei disolfuri

Qui viene descritto un protocollo rapido e modulare per la generazione di virus vaccinia ricombinanti che esprimono simultaneamente proteine contrassegnate fluorescentmente utilizzando il metodo della selezione dominante transitoria.

Metodologia per la generazione efficiente di proteine del virus vaccinia taggate fluorescentmente

Illustriamo qui un saggio di legame della membrana in vitro in cui le interazioni tra HIV-1 Gag e le membrane lipidiche vengono analizzate visivamente utilizzando Gag con tag YFP sintetizzato in un sistema di traduzione in vitro basato su germe di grano e GUVs preparati con una tecnica di elettroformazione.

Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane

Abbiamo progettato la proteina del capside del virus di epatite E come una nanoparticella di teranostici (HEVNP). HEVNP auto-assembla in una gabbia icosahedral stabile nella consegna delle mucose. Qui, descriviamo la modifica di HEVNPs per tumore targeting modificando la superficie esposta residui di cisteine, che coniuga ligandi sintetici che legano specificamente le cellule del tumore.

Funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle di Virus di epatite E utilizzando metodi di coniugazione chimica

Scopri un metodo di bioconiugazione per funzionalizzare fluorescentemente le particelle simil-virali contenenti disolfuro usando Qβ. Questa tecnica introduce nuovi gruppi funzionali e forma fluorofori in una sola reazione.

Facendo indotta da coniugazione PEGylated Virus-come le particelle fluorescenti di chimica Dibromomaleimide-disolfuro

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