Registrazione spazialmente limitate oscillazioni nell'ippocampo dei topi di comportarsi
1 luglio 2018
Questo protocollo descrive la registrazione dei potenziali di campo locale con Multi-Tibia punte in silicio lineare. Conversione dei segnali mediante analisi di densità di corrente sorgente consente la ricostruzione dell'attività elettrica locale nell'ippocampo del mouse. Con questa tecnica, le oscillazioni nello spazio limitato del cervello possono essere studiate in topi liberi di muoversi.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come le attività della rete neuronale sono organizzate su scale temporali e spaziali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'analisi dei dati di corrente con sonde lineari al silicio consente la ricostruzione di oscillazioni locali che non possono essere facilmente rilevate nelle registrazioni convenzionali del potenziale di campo. Per iniziare questa procedura, sterilizzare gli strumenti chirurgici con uno sterilizzatore a perline calde, quindi pulire tutte le superfici di lavoro con etanolo al 70%.
Quindi, montare l'animale anestetizzato in una cornice stereotassica inserendo delicatamente le barre auricolari nel condotto uditivo. Una volta che la testa del topo è stabilizzata dalle barre auricolari, posizionare un boccaglio sopra il muso per un'erogazione continua di isoflurano, quindi applicare un unguento sugli occhi per evitare che si secchi. Successivamente, posizionare un termoforo sotto il mouse e iniettare buprenorfina per via sottocutanea per garantire l'analgesia postoperatoria.
Successivamente, rasare la testa e disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Usando le forbici chirurgiche, praticare un'incisione sulla pelle lungo la linea mediana del cranio e aprire la pelle usando le pinze chirurgiche. Allineare la testa dell'animale con l'aiuto di uno strumento di allineamento stereotassico per livellare bregma e lambda.
Ci dovrebbe essere meno di 50 micrometri di altezza di offset tra bregma e lambda. Inoltre, livellare la testa lungo l'asse mediale-laterale misurando la profondità a distanza definita dalla bregma sia sul lato sinistro che su quello destro. Regolare la testa se è inclinata.
Pulire la testina con perossido di idrogeno al 3% e asciugarla con salviettine di cotone sterili. Determinare la posizione della craniotomia rispetto alla bregma utilizzando un atlante stereotassico appropriato. Utilizzando una testa di trapano da 0,9 millimetri, praticare due fori per le viti nell'osso sopra il cervelletto per posizionare il terreno e le viti di riferimento.
Inoltre, praticare da uno a tre fori per l'ancoraggio delle viti per stabilizzare l'impianto. La posizione delle viti di ancoraggio dipenderà dalla posizione della craniotomia. Inserire le viti nell'osso utilizzando un cacciavite adatto.
Fare attenzione a non penetrare nel cervello. Ora, esegui la craniotomia assottigliando lentamente il cranio con il trapano in un'area rettangolare attorno al lato dell'impianto. Inumidire frequentemente l'osso con tampone fosfato sterilizzato.
Forare delicatamente il cranio assottigliato rimanente con un ago da iniezione calibro 27 e rimuoverlo con un paio di pinzette. Quindi, forare con cura la dura madre con un ago per iniezione calibro 27. Usando un paio di pinzette, forma un piccolo uncino piegando la punta dell'ago e usa questo gancio per rimuovere la dura.
Quindi, applicare il tampone fosfato per evitare che la superficie del cervello si secchi. Successivamente, montare lo strumento di inserimento dell'elettrodo su un supporto stereotassico e azzerare la sonda su bregma. Spostare la sonda sulle coordinate stereotassiche sopra la craniotomia e penetrare lentamente nella superficie del cervello.
Assicurarsi che gli steli della sonda non si pieghino ed evitare di impiantarli attraverso i vasi sanguigni. Quindi, abbassare lentamente la sonda fino a circa 200 micrometri sopra la profondità desiderata. Quindi, coprire la craniotomia e i gambi della sonda in silicone con vaselina sterilizzata per protezione.
Successivamente, applicare del cemento dentale per fissare la base della sonda alla vite di ancoraggio nel cranio. Subito dopo l'applicazione del cemento, spostare lentamente la sonda alla profondità desiderata. Far avanzare gli ultimi 200 micrometri dopo l'applicazione del cemento per ridurre il movimento laterale della sonda e garantire un danno tissutale minimo nell'area target.
Dopo che il cemento si è indurito, rilasciare la sonda dallo strumento di inserimento sciogliendo la cera con un cauterizzatore. Quindi, rilasciare la scheda del connettore dal dispositivo di inserimento e posizionarla in un punto adatto del cranio utilizzando un morsetto a coccodrillo. Fissare la scheda del connettore al cranio utilizzando del cemento dentale.
In caso di impianto di sonda nell'ippocampo, posizionare la scheda del connettore sull'osso parietale controlaterale. Quindi, saldare i fili di terra e di riferimento della scheda del connettore ai fili collegati alle due viti sopra il cervelletto. Tagliare il coperchio di protezione all'altezza corretta e posizionarlo sopra la sonda in silicone.
Successivamente, fissare il coperchio della scheda del connettore e del cranio utilizzando cemento dentale, evitando la pelle intorno al cranio esposto. Dopo l'intervento, applicare un trattamento analgesico appropriato sul topo per almeno due giorni. Alloggiare singolarmente il topo per evitare danni all'impianto.
Qui sono mostrate le registrazioni delle sonde in silicio impiantate cronicamente che mirano all'area CA1. L'analisi della densità della sorgente di corrente viene applicata lungo i singoli steli della sonda. In questo esempio, un singolo evento di ondulazione acuta porta a un prominente calo di corrente nello strato radiato di CA1 e nel secondo esempio, sono stati registrati due siti distinti nello strato di celle granulari del giro dentato.
La banda gamma alta è stata isolata applicando un filtro passa-banda da 60 a 80 hertz, rivelando lampi gamma locali su uno dei due siti di registrazione situati nello strato di celle granulari. Si noti che l'attività di oscillazione gamma locale può essere rilevata solo dopo la conversione dei segnali registrati in CSD. I segnali CSD, ma non i segnali LFP, identificano i periodi di asincronia di fase e ampiezza tra i due siti di registrazione.
Questo segmento mostra una breve epoca di attività gamma sincronizzata. Le tracce qui illustrano la differenza di fase e l'indice di differenza di ampiezza per le tracce LFP e CSD. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impiantare sonde in silicone nell'ippocampo.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la registrazione di potenziali di campo locali mediante sonde lineari in silicio con più shank per studiare l'attività elettrica locale nell'ippocampo del topo. Utilizzando l'analisi della densità della corrente sorgente, consente lo studio di oscillazioni cerebrali spazialmente limitate in topi liberi di muoversi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Funzione ippocampale
Sfondo
- Comprensione dell'organizzazione delle reti neuronali a scale fini.
- L'analisi della densità della corrente elettrica migliora il rilevamento delle oscillazioni cerebrali.
- Le sonde multi-shank consentono una mappatura precisa dell'attività elettrica.
- Le oscillazioni ippocampali sono fondamentali per le funzioni cognitive.
Scopo dello studio
- Per chiarire l'organizzazione spaziale e temporale delle attività neuronali.
- Per migliorare le metodologie per la registrazione dell'attività elettrica cerebrale.
- Per indagare le oscillazioni locali con una risoluzione più fine rispetto ai metodi convenzionali.
Metodi Utilizzati
- Le sonde lineari al silicio con più shank sono state impiantate nell'ippocampo.
- Il modello utilizzato prevedeva topi liberi di muoversi per lo studio della dinamica cerebrale in vivo.
- Non sono stati menzionati flussi di lavoro multi-omici.
- Sono state illustrate le principali tecniche chirurgiche e stereotassiche per l'impianto delle sonde.
- L'analisi della densità della sorgente di corrente è stata applicata dopo la registrazione per interpretare i dati.
Risultati principali
- Concentrarsi sull'analisi degli eventi di ripple ad onda acuta nei tracciati ippocampali.
- Dimostrata una rilevazione migliorata delle oscillazioni gamma localizzate.
- Osservate differenze distinte di fase e ampiezza nei potenziali di campo locali dopo la conversione in CSD.
- I risultati sottolineano i vantaggi dell'utilizzo della CSD rispetto alle analisi convenzionali dei LFP.
Conclusioni
- Questo studio convalida l'utilità delle sonde al silicio per ricerche approfondite sull'ippocampo.
- Non sono stati discussi dati multi-omici; l'attenzione è rimasta focalizzata sugli aspetti elettrofisiologici.
- Le implicazioni suggeriscono che una migliore comprensione della dinamica oscillatoria dei neuroni potrebbe accrescere la conoscenza dei processi di memoria e apprendimento.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente la rilevazione ad alta risoluzione di oscillazioni neuronali localizzate nello spazio nell'ippocampo, affrontando una sfida fondamentale nelle neuroscienze precliniche: distinguere l'effettiva attività locale della rete da segnali condotti per volume. Applicando l'analisi della densità della sorgente di corrente (CSD) a registrazioni del potenziale di campo locale (LFP) multilaminari ottenute mediante sonde al silicio, i ricercatori possono isolare dinamiche a livello di microcircuiti rilevanti per la memoria e la funzione cognitiva. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta, fornendo letture riproducibili e quantificabili degli stati della rete ippocampale in modelli comportamentali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'organizzazione dei microcircuiti ippocampali alla base delle onde acuto-ritmiche e delle oscillazioni gamma, coinvolte nella consolidazione della memoria.
- Valore operativo: Fornisce letture elettrofisiologiche con risoluzione spaziale che aiutano a distinguere gli effetti specifici del bersaglio da perturbazioni di rete aspecifiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera profili quantitativi di sink/sorgente laminari specifici che fungono da biomarcatori robusti dell'attivazione del circuito locale.
- Valore operativo: Standardizza la misurazione dell'attività oscillatoria tra shank e animali, favorendo la riproducibilità del saggio in studi longitudinali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega i modelli oscillatori derivati dai potenziali di campo locali agli stati comportamentali in topi liberi di muoversi, migliorando la validità predittiva per gli endpoint cognitivi.
- Valore operativo: Permette di rilevare la disaccoppiamento fase-ampiezza tra siti di registrazione visibile solo nella CSD, offrendo una metrica sensibile per la disfunzione della rete.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test delle ipotesi nella biologia iniziale all'ottimizzazione del composto attivo, in cui i fenotipi oscillatori delle reti possono fornire informazioni sull'interazione con il bersaglio e sulla selettività del circuito.
- Biologia della scoperta: Supporta l'analisi meccanicistica delle oscillazioni della rete ippocampale per chiarire gli effetti mediati dal bersaglio sulla sincronia neuronale.
- Screening: Fornisce letture quantitative e standardizzate di CSD (ad esempio, potenza nella banda gamma, incidenza dei ripple) adatte allo screening ad alta fedeltà di modulatori farmacologici.
- Analisi: Permette l'estrazione di indici di asimmetria di fase e ampiezza dalle tracce di CSD, fornendo misure oggettive della coordinazione della rete.
- Ricerca traslazionale: Collega le firme oscillatorie locali al comportamento, supportando l'allineamento di biomarcatori con domini cognitivi rilevanti per indicazioni neuropsichiatriche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma elettrofisiologica riutilizzabile per il monitoraggio longitudinale dello stato della rete in diversi modelli di malattia e coorti di trattamento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva isolando vere oscillazioni locali da segnali di conduzione volumetrica interferenti nei dati di potenziale di campo locale (LFP).
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati per il posizionamento delle sonde, il calcolo della densità di corrente sorgente (CSD) e la filtrazione passa-banda (ad esempio, 60–80 Hz per l'alta gamma).
- Valore strategico: Riduce l'incertezza nella de-risking biologica consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti nella rete (ad esempio, desincronizzazione di fase) non osservati con l'LFP convenzionale.
- Impatto sul portafoglio: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto basandosi sull'interazione con il bersaglio a livello di rete piuttosto che su variazioni dell'attività complessiva.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze in chirurgia stereotassica, elettrofisiologia e trasformazione matematica CSD.
- È dipendente da strumentazione con sonde al silicio lineari, sistemi di acquisizione in grado di registrare LFP multicanale e strumenti di post-elaborazione per la stima delle derivate spaziali.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di ricerca riguardo la profondità della sonda, l'orientamento del gambo e i parametri di filtraggio, al fine di garantire la comparabilità tra studi.
- L'adattamento ad altre regioni cerebrali richiede l'aggiustamento delle coordinate stereotassiche e la validazione della struttura laminare per un'interpretazione accurata della CSD.
- I limiti pratici includono l'invasività chirurgica, la deriva del segnale negli impianti cronici e la necessità di una validazione esperta dei pozzi/sorgenti CSD rispetto ai reperti istologici.
