Isolamento, caratterizzazione e Throughput elevato flusso extracellulare analisi di cellule epiteliali tubolari renali primari del Mouse

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul metabolismo renale, come l'ossidazione degli acidi grassi, che è strettamente correlata allo sviluppo della fibrosi renale e di varie altre nefropatie. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'utilizzo di una piattaforma ad alto rendimento per lo screening dei composti che regolano la bioenergetica mitocondriale nelle cellule epiteliali tubulari renali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della malattia metabolica renale perché consente uno screening ad alto spettro dei composti che regolano il metabolismo mitocondriale nelle cellule epiteliali renali.

Per preparare le piastre di Petri da 60 millimetri rivestite di collagene, aggiungere due millilitri di acido acetico prefiltrato da 20 millimolari seguiti da 35 microlitri di soluzione di collagene I in ciascuna capsula. Quindi, incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora, asciugarla all'aria ed esporla ai raggi UV. Quindi, risciacquare i residui di acido acetico con il PBS. Eseguire tre risciacqui.

Quindi, conservare la piastra in un incubatore per colture cellulari privo di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Dopo aver preparato il topo per l'intervento chirurgico, rimuovere il pelo dal petto e dall'addome utilizzando una crema depilatoria. Quindi, disinfettare la pelle con iodio e rimuovere i residui di iodio.

Successivamente, praticare un'incisione per aprire la cavità addominale ed esporre il cuore e i reni. Ora, installa una pompa di perfusione a 32 millilitri al minuto e rimuovi eventuali bolle nel tubo prima di iniziare la perfusione. Usa un ago calibro 27 alla fine della linea.

Per procedere, inserire un ago nel ventricolo sinistro attraverso l'apice del cuore. Non appena il tampone riempie il cuore, praticare un foro nell'atrio destro per creare un'uscita per il tampone di perfusione. Successivamente, passare al tampone di digestione e ridurre leggermente la velocità della pompa a 30 millilitri al minuto per la digestione.

Dopo che 20 millilitri di tampone digestivo sono stati perfusi, rimuovere entrambi i reni per l'isolamento delle cellule tubulari. Per elaborare i reni raccolti, per prima cosa rimuovere le capsule renali e il midollo. Quindi, tritare entrambi i reni in piccoli pezzi e incubarli in 10 millilitri di un tampone per la digestione in un forno a 37 gradi Celsius con una leggera rotazione per cinque minuti.

Dopo la digestione, rimuovere eventuali tessuti non digeriti facendo passare il tampone attraverso un filtro da 70 micron. Dopo aver raccolto il tessuto digerito, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura per fermare la digestione. Quindi, centrifugare la sospensione di tessuto filtrato a 50 g per cinque minuti per pellettare le cellule tubulari.

Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta, aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura e ripetere la centrifugazione per raccogliere le cellule tubulari rimanenti. Ora, risospendere il primo pellet in 20 millilitri di terreno di coltura e centrifugarlo a 50 g per cinque minuti per purificare ulteriormente le cellule raccolte. Smaltire il surnatante.

Quindi, risospendere entrambi i pellet in 10 millilitri di terreno di coltura. Quindi, conta le cellule viventi usando la colorazione blu di tripano. Quindi, semina fino a 10 milioni di cellule su un piatto rivestito di collagene da 60 millimetri e lascia che le cellule tubolari si attacchino durante la notte.

Per iniziare, seminare cellule tubulari P1 a 40.000 cellule in pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti appena preparata e rivestita di collagene. Utilizzare 100 microlitri di terreno di coltura per pozzetto. L'ottimizzazione della densità cellulare e della concentrazione dei composti nel saggio del flusso extracellulare è la chiave per il successo dell'esperimento.

Si consiglia un esperimento pilota di titolazione per identificare la densità cellulare e la concentrazione ottimali dei composti. Quindi, idratare la cartuccia del sensore. Per prima cosa, sollevare la cartuccia del sensore e riempire ogni pozzetto della piastra con 200 microlitri di soluzione di calibrazione.

Quindi, riposizionare la cartuccia per immergere i sensori e incubare il gruppo durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aspirare il vecchio terreno e sostituirlo con 175 microlitri di glucosio o terreno di analisi degli acidi grassi. Quindi, continuare l'incubazione per un'ora senza anidride carbonica.

Durante l'incubazione cellulare, caricare la porta A della cartuccia con 25 microlitri di oligomicina, caricare la porta B con FCCP, caricare la porta C con rotenone/antimicina A e caricare la porta D e tutte le altre porte con acqua. A questo punto, conservare la cartuccia nell'incubatore privo di anidride carbonica fino a quando la configurazione non è pronta per la calibrazione. Procedere accendendo l'analizzatore di flusso extracellulare e il controller.

Quindi, apri il software dell'analizzatore, scegli un test standard e premi l'opzione Procedura guidata per il saggio. Quindi, nella scheda Composti, assegnare i composti alle porte appropriate. Nella scheda Correzione sfondo, selezionare i pozzetti che non contengono celle.

Quindi, utilizza la scheda Gruppi ed etichette per etichettare i gruppi sperimentali. Quindi, nella scheda Protocollo, impostare i cicli di miscelazione e misurazione appropriati utilizzando i comandi disponibili. Queste impostazioni sono indicate nel protocollo di testo e, una volta inserite, salvano il modello per un uso futuro.

Ora, premi Fine procedura guidata per procedere. Ora, premi Avvia per iniziare la calibrazione. L'analizzatore espelle quindi il supporto della piastra e richiede l'inserimento della piastra della cartuccia.

Questo processo di calibrazione richiede dai 20 ai 25 minuti per essere completato. Una volta calibrato il sistema, premere il comando di richiesta per sostituire la piastra di calibrazione con la piastra della cella e continuare la corsa. Al termine della seduta, salvare i dati OCR e rimuovere la piastra dall'analizzatore.

A questo punto, aggiungere Hoechst a ciascuno dei pozzetti del saggio e incubare la piastra per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, contare le cellule utilizzando l'eccitazione a 355 nanometri e un'emissione a 460 nanometri e normalizzare i dati OCR alla conta delle cellule. In questo protocollo, una popolazione eterogenea di cellule renali, tubuli non completamente digeriti e altri detriti tissutali sono stati coltivati su piastre rivestite di collagene.

Il giorno dopo l'isolamento, il terreno di coltura è stato centrifugato per rimuovere i detriti e le cellule tubolari sono state ri-piastre. Successivamente, le cellule si sono attaccate più facilmente e, entro il quinto giorno di coltura, erano all'80-90% di confluenza. I TEC renali sono stati quindi sub-coltivati e sono cresciuti fino alla confluenza entro una settimana.

Una crescita simile si è verificata nei due passaggi successivi. Il monostrato di cellule ha preso una formazione a cupola, sollevandosi dalla piastra e rimanendo attaccato da giunzioni strette. La respirazione mitocondriale dei TEC primari isolati è stata misurata utilizzando l'analisi del flusso extracellulare descritto dell'OCR a diverse densità di placcatura, come descritto.

Le celle piastrate a densità maggiori avevano aumenti proporzionali nell'OCR. 40.000 cellule per pozzetto coprivano la superficie della piastra meglio di qualsiasi altra densità di placcatura, rendendola così la concentrazione ottimale per testare le interazioni tra cellule e composti. Ad esempio, ai TEC sono stati applicati terreni contenenti substrato di acidi grassi insieme a 2DG, un inibitore della glicolisi, per valutare direttamente l'ossidazione degli acidi grassi nei TEC ai passaggi uno e due.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere sempre traccia dei volumi e delle concentrazioni esatte in ciascun pozzetto. Alterazioni nelle concentrazioni finali dei componenti possono causare il fallimento dell'intero esperimento. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della nefrologia per esplorare il ruolo del metabolismo degli acidi grassi tubulari nella patogenesi di varie nefropatie.