Name: Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Scopri la calorespirometria per analizzare il metabolismo energetico cellulare misurando simultaneamente consumo di ossigeno e produzione di calore. Questo metodo non invasivo aiuta a valutare la tossicità mitocondriale nello sviluppo farmaceutico.

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Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla sovvenzione della National Science Foundation-160944 Mary E. Konkle e Michael A. Menze.

1. coltura cellulare
<ol><li>Mantenere cellule epatocellulari umane di carcinoma (HepG2) nel mezzo dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e ulteriori substrati (10 millimetri di glucosio, glutammina 2 mM e 1 mM piruvato) a 37 ° C in un'incubatrice di coltura delle cellule (5% CO2 , aria di 95%, 100% di umidità). Nota: Utilizzare la precedente formulazione di DMEM quando DMEM viene fatto riferimento nei passaggi successivi per manometrica e calorimetria.</li>
	<li>Piastra le cellule a 1 x 106 cellule per piastra di coltura di 100 mm e sottocultura loro ogni 7 giorni o prima di raggiungere confluency di 90% e rinnovare il mezzo ogni 3-4 giorni.</li>
	<li>Eseguire gli esperimenti quando le cellule sono 60-80% confluenti.</li>
</ol>2. preparazione del respirometro e calorimetro
<ol><li>Dispensare 2,2 mL di DMEM nell'alloggiamento respirometro, mettere il tappo completamente e regolare con lo strumento di tappo distanziale per consentire per diffusione ottimale dell'ossigeno dall'aria al mezzo.</li>
	<li>Mescolate continuamente a 37 ° C fino a quando la concentrazione di ossigeno (traccia blu) e il flusso di ossigeno (traccia rossa) sono stabili. Garantire che software di respirometro è programmato per contabilizzare la solubilità dell'ossigeno del medium usato nell'esperimento. Nota: Diversi media hanno coefficienti di solubilità di ossigeno differente (ad es., DMEM = 0,92).</li>
	<li>Dopo la stabilizzazione della concentrazione di ossigeno in DMEM con la camera aperta, selezionare una parte stabile della traccia di concentrazione di ossigeno e calibrare per saturazione dell'aria di 100%.</li>
	<li>Calibrare per 0% ossigeno selezionando una parte stabile della traccia di concentrazione di ossigeno quando l'ossigeno non è presente in aula. Eseguire questo passaggio dopo titolazione di µ l 20 di 230 mM Ditionito di sodio o dopo tutto l'ossigeno viene consumato da campione biologico alla fine di un esperimento.</li>
	<li>Dopo la calibrazione con 100% aria del respirometro, chiudere il tappo e assicurarsi che non ci sono bolle siano presenti in aula. Nota: un leggero aumento nel cambiamento continuo dell'ossigeno verrà rilevato in camera chiusa come il Sensore polarografico di ossigeno (POS) consuma ossigeno al fine di misurare la pressione parziale di ossigeno.</li>
	<li>Dopo ~ 10 min del tappo chiuso, confermare che il respirometro è pronto per cellule HepG2 osservando un flusso di ossigeno stabile. Nota: Il calorimetro usato qui utilizza Ampolle in acciaio inox e richiede una fiala da utilizzare come riferimento.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 mL di H2O (dH2O) [volume uguale come i campioni (passaggio 4)] per la fiala di riferimento del calorimetro e serrare il tappo, con una pinza, se necessario. Pulire la fiala sigillata con flusso d'aria e abbassare lentamente la fiala alla posizione 1 nel canale di riferimento del calorimetro. Rimangono nella posizione 1 fino a quando il campione biologico viene preparato.</li>
</ol>3. preparazione delle cellule HepG2 Respirometry e Calorimetria
<ol><li>Confermare che il respirometro e calorimetro sono preparati e calibrati. Caldo DMEM e tripsina a 37 ° C in un bagno d'acqua.</li>
	<li>Aggiungere DMEM a un fresco 100 mm di spessore e posto nell'incubatrice per consentire l'equilibrazione del mezzo per CO2 e la temperatura. Nota: Questo mezzo verrà essere utilizzato per l'esperimento di calorimetria, così il volume appropriato dipende dal numero di fiale che verrà utilizzato.</li>
	<li>Confermare con un microscopio ottico invertito che le cellule sono al 60-80% confluenti, poi lavare il 100 mm piastra 2 x 10 ml di soluzione tampone fosfato (PBS) e temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL della tripsina di 37 ° C per la piastra di 100 mm delle cellule e loro Incubare per 7-10 min a 37 ° C nell'incubatore di cultura cellulare. Neutralizzare la tripsina con 3 mL di 37 ° C DMEM e sospendere pipettando delicatamente e ~ 20 volte con una pipetta da 5 mL.</li>
	<li>Trasferire i 6 mL di sedimento cellule in DMEM e tripsina in una provetta conica sterile di 15 mL e si centrifuga per 5 min a 175 x g. rimuovere il liquido senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in ~ 5 mL di DMEM e dispensare accuratamente per garantire le cellule sono sufficientemente dissociato da altra.</li>
	<li>Rimuovere ~ 100 µ l del campione omogeneizzato ed eseguire un conteggio accurato delle cellule utilizzando 8 tutti i campi su un emocitometro per determinare il numero totale delle cellule. Quindi calcolare il volume per la risospensione delle cellule al fine di generare ~ 2 x 106 cellule per 50 µ l. Nota: Questo garantisce che 2 x 106 cellule vengono aggiunti a ciascuna camera del respirometro con minimo medio dislocamento.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 5 min a 175 x g. Risospendere il pellet nel volume calcolato di DMEM dal punto 3.7.</li>
	<li>Eseguire un conteggio delle cellule per determinare il volume necessario per iniettare 2 x 106 cellule per camera nel respirometro (questo dovrebbe essere ~ 50 µ l). Conservare le cellule per la misurazione respirometriche su ghiaccio fino al momento.</li>
	<li>Mentre il campione concentrato cellulare è sul ghiaccio, determinare la diluizione necessaria per produrre una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL per la calorimetria.</li>
	<li>Mescolare bene il campione e preparare ~ 3 mL delle cellule a 1 x 105 cellule/mL in DMEM per ogni fiala. Nota: Il DMEM utilizzato per la diluizione del campione dovrebbe essere il mezzo equilibrato preparato al punto 3.3.</li>
</ol>4. calorimetria
<ol><li>Assicurarsi che il calorimetro è collegato al computer e il segnale calorimetrico in µW è osservabile e stabile.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 mL delle cellule a 1 x 105 cellule/mL (~2.5 x 105 celle) per ogni fiala, garantire aria sufficiente è tra il coperchio della fiala ed il mezzo per consentire per la diffusione del gas.</li>
	<li>Immediatamente stringere il tappo, con una pinza, se necessario. Pulire la fiala sigillata, utilizzando il flusso d'aria per rimuovere eventuali detriti esterni e abbassare lentamente la fiala in posizione 1 del calorimetro. Registrare il tempo che la fiala è abbassata in posizione 1.</li>
	<li>Consentire la fiala per sedersi nella posizione 1 per 15 min. Nota: Durante questo periodo di 15 minuti, le cellule sono deve essere iniettato in respirometro (passo 5). Questo assicura che lo stesso intervallo di tempo viene utilizzato per la produzione di calore e consumo di ossigeno quando il rapporto di CR è determinato.</li>
	<li>Dopo 15 min in posizione 1, abbassare lentamente fiale del campione sia il riferimento alla posizione 2. Registrare il tempo che le fiale sono state abbassate e misura per almeno 30 min.</li>
</ol>5. respirometry
<ol><li>Durante l'intervallo di 15 minuti in cui la fiala è alla posizione 1 nel calorimetro, iniziano gli studi respirometrici.</li>
	<li>Mescolare bene il campione di cellule pipettando per garantire una soluzione omogenea e iniettare < 50 µ l di campione cellulare in ogni camera del respirometro per una concentrazione finale di ~ 2 x 106 cellule/camera. Registrare il tempo, che le cellule vengono iniettate il respirometro.</li>
	<li>Dopo l'iniezione, le cellule HepG2 sono continuamente agitate a 37 ° C. Attendere almeno 20-30 min per entrambi una stabilizzazione del flusso ossigeno ed una costante diminuzione della concentrazione di ossigeno.</li>
	<li>Selezionare la scheda flusso di2 O a V sulla destra dello schermo ed evidenziare una parte stabile del flusso di ossigeno. Selezionare indicatori, quindi le statistiche e dati del record per flusso2 O a V. Questa registrazione verrà utilizzata nel calcolo del rapporto CR. Nota: Passaggi 5.5 e 5.6 sono facoltativi. Perdita di respirazione e la respirazione disgiunto massima sarà rivelati di titolazioni di oligomycin e FCCP.</li>
	<li>Iniettare 1 µ l di oligomycin 4mg/mL in ogni camera e consentire ~ 10 min per la stabilizzazione del flusso di ossigeno. Tasso di respirazione di perdita stabile record eseguendo i passaggi eseguiti in 5.4 mettendo in evidenza una parte stabile della traccia del flusso di ossigeno dopo l'aggiunta di oligomycin.</li>
	<li>Titolare le iniezioni di 2-µ l di 0,2 mM FCCP in ogni camera, consentendo per la stabilizzazione di flusso di ossigeno dopo ogni iniezione. Continuano le titolazioni fino a quando il flusso massimo è raggiunto, come indicato da un lieve calo la successiva titolazione FCCP. Registrare il tasso di respirazione stabile durante il flusso massimo.</li>
</ol>6. calcolo del rapporto di Calorespirometric
<ol><li>Eseguire un conteggio finale delle cellule dei campioni preparati a ~ 1 x 105 cellule/mL utilizzando 8 tutti i campi di un emocitometro per determinare il numero totale di celle aggiunte alla fiala (2,5 mL).</li>
	<li>Determinare un tempo per i valori di misurazione dal calorimetro e respirometro in cui sono presenti a volte identici segnale stabile. Riferimento che il tempo registrato quando la fiala è stata abbassata a posizione 2 e il tempo di iniezione delle cellule nel respirometro.</li>
	<li>Registrare la produzione di calore posizionando il cursore sopra la traccia visualizzare l'output di calore per la fiala rispettata al momento determinato nel passaggio ed espressa come µW/milioni di cellule. Raccogliere dati sul consumo di ossigeno e garantire che si esprime come pmol O2 x s-1 1x milioni di cellule.</li>
	<li>Per calcolare il rapporto di CR, prima convertire µW in kJ/s e quindi dividere kJ/s per mol di O2/s per ottenere il rapporto CR espresso in kJ/mol O2. Nota: Il rapporto di CR è presentato in kJ/mol O2. (Vedi <a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">1 FIle supplementari</a>)</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'obiettivo di calorespirometry è quello di valutare quantitativamente i contributi dei percorsi aerobici ed anaerobici di attività metabolica e ottenere una vista composta di flusso di energia cellulare. Ciò avviene mediante una misura simultanea di dissipazione del calore e flusso di ossigeno seguita da un confronto tra il rapporto CR calcolato con il teorico oxycaloric equivalente. Diversi passaggi critici devono essere considerate per dati riproducibili e affidabili. Il mantenimento di una cultura sterile cellula san...

Nei sistemi biologici, il rilascio di calore o entalpia cambiamento durante il metabolismo è in genere monitorati sia direttamente (tramite diretta calorimetria) o indirettamente tramite il consumo di O2 e/o produzione di CO2 (via manometrica). Sfortunatamente, quando queste tecniche sono utilizzate in isolamento, informazioni critiche vengono perse, come il contributo delle vie anaerobiche al metabolismo cellulare. Calorespirometry è una potente tecnica che si basa sulla misurazione simultanea di dissipazione di calore e di respirazione. Calorespirometric lavoro pionieristico studiato il metabolismo anaerobico in cellule di mammiferi completamente ossigenate e dimostrato contributi simultanei dei percorsi sia aerobici che anaerobici di omeostasi energetica nonostante le cellule trasformate in un ambiente completamente ossigenato1. Calorespirometry da allora è stato applicato a una vasta gamma di domande biologiche. Alcuni esempi includono lo studio dell'animale energetica a bassi livelli di ossigeno, gli effetti di erbicidi e di estrogeno sulle lamelle di molluschi bivalvi, il metabolismo degli organismi terrestri e la decomposizione microbica di materia organica del suolo2, 3 , 4 , 5 , 6. Inoltre, calorespirometry ha rivelato come metabolica precondizionamento prima del congelamento migliora la crioconservazione di mammiferi celle7. Ogni approccio, sia calorimetria e manometrica, indipendentemente ha aumentato la nostra conoscenza della bioenergetica cellulare e organismica. Tuttavia, fondamentali domande biologiche che possono essere risolte attraverso l'uso di calorespirometry rimangono relativamente inesplorate.
Leggi di Hess afferma che la variazione di entalpia totale di una reazione è indipendente del pathway tra gli stati iniziali e finali. Ad esempio, la variazione di entalpia totale per una via biochimica è la somma della variazione di entalpie di tutte le reazioni all'interno della via. Calorimetria offre un approccio in tempo reale per misurare la produzione di calore cellulare, che rileva indiscriminatamente vie sia aerobiche che anaerobiche. Questo si basa sul fondamento che nessuna energia viene scambiata nel sistema tranne attraverso le pareti della fiala sperimentale8. Un cambiamento nella dissipazione del calore è uguale al cambiamento di entalpia rilasciato da tutte le reazioni metaboliche in fiala. Così, un negativo entalpia correla ad una perdita di calore dal sistema. Ricerche approfondite negli ultimi quattro decenni ha caratterizzato il paesaggio termodinamico di anabolismo e catabolismo. Questo è rappresentato da un aumento costante nella ricerca articoli trovati sotto i termini di ricerca "biologici" e "calorimetria" come indicizzato dallo Stati Uniti National Library di medicina (NLM) presso il National Institutes of Health (PubMed). La ricerca rivela che prima del 1970, un totale di 27 pubblicazioni riferimento biologico calorimetria; nel frattempo, nel 2016 da solo, 546 pubblicazioni utilizzato la tecnica.
Metodi calorimetrici sono ben stabiliti per determinare la produzione di calore. Tuttavia, una maggiore flessibilità è concesso per la risoluzione il valore respirometriche. La misurazione respirometriche può consistere di O2, CO2, o O2 e CO2. Ulteriormente, la misura di O2 o CO2 può essere compiuta mediante varie tecniche, tra cui optrodes, Clark-tipo di elettrodi e diodo tunable laser assorbimento spettroscopia7,9,10 ,11. Mentre la produzione di CO2 è una metrica preziosa in molti studi respirometriche, il supporto per le cellule coltivate spesso utilizza un sistema di buffer di bicarbonic per controllo pH12,13. Per evitare complicazioni di CO2 misura nel sistema di bicarbonato, il seguente protocollo per la calorespirometry delle cellule nella cultura utilizza O2 come unico parametro respirometriche.
In concomitanza con cambiamento continuo dell'ossigeno di misurazione, alcuni respirometers (Vedi Tabella materiali) sono progettati per valutazioni dettagliate della funzione mitocondriale. Substrato-disaccoppiatore-inibitore-titolazioni (SUIT) protocolli sono ben stabiliti e sono compatibili con gli esperimenti progettati per misurare la membrana potenziale o reattive dell'ossigeno (ROS) specie formazione14. Il protocollo presentato per calorespirometry di cellule intatte è compatibile con l'introduzione della chimica uncouplers come Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone (FCCP) e l'inibitore oligomycin di F0F1-ATP sintasi. Attraverso l'aggiunta di FCCP, consumo di ossigeno può essere disgiunto dalla produzione di ATP, che è utile per valutare l'impatto di potenziali terapie su mitocondriale peformance15. Inoltre, l'aggiunta di oligomycin si illumina nella misura della respirazione di perdita. Così, le misure respirometriche eseguite durante calorespirometry sono compatibili con protocolli vasti progettati più ulteriormente per delucidare fisiologia mitocondriale.
La misura simultanea di dissipazione di calore e di cambiamento continuo dell'ossigeno consente il calcolo del rapporto calorespirometric (CR). Questo rapporto viene quindi confrontato con costante di Thornton o il oxycaloric teorico equivalente, che spazia tra -430 a-480 kJ mol-1 a seconda della varietà di cellula o tessuto di interesse e il carbonio completati substrati1, 16. quindi, un rapporto più negativo di CR rivela maggiori contributi da vie anaerobiche per complessivo activity. Ad esempio, il rapporto di CR per la respirazione dei tessuti muscolo routine senza l'attiva delle prestazioni di lavoro varia da-448 a-468 kJ mol-1 che è all'interno della gamma del oxycaloric teorico equivalente17,18. Nel frattempo, le cellule tumorali dei mammiferi coltivate in medium che è ad alto contenuto di glucosio visualizzare fermentazione acido lattico avanzata seguendo la glicolisi e relativamente basso coinvolgimento mitocondriale19. Questo risultati di fenotipo in rapporti di CR nell'intervallo di-490 a-800 kJ mol-1, dimostrando una maggiore partecipazione delle vie anaerobiche nel metabolismo cellulare come indicato da più negativa CR rapporti1,7, 16,20.
Distributori di cellule e tessuti sia commerciali che senza scopo di lucro attualmente offerta linee cellulari provenienti da oltre 150 specie, con quasi 4.000 linee cellulari derivano da esseri umani. Linee cellulari immortalizzate sono strumenti utili per valutare rapidamente la tossicità delle terapie potenziali, molte delle quali possono interferire direttamente o indirettamente con funzioni mitocondriali. Utilizzando cellule trasformate durante lo screening di stupefacenti può essere di limitato valore predittivo in parte a causa dell'effetto di Warburg, un segno distintivo di molti cancri. Spesso, i cancri generano ATP da fosforilazione del substrato-livello e mantengono l'equilibrio redox attraverso la produzione di lattato senza impegnarsi pienamente il mitocondrio sotto condizioni aerobiche19. Sviluppo farmaceutico è notoriamente costoso ed inefficiente, con circa 8 su 9 composti provati nei test clinici umani non riuscendo a ottenere l'approvazione del mercato21. Mentre terapeutica potenziale può passare uno screening iniziale a causa della bassa citotossicità nelle linee cellulari, è possibile che alcuni di questi composti sono mitotoxic. Senza un metodo adatto per rilevare come queste tossine possono alterare l'equilibrio di energia nelle cellule primarie che non vengono visualizzati l'effetto Warburg, informazione critica è spesso sovra-sembrava, strozzature sviluppo terapeutico nelle fasi iniziali.
Calorespirometry è un approccio pratico, non invadente per analizzare l'attività metabolica in una varietà di campioni biologici, compreso le cellule e tessuti. Il nucleo del protocollo presentato è compatibile con una gamma di applicazioni. Una complicazione, tuttavia, è stata identificata. Cellule immortalizzate sono spesso coltivate in un medium privo di glucosio, completato con galattosio per aumentare il contributo della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per la produzione di energia, al fine di sensibilizzare le cellule a potenziali mitotoxins22, 23. Questa riprogrammazione metabolico sembra oscurare analisi quando i campioni vengono inseriti nelle fiale di acciaio inossidabile utilizzate dal calorimetro15. Le cellule coltivate in un medium del glucosio continuano ad impegnarsi in alta attività metabolica per diverse ore. Nel frattempo, le cellule coltivate in medium galattosio diminuiscono la produzione di calore entro 30 min della loro collocazione in fiala, effettuare misure limitate ai punti di tempo sperimentale in anticipo. Questo comportamento, purtroppo, ostacola la possibilità di valutare la loro proliferazione cellulare. Nonostante questa limitazione specifica, la maggior parte delle applicazioni sono compatibili con l'analisi calorespirometric e dettagliate informazioni metaboliche possono essere ottenute attraverso questo approccio.

<table><tbody><tr><td>Cellule HepG2 Tipo</td><td>Americano Collezione di colture</td><td>HB-8065</td><td>Cellule utilizzate per calorespirometria</td></tr><tr><td>O2k-Respirometro</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10022-02</td><td>Respirometro</td></tr><tr><td>LKB 2277 monitor di attività termica (TAM)</td><td>Termometrico AB</td><td></td><td>Termometrico è stato acquistato da TA Instruments</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11360070</td><td>100x soluzione aggiunta al DMEM medio</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino - Premiuim Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Aggiunto al 10% nel DMEM medio</td></tr><tr><td>Trypsn-EDTA (0,25%)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td>Reagente per la dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Oligomicina da Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>O4876</td><td>Inibitore mitocondriale</td></tr><tr><td>Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazone</td><td>Sigma</td><td>Aldrich C2920</td><td>Disaccoppiatore mitocondriale</td></tr><tr><td>Corning 100 mm Piatto di coltura trattato con TC</td><td>Corning Corporation</td><td>430167</td><td>Piatto di coltura tissutale</td></tr><tr><td>Glucosio, polvere</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15023021</td><td>Glucosio per DMEM medio</td></tr><tr><td>Galattosio, polvere</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP656500</td><td>Galattosio per DMEM terreno</td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Glutammina per DMEM medio</td></tr><tr><td>DMEM, senza glucosio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11966025</td><td>Terreno per colture cellulari</td></tr></tbody></table>

calorespirometry: un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Molte linee cellulari utilizzate nella ricerca biologica e biomedica di base mantengono l'omeostasi energetica attraverso una combinazione di respirazione sia aerobico che anaerobico. Tuttavia, nella misura in cui sia vie contribuiscono al paesaggio della produzione di energia cellulare è costantemente trascurata. Trasformato le cellule coltivate in saturando i livelli di glucosio spesso mostrano una dipendenza in diminuzione su fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP, che viene compensata da un aumento nella fosforilazione del substrato-livello. Questo spostamento nell'equilibrio metabolico permette alle cellule di proliferare nonostante la presenza di tossine mitocondriali. Trascurando l'alterato equilibrio metabolico delle cellule trasformate, i risultati di uno screening farmaceutico potrebbero essere interpretata erroneamente dal potenzialmente effetti mitotoxic non possono essere rilevati utilizzando modello linee cellulari coltivate in presenza di elevati del glucosio concentrazioni. Questo protocollo descrive l'accoppiamento di due potenti tecniche, manometrica e Calorimetria, che consente la valutazione quantitativa e non invadente dei contributi sia aerobici ed anaerobici per la produzione di ATP cellulare. Respirazioni sia aerobici ed anaerobici generano calore, che può essere monitorato tramite calorimetria. Nel frattempo, la misurazione del tasso di consumo di ossigeno può valutare l'entità della respirazione aerobica. Quando sia la dissipazione di calore e consumo di ossigeno sono misurati simultaneamente, il rapporto di calorespirometric può essere determinato. Il valore ottenuto sperimentalmente può essere confrontato all'equivalente di oxycaloric teorico e nella misura della respirazione anaerobica può essere giudicata. Così, calorespirometry fornisce un metodo unico per analizzare una vasta gamma di domande biologiche, tra cui lo sviluppo di farmaci, la crescita microbica e bioenergetica fondamentale sia in normossia e in condizioni di ipossia.

La riproducibilità delle misurazioni calorespirometric dipende da una preparazione del campione corretto e coerente. Campioni preparati da coltura cellulare non devono essere utilizzati se le piastre sono invasi, come i conteggi delle cellule possono diventare imprecisi a causa di agglutinamento. Inoltre, flussi di calore ridotta a causa della diffusione di substrato limitato nelle cellule ragruppate possono verificarsi. Pertanto, quando si utilizza cellule aderenti, è fondamentale per selezionare un piatto con la conflu...

Questo protocollo descrive calorespirometry, la misura diretta e simultanea di dissipazione di calore e di respirazione, che fornisce un approccio non invasivo per valutare il metabolismo energetico. Questa tecnica è utilizzata per valutare il contributo delle vie sia aerobiche e anaerobiche per l'utilizzazione di energia di monitoraggio del flusso totale di energia cellulare.

Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Gli obiettivi generali di questa procedura sono analizzare l'attività metabolica di un campione biologico e determinare la misura in cui le vie anaerobiche contribuiscono alla produzione di energia cellulare all'interno del campione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo farmaceutico sull'entità della tossicità mitocondriale durante lo sviluppo di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita la misurazione simultanea del consumo di ossigeno e della produzione di calore in un campione di cellule di interesse.Quindi questo metodo può fornire informazioni sulla pianificazione del trattamento durante lo sviluppo farmaceutico. Può essere applicato anche ad altri campi, come la cirobiologia, in cui è possibile valutare gli effetti del precondizionamento metabolico sulla crioconservazione. Per preparare il respirometro, aggiungere prima due virgola due millilitri di DMEM a ciascuna camera del respirometro e inserire completamente i tappi.Regolare i tappi con uno strumento di puntamento per consentire una diffusione ottimale dell'ossigeno al fluido e impostare le camere in modo che mescolino continuamente i campioni a 750 giri/min a 37 gradi

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Una descrizione di un metodo per la profilatura funzione mitocondriale nelle cellule è fornito. Il profilo mitocondriale generato fornisce quattro parametri della funzione mitocondriale, che può essere misurata in un esperimento: frequenza respiratoria basale, ATP-linked respirazione, perdita protonica, e la capacità di riserva.

Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Ad alta risoluzione respirometria è utilizzato per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questa è una tecnica semplice per determinare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima, e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare l'effetto delle modifiche del glucosio-mediata di respirazione mitocondriale in presenza di composti naturali sulle cellule beta intatto 832/13 utilizzando manometrica ad alta risoluzione.

Respirometry ad alta risoluzione per misurare la funzione mitocondriale di cellule Beta intatte in presenza di composti naturali

La valutazione della fosforilazione ossidativa mediante respirometri ad alta risoluzione è diventata parte integrante dell'analisi funzionale dei mitocondri e del metabolismo energetico cellulare. Qui, presentiamo protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare utilizzando respirometri ad alta risoluzione basati su camera e micropiastre e discutiamo i principali vantaggi di ciascun dispositivo.

Respirometria ad alta risoluzione per valutare la bioenergetica nelle cellule e nei tessuti utilizzando respirometri a camera e a piastre

Lo stato metabolico delle cellule epiteliali pigmentate retiniche umane (H-RPE) riflette la loro salute e funzione. Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per esaminare il flusso metabolico in tempo reale di H-RPE utilizzando respirometria ad alta risoluzione.

Analisi in tempo reale della bioenergetica in cellule epiteliali pigmentate primarie della retina umana mediante respirometria ad alta risoluzione

Qui, descriviamo un metodo completo per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in fibre muscolari scheletriche fresche permeabilizzate da muscolo umano o di topo. Questo metodo consente la quantificazione in tempo reale della respirazione mitocondriale e la valutazione della preferenza per il carburante e della flessibilità metabolica, preservando le reti mitocondriali esistenti e l'integrità della membrana.

Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

L'abuso di alcol compromette l'immunità dei macrofagi alveolari (AM) a causa della soppressione della respirazione mitocondriale e della bioenergetica. Recentemente abbiamo dimostrato che l'esposizione all'etanolo (EtOH) aumenta la dipendenza dalla glutammina per la respirazione mitocondriale nelle AM. In questo articolo, vengono forniti metodi per determinare l'uso della glutammina per la respirazione mitocondriale nelle AM trattate con EtOH utilizzando un bioanalizzatore di flusso...

Valutazione della glutammina come fonte di combustibile per macrofagi alveolari esposti a etanolo cronico utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare

Presentiamo un metodo non invasivo e in tempo reale per monitorare la salute mitocondriale utilizzando la Spettroscopia Raman a Risonanza (RRS). Abbiamo utilizzato RRS per quantificare gli stati redox mitocondriali e sviluppato una metrica per la salute mitocondriale, il rapporto ridotto mitocondriale Resonance Raman (3RMR), che mostra una risposta più rapida ai cambiamenti di ossigenazione rispetto agli analiti ematici ematici e gasses.

Valutazione in tempo reale e non invasiva della funzione mitocondriale tramite spettroscopia Raman a risonanza

In questo rapporto, descriviamo tridimensionale pelle ricostruire modello che imita la pelle umana in architettura e composizione. Fisiologia melanociti, la progressione del melanoma e il destino delle cellule staminali cutanee sono state studiate utilizzando il modello di ricostruire la pelle. Il modello è anche utile come strumento di pre-clinici per la valutazione dei farmaci.

Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

Scopri la calorespirometria per analizzare il metabolismo energetico cellulare misurando simultaneamente consumo di ossigeno e produzione di calore. Questo metodo non invasivo aiuta a valutare la tossicità mitocondriale nello sviluppo farmaceutico.

Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

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