Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

Gli obiettivi generali di questa procedura sono analizzare l'attività metabolica di un campione biologico e determinare la misura in cui le vie anaerobiche contribuiscono alla produzione di energia cellulare all'interno del campione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo farmaceutico sull'entità della tossicità mitocondriale durante lo sviluppo di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita la misurazione simultanea del consumo di ossigeno e della produzione di calore in un campione di cellule di interesse.

Quindi questo metodo può fornire informazioni sulla pianificazione del trattamento durante lo sviluppo farmaceutico. Può essere applicato anche ad altri campi, come la cirobiologia, in cui è possibile valutare gli effetti del precondizionamento metabolico sulla crioconservazione. Per preparare il respirometro, aggiungere prima due virgola due millilitri di DMEM a ciascuna camera del respirometro e inserire completamente i tappi.

Regolare i tappi con uno strumento di puntamento per consentire una diffusione ottimale dell'ossigeno al fluido e impostare le camere in modo che mescolino continuamente i campioni a 750 giri/min a 37 gradi Celsius fino a quando la concentrazione e il flusso di ossigeno non sono stabili. Verificare che il software del respirometro sia programmato per tenere conto della solubilità in ossigeno del mezzo utilizzato nell'esperimento. Quindi selezionare una parte stabile della traccia di concentrazione di ossigeno e calibrare questa porzione per una saturazione dell'aria del 100%.

A questo punto, chiudete i tappi, facendo attenzione che non siano presenti bolle nelle camere. Dopo circa 10 minuti, si dovrebbe osservare un flusso di ossigeno stabile. Per prepararsi alla calorimetria, aggiungere prima due virgola cinque millilitri di acqua deionizzata alla fiala di riferimento, quindi serrare il tappo.

Utilizzando una pompa ad aria, rimuovere i detriti esterni dall'ampolla, quindi abbassare lentamente l'ampolla per posizionarne una nel canale di riferimento del calorimetro. L'ampolla rimarrà in posizione uno fino a quando non sarà stata preparata l'ampolla con il campione di cellule. Il DMEM, utilizzato per la calorimetria, deve essere bilanciato in un incubatore a 37 gradi Celsius con un'atmosfera umidificata e il 5% di CO2.

Iniziare l'esperimento aggiungendo tre millilitri di DMEM a una piastra da 100 millilitri per ogni fiala calorimetrica che verrà utilizzata e posizionare la piastra nell'incubatore fino a quando il campione non è pronto per la calorimetria. Mentre il terreno è in equilibrio, utilizzare un microscopio invertito per selezionare una piastra con cellule HepG2 che sono tra il 60 e l'80% confluenti e distribuite in modo omogeneo. Per prima cosa, rimuovere il terreno di coltura cellulare e lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS.

Aggiungere tre millilitri di tripsina preriscaldata a 37 gradi Celsius e incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Dopo sette-10 minuti di incubazione, neutralizzare la reazione enzimatica con i tre millilitri di DMEM a 37 gradi Celsius e utilizzare una pipetta da cinque millilitri per dissociare delicatamente le cellule in una sospensione di una singola cellula. Trasferire le cellule in una provetta conica sterile da 15 millilitri per la centrifugazione e risospendere la tavolozza in circa cinque millilitri di DMEM fresco.

Pipettare accuratamente le cellule per disaggregare eventuali ammassi cellulari e, dopo il conteggio, concentrare le cellule in circa due milioni di cellule per 50 microlitri di terreno. La riproducibilità di questo metodo dipende da una conta cellulare coerente e accurata. È fondamentale garantire che il campione sia omogeneo e che le cellule non siano raggruppate in nessun punto durante l'analisi.

Quindi, conservare le cellule in ghiaccio fino al momento di eseguire misurazioni respirometriche e calorimetriche. Prima della misurazione calorimetrica, verificare che il calorimetro sia collegato al computer e che il segnale calorimetrico sia stabile e in microwatt. Diluire le cellule a 100.000 cellule per millilitro nel terreno bilanciato che è stato posto nell'incubatore prima della preparazione del campione.

Quindi aggiungere due virgola cinque millilitri di soluzione cellulare a ciascuna fiala, confermando che venga mantenuto un volume d'aria sufficiente tra i coperchi delle fiale e il mezzo per consentire la diffusione del gas. Serrare immediatamente i tappi e pulire le fiale sigillate con aria per rimuovere eventuali detriti esterni. Quindi abbassare lentamente l'ampolla sigillata con il campione di cella per posizionare uno dei calorimetri.

Mescolare accuratamente il campione per garantire una soluzione omogenea e iniettare due milioni di cellule in ciascuna camera chiusa del respirometro sotto agitazione continua. Dopo 15 minuti in posizione uno nel calorimetro, abbassare lentamente sia l'ampolla di riferimento che l'ampolla con le celle in posizione due e registrare il tempo di abbassamento. Da 10 a 15 minuti dopo che le cellule sono state iniettate nel respirometro, si deve osservare una stabilizzazione del flusso di ossigeno e una diminuzione costante della concentrazione di ossigeno.

Per determinare la respirazione a perdita, iniettare un microlitro di quattro milligrammi per millilitro di oligomicina in ciascuna camera e lasciare che il flusso di ossigeno si stabilizzi per circa 10 minuti, registrando il tasso di respirazione stabile a perdita come appena dimostrato. Quindi, per determinare il flusso massimo, iniettare due microlitri di FCCP millimolare a zero virgola due millimolari nella camera, consentendo al flusso di ossigeno di stabilizzarsi dopo ogni iniezione e continuando le titolazioni fino al raggiungimento del flusso massimo. Registrare la frequenza respiratoria stabile durante il flusso massimo.

Quando la camera del respirometro è in funzione prima della misurazione del campione, sia la concentrazione di ossigeno che le tracce di flusso di ossigeno devono essere stabili. Dopo che l'ampolla è stata abbassata in posizione due, è possibile identificare un periodo di tempo in cui la potenza termica è stabile e può essere identificato un tempo corrispondente in cui il flusso di ossigeno è stabile, per consentire il calcolo del rapporto calorespirometrico. Se le cellule HepG2 vengono coltivate in assenza di glucosio e il galattosio viene integrato per aumentare il coinvolgimento mitocondriale, le cellule non proliferano all'interno del calorimetro, ma diminuiscono invece la loro attività metabolica dopo circa 30 minuti nell'ampolla, limitando il calcolo calorespirometrico al primo punto temporale in cui è stata misurata la dissipazione del calore.

È fondamentale registrare il tempo in cui le cellule vengono pipettate nell'ampolla in modo che le misurazioni della produzione di calore e del consumo di ossigeno vengano raccolte in punti temporali identici, poiché sono necessari circa 15 minuti perché il flusso di ossigeno si stabilizzi e la concentrazione di ossigeno diminuisca costantemente. Poiché il flusso di ossigeno stabilizzato delle cellule funge da surrogato per il consumo di ossigeno nel calcolo del rapporto calorespirometrico, è possibile eseguire ulteriori titolazioni per valutare la respirazione a perdita, che è indicata da un calo del flusso di ossigeno e la respirazione massima disaccoppiata, che è indicata da un mancato aumento della respirazione con successive titolazioni FCCP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di quattro ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che altre linee cellulari possono avere proprietà metaboliche diverse. Pertanto, ogni nuova linea cellulare deve essere ottimizzata sia per le misure calorimetriche che per quelle respirometriche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le cellule HepG2 per la calorespirometria per garantire una corretta calibrazione strumentale e per condurre correttamente un esperimento calorespirometrico.