Name: Unanalisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Scopri come misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci umani dopo ipossia/riossigenazione con il colorante JC-1. Questo metodo valuta efficacemente gli agenti protettivi contro il danno cellulare.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da The National Key Research e programma di sviluppo della Cina (n. 2017YFC1700503), il programma nazionale di ricerca base (973 programma) della Cina (No.2012CB518602), National Natural Science Foundation of China (No. 81370223 e no. 81573957) e la Fondazione di ricerca innovativa degli specializzandi del Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).

1. preparazione dei reagenti e soluzioni
<ol><li>Preparare il supporto completo di miociti cardiaci umani (HCMs) aggiungendo 25 mL di miscela di supplemento del miocita crescita medio a 500 mL di Medium di crescita del miocita secondo le istruzioni del produttore. Conservare a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare la soluzione di Tongxinluo (TXL) sciogliendo il polvere ultrafine TXL in privo di siero e glucosio di Dulbecco modificato medio dell'Aquila (DMEM) e regolare la concentrazione di TXL a 400 µ g/mL aggiungendo DMEM (per maggiori dettagli, cfr.11). Conservare a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare 5 mL di soluzione di lavoro di JC-1 aggiungendo 25 µ l di soluzione madre (200x) JC-1, 4 mL di acqua ultrapura e 1 mL di brodo macchiatura buffer (5x) in una provetta da centrifuga da 15 mL al buio. Pipettare la miscela su e giù più volte e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare 30 mL di buffer di macchiatura di lavoro aggiungendo 24 mL di acqua ultrapura a 6 mL di brodo macchiatura buffer (5x) in una provetta da centrifuga 50 mL. Utilizzare questa soluzione ghiacciata.</li>
</ol>2. istituzione di ipossia/riossigenazione modello
<ol><li>Piastra 1.0 x 105 cellule per pozzetto con HCM completano medio in un piatto ben 6. Crescere fino a raggiungere una confluenza di circa il 70% in un'incubatrice di cellulare contenente 5% CO2% e 95% aria a 37 ° C.</li>
	<li>HCMs lavare con soluzione salina tampone fosfato (PBS). Esporli a diversi trattamenti (400 µ g/mL TXL o non) in 2 mL di siero/glucosio-liberi DMEM per 30 min prima di ipossia in un'incubatrice di cellulare contenente 5% CO2% e 95% aria a 37 ° C.</li>
	<li>Incubare HCMs in un vaso ermetico e hypoxic (2,5 L) dotati di catalizzatore per consuma ossigeno libero ed indurre ipossia per 18 h (Figura 1A) e un indicatore di anaerobiosi per misurare la tensione di ossigeno nella media11,12, 13, in un'incubatrice di cellulare contenente 5% CO2% e 95% aria a 37 ° C. Nota: Ci vogliono circa 1,5 h per il catalizzatore alla consuma ossigeno libero nel vaso. Pertanto, la HCMs sono conservati in vaso per 19,5 h prima che venga aperto il vaso. Il colore dell'indicatore di anaerobiosi cambia da luce blu in condizioni di normossia ambiente a bianco pallido in condizioni di ipossia (Figura 1B).</li>
	<li>Riossigenare HCMs spostando la piastra ben 6 in un incubatore a 37 ° C, contenente 5% CO2% e 95% aria per 2 h.</li>
</ol>3. preparazione di HCMs per citometria a flusso
<ol><li>Riscaldare la soluzione di 0,25% tripsina-Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) e PBS a 37 ° C.</li>
	<li>Aspirare il mezzo da ogni pozzetto, lavare le cellule con 1 mL di PBS e aggiungere 0,5 mL di tripsina 0,25% lungo la parete del pozzo.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C fino a quando tutti i HCMs sono quasi staccati (1 minuto circa).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di terreno completo DMEM (medium DMEM con 10% siero bovino fetale) ai pozzetti per neutralizzare la tripsina. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e pellet HCMs mediante centrifugazione a 500 x g per 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di terreno completo HCM e 0,5 mL di soluzione di lavoro di JC-1 in ogni provetta. Risospendere il HCMs pipettando su e giù.</li>
	<li>Coprire le provette intere con carta stagnola per evitare che lo sbiancamento dell'indicatore fluorescente e incubare HCMs in condizioni normali (a 37 ° C contenente 5% CO2% e 95% aria) per 20 min.</li>
	<li>Pellet HCMs mediante centrifugazione a 500 x g per 3 min a 4 ° C.</li>
	<li>Sciacquare HCMs due volte con 2 mL di buffer di macchiatura JC-1 ghiacciata.</li>
	<li>Risospendere HCMs in un volume finale di 300 µ l di tampone ghiacciata colorazione nella provetta del campione (12 x 75 mm) e utilizzare le cellule per l'analisi entro 30 min. Nota: Utilizzare Carbonil cianuro m-clorofenil idrazone (CCCP), un inibitore potente della catena respiratoria trasporto dell'elettrone, per il trattamento di HCMs per 1 h a una concentrazione di 20 µM, per il controllo positivo.</li>
</ol>4. flusso Cytometer Setup
<ol><li>Avviare il citometro a flusso e assicurarsi che il software sia collegato ad esso.</li>
	<li>Eseguire fluidica avvio, avviare il flusso e impostare il breakoff.</li>
	<li>Aprire due finestre di trama del puntino del software di citometria a flusso.<ol>
<li>Selezionare Avanti sparsi luce (FSC) sull'asse X e luce laterale sparsi (SSC) sull'asse Y nella prima trama dot per rappresentare le caratteristiche delle cellule nelle loro dimensioni e loro granularità, rispettivamente.</li>
		<li>Selezionare il canale di rilevamento (575 nm ± 26) PE per l'asse Y e FITC (530 ± 30 nm) per l'asse X utilizzando una scala logaritmica nella seconda trama dot, che viene utilizzata per misurare l'intensità di fluorescenza della tintura JC-1 nelle cellule.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. flusso Cytometry misurazione e analisi dei dati
<ol><li>Fare clic su Scarica per far fuori il tubo di supporto braccio e posizionare il vuoto (HCMs che non sono stati tinti con JC-1) del campione di tubo su di esso. Fare clic su carico per tornare il braccio di supporto del tubo alla posizione di lavoro.</li>
	<li>Fare clic su Record per raccogliere le particelle da sospensione nella provetta del campione in bianco e poi cancello la popolazione delle cellule (P1) per ulteriori analisi nel primo appezzamento di dot (Figura 3).</li>
	<li>Raccogliere HCMs in altre provette e ottimizzare la misurazione regolando le tensioni dei canali di fluorescenza, per assicurarsi che il punto di cella si trova nella zona centrale della trama del seconda punto.</li>
	<li>Visualizzare le statistiche di ogni provetta e MMP di ogni campione viene calcolato dividendo il rapporto di intensità di fluorescenza rossa da quella di intensità di fluorescenza verde.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1606915">Acute Myocardial Infarction.</a> New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li>
<li>Ibanez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation%3A+The+Task+Force+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).</li>
<li>Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Myocardial reperfusion injury.</a> New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).</li>
<li>Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+role+in+myocardial+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).</li>
<li>Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+cardioprotection%3A+signal+transduction+in+ischemic+pre-%2C+post-%2C+and+remote+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning.</a> Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).</li>
<li>Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+an+isolated+mitochondrial+population+revealed+by+cytofluorometric+analysis+at+the+single+organelle+level%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level.</a> Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).</li>
<li>Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+and+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Cossarizza, A., Salvioli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+using+JC-1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14(2001).</li>
<li>Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JC-1%2C+but+not+DiOC6%283%29+or+rhodamine+123%2C+is+a+reliable+fluorescent+probe+to+assess+delta+psi+changes+in+intact+cells%3A+implications+for+studies+on+mitochondrial+functionality+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis.</a> FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).</li>
<li>Chen, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+miR-128-3p+by+Tongxinluo+Protects+Human+Cardiomyocytes+from+Ischemia%2Freperfusion+Injury+via+Upregulation+of+p70s6k1%2Fp-p70s6k1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+autophagy+by+Tongxinluo+through+the+MEK%2FERK+pathway+protects+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+from+hypoxia%2Freoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+protects+mesenchymal+stem+cells+against+hypoxia+and+serum+deprivation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis.</a> Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.prot065490.short">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).</li>
<li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic-induced+preconditioning+delays+opening+of+mitochondrial+permeability+transition+pore+via+protein+Kinase+C-epsilon-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway.</a> Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Excessive+Histone+Deacetylases+Activity+in+Diabetic+Hearts+Attenuates+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Injury+via+Mitochondria+Apoptosis+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway.</a> Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).</li>
<li>Qiu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-induced+melanoma+cell+death+is+associated+with+mitochondrial+permeability+transition+pore+%28mPTP%29+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).</li>
<li>Zhen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+dependent+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+is+required+for+dexamethasone-induced+death+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts.</a> Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).</li>
<li>Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+as+a+potential+target+of+mitochondrial+superoxide+and+its+role+in+endothelial+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).</li>
<li>Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mitochondrial+KATP+channel+on+voltage-gated+K%2B+channel+in+24+hour-hypoxic+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).</li>
<li>Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neuroprotective+Effects+of+Hypothermia+on+Bilirubin-Induced+Neurotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro.</a> Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).</li>
<li>Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+Jiang+Zhi+Granule+protects+against+metabolic+stress-induced+hepatocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury.</a> World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).</li>
<li>El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renoprotective+Effects+of+Aldose+Reductase+Inhibitor+Epalrestat+against+High+Glucose-Induced+Cellular+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury.</a> Biomed Research International. 2017, 5903105(2017).</li>
<li>Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Liver+Mitochondria+Isolation%2C+Size+Fractionation%2C+and+Real-time+MOMP+Measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement.</a> Bio-Protocols. 6 (15), (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il MMP delle cellule dopo essere stati esposti per H/R. rilevato dall'analisi di JC-1, MMP delle cellule è indipendente da fattori quali dimensione mitocondriale, forma e densità che possono influenzare la fluorescenza di singolo-componente segnali di14. Di conseguenza, i risultati dell'analisi di JC-1 sono relativamente affidabili. Inoltre, è conveniente e risparmio di tempo per eseguire l'analisi di JC-1. Questo test ha un ...

Malattia coronarica è la principale causa di morte in tutto il mondo. Il trattamento della scelta per ridurre la lesione ischemica e limitando la dimensione di infarto in pazienti con ST-segmento elevato l'infarto miocardico è tempestiva ed efficace riperfusione miocardica via primaria intervento coronarico percutaneo (PCI)1, 2. Tuttavia, riperfusione determina danni aggiuntivi, che possono rappresentare fino al 30% della dimensione finale infarto3. È universalmente riconosciuto che il poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP) non è solo centrale nella morte delle cellule e danno mitocondriale durante ischemia/riperfusione (I / R), ma è anche un obiettivo convergente di cardioprotective segnalazione4 , 5. come l'apertura di mPTP porterebbe a depolarizzazione della membrana mitocondriale interna potenziali (MMP)4, abbiamo rilevato mPTP apertura utilizzando 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1 ′, 3, 3 '-tetraetile-imidacarbocyanineiodide (JC-1) dosaggio.
L'analisi di JC-1 è un metodo di citofluorimetria che è sia qualitativa che quantitativa, e che è stato ulteriormente convalidato analizzando le MMP al livello di un singolo mitocondri6. JC-1 esiste come forma aggregata, producendo un colore rosso a emissione colorata arancione (590 nm ± 17,5) nella matrice dei mitocondri con MMP normale; con la perdita di MMP, JC-1 viene convertito in forma monomerica che produce fluorescenza verde con un'emissione di 530 ± 15 nm. Di conseguenza, una diminuzione nel rapporto di intensità della fluorescenza rosso/verde potrebbe indicare la riduzione delle MMP in condizioni quali l'ischemia/riperfusione (I / R).
Oltre a JC-1, MMP è stato anche studiato con membrana permeabile cationi lipofilici quali rodamina 123 e 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine ioduro [DiOC6(3)]. Tuttavia, rispetto a queste due sonde, JC-1 è più affidabile per l'analisi di MMP. Rodamina 123 ha relativamente scarsa sensibilità (soprattutto in tempra modalità7,8) e scarsa specificità. Lo spostamento in rodamina 123 a volte è così piccolo che è difficile per i ricercatori o attrezzature osservare/rilevare. Inoltre, in una singola cella, ci sono siti di legame del mitocondrio differenti per rodamina 123 e così che esso può avere fluorescenza diverse emissioni9. DiOC6(3) non è raccomandato per la rilevazione di MMP o come reagisce in maniera sensibile per la depolarizzazione della membrana plasmatica10.
Pertanto, qui usiamo l'analisi di JC-1 per valutare il MMP di HCMs dopo essere stati esposti ad ipossia/riossigenazione con o senza un agente protettivo.

<table><tbody><tr><td>Kit per il saggio del potenziale della membrana mitocondriale con JC-1</td><td>Beyodtime, Cina</td><td>C2006</td><td>Nel kit ci sono JC-1 soluzione madre (200&volte;), tampone di colorazione madre (5&volte;) e CCCP (10mM)</td></tr><tr><td>Tongxinluo polvere ultrafine</td><td>Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Cina</td><td>071201</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI Kit</td><td>Becton-Dickinson, USA</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Miociti cardiaci umani</td><td>Promocell, Germania</td><td>C-12810</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita dei miociti (SupplementMix)</td><td>Promocell, Germania</td><td>C-39275</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita dei miociti (pronto all'uso)</td><td>Promocell, Germania</td><td>C-22070</td><td>utilizzato con l'integratore di terreno di crescita dei miocitiMix</td></tr><tr><td>GENbox</td><td>BioM&eacute; rieu, Marcy l' Etoile, Francia</td><td>96127</td><td>Catalizzatore da 2,5 litri</td></tr><tr><td>(AnaeroPack)</td><td>MITSUBISHI GAS CHEMICAL&nbsp; SOCIETÀ, INC., Giappone</td><td> Indicatore anaerobico C-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioM&eacute; rieu, Marcy l' Etoile, Francia</td><td>96118</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>Becton-Dickinson, USA</td><td>FACSAria 2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>Becton-Dickinson, USA</td><td></td><td>Versione8.0.1</td></tr><tr><td>Provetta per campioni</td><td>Corning science, USA</td><td>352054</td><td>12*75mm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone, USA</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr></tbody></table>

un'analisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Tempestivo ed efficace riperfusione dell'arteria coronaria occlusa è la migliore strategia per ridurre la dimensione di infarto del miocardio in pazienti con un segmento ST elevato di infarto miocardico. Tuttavia, riperfusione di per sé può provocare ulteriore del cardiomyocyte, un fenomeno noto come lesione di riperfusione. L'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), con la diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP), o la depolarizzazione mitocondriale, è universalmente riconosciuto come il passaggio finale di riperfusione ed è responsabile mitocondriale e morte dei cardiomiociti. JC-1 è una tintura cationica lipofilica che si accumula in mitocondri a seconda del valore di MMP. Più alto è il MMP, più JC-1 si accumula nei mitocondri. La quantità crescente di JC-1 in mitocondri può essere riflessa da uno spostamento di emissione di fluorescenza da verde (~ 530 nm) al rosso (~ 590 nm). Quindi, la riduzione del rapporto dell'intensità di fluorescenza rosso/verde può indicare la depolarizzazione dei mitocondri. Qui, prendiamo vantaggio di JC-1 per misurare MMP, o l'apertura di mPTP in miociti cardiaci umani dopo ipossia/riossigenazione, rilevato tramite flusso cytometry.

Prima di eseguire il test di JC-1 per valutare i cambiamenti di MMP, si consiglia vivamente che gli esperimenti condotti per confermare le condizioni correttamente impostato dai ricercatori. Come dimostrano i risultati di citometria a flusso (Figura 2), rispetto al gruppo normale, ipossia/riossigenazione (H/R) significativamente indotta l'apoptosi di HCMs (Annessina V + /PI±), che indica che avevamo stabilito un modello basato su cellule di I / R (± 45.00 2.1...

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il potenziale di membrana mitocondriale delle cellule dopo l'esposizione all'ipossia/riossigenazione con o senza un agente protettivo.

Un'analisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Questo metodo può aiutare a misurare l'effetto dell'ipossia/riossigenazione sulle cellule nel potenziale della membrana mitocondriale e può essere utilizzato per valutare se un agente è protettivo contro una lesione. Il vantaggio principale di questo test è che la MMP rilevata da esso è in caso di fattori come le dimensioni mitocondriali. Inoltre, ha un basso fabbisogno di materiali e luminosità.Iniziare con il 70% di miociti cardiaci umani confluenti in una piastra a sei pozzetti. Dopo aver lavato le cellule con soluzione salina tampone fosfato, aggiungere il farmaco o il veicolo in due millilitri di siero e DMEM privo di glucosio. Incubare in un incubatore per colture cellulari contenente il 5% di CO2 e il 95% di aria a 37 gradi Celsius per 30 minuti prima dell'ipossia.Dopo 30 minuti mettere il piatto di miociti cardiaci umani in un barattolo ermetico anipossico da 2,5 litri. Dotato di un catalizzatore per l'eliminazione dell'ossigeno libero e di un indicatore anerobico per misurare la tensione dell'ossigeno nel fluido. Posizionare il barattolo nell'incubatore per colture tissutali.Il colore dell'indicatore anerobico cambia dall'azzurro in ambiente normossico al bianco pallido in

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Saponina permeabilizzate preparazione fibra in collaborazione con respirometrico analisi fosforilazione ossidativa fornisce una valutazione integrativa della funzione mitocondriale. Respirazione mitocondriale in stati fisiologici e patologici possono riflettere varie influenze normative ivi comprese le interazioni mitocondriale, morfologia e biochimica.

Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate

Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri...

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Questo video mostra la marcatura delle cellule neuronali con anticorpi per i complessi della catena respiratoria mitocondriale, la proteina associata al DNA mitocondriale e la proteina della membrana esterna mitocondriale, seguita da citometria a flusso per quantificarne i livelli.

Misurazione di più parametri mitocondriali nei neuroni mediante citometria a flusso

Qui descritto è un metodo per rilevare e quantificare proteine ​​di membrana mitocondriale esterna da immunomarcatura di mitocondri isolati da tessuto roditore e l'analisi mediante citometria a flusso. Questo metodo può essere esteso a valutare aspetti funzionali di sottopopolazioni mitocondriali.

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

L'obiettivo del presente protocollo è quello di illustrare come utilizzare cardiomiociti neonatali del mouse come sistema modello per esaminare come i vari fattori possono alterare il consumo di ossigeno nel cuore.

Analizzando il tasso di consumo di ossigeno nei Cardiomyocytes neonatali coltivati primari del topo utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare

Le pompe di efflusso xenobiotico sono altamente attive nelle cellule staminali esemiche e progenitrici (HSPC) e causano l'estrusione di TMRM, una membrana mitocondriale potenziale disfunzione fluorescente. Qui, presentiamo un protocollo per misurare con precisione il potenziale della membrana mitocondriale negli HSPC da TMRM in presenza di Verapamil, un inibitore della pompa di efflusso.

Migliorare l'accuratezza del flusso Valutazione citometrica del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici attraverso l'inibizione delle pompe di efflusso

Qui descriviamo un metodo affidabile per misurare la massa mitocondriale e il potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche coltivate nell'ex vivo e nelle cellule T.

Misurazione della massa mitocondriale e del potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche e t-cellule da parte della citometria di flusso

Gli effetti distinti dei diversi gradi di ipotermia sulla protezione del miocardio non sono stati valutati a fondo. L'obiettivo del presente studio era quantificare i livelli di morte cellulare a seguito di diversi trattamenti di ipotermia in un modello umano a base di cardiomiociti, gettando le basi per una futura ricerca molecolare approfondita.

Valutazione in vitro della protezione del miocardio a seguito dell'ipotermia-precondizione in un modello di miociti cardiaci umani

Questo studio riporta un nuovo approccio per misurare più parametri funzionali mitocondriali basati sulla citometria a flusso e sulla doppia colorazione con due reporter fluorescenti o anticorpi per rilevare cambiamenti nel volume mitocondriale, potenziale di membrana mitocondriale, livello di specie reattive dell'ossigeno, composizione della catena respiratoria mitocondriale e DNA mitocondriale.

Analisi citometrica a flusso di parametri mitocondriali multipli in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali

Qui, presentiamo una raccolta di saggi per misurare direttamente la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero indipendentemente dalla loro capacità di consumare ossigeno molecolare.

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Scopri come misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci umani dopo ipossia/riossigenazione con il colorante JC-1. Questo metodo valuta efficacemente gli agenti protettivi contro il danno cellulare.

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Un'analisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione

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