Un'analisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione
13 luglio 2018
Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il potenziale di membrana mitocondriale delle cellule dopo l'esposizione all'ipossia/riossigenazione con o senza un agente protettivo.
Questo metodo può aiutare a misurare l'effetto dell'ipossia/riossigenazione sulle cellule nel potenziale della membrana mitocondriale e può essere utilizzato per valutare se un agente è protettivo contro una lesione. Il vantaggio principale di questo test è che la MMP rilevata da esso è in caso di fattori come le dimensioni mitocondriali. Inoltre, ha un basso fabbisogno di materiali e luminosità.
Iniziare con il 70% di miociti cardiaci umani confluenti in una piastra a sei pozzetti. Dopo aver lavato le cellule con soluzione salina tampone fosfato, aggiungere il farmaco o il veicolo in due millilitri di siero e DMEM privo di glucosio. Incubare in un incubatore per colture cellulari contenente il 5% di CO2 e il 95% di aria a 37 gradi Celsius per 30 minuti prima dell'ipossia.
Dopo 30 minuti mettere il piatto di miociti cardiaci umani in un barattolo ermetico anipossico da 2,5 litri. Dotato di un catalizzatore per l'eliminazione dell'ossigeno libero e di un indicatore anerobico per misurare la tensione dell'ossigeno nel fluido. Posizionare il barattolo nell'incubatore per colture tissutali.
Il colore dell'indicatore anerobico cambia dall'azzurro in ambiente normossico al bianco pallido in condizioni di ipossia. Riossigenare i miociti cardiaci umani rimuovendo la piastra a sei pozzetti dal barattolo e posizionandola sullo scaffale dell'incubatrice per due ore. Dopo la riossigenazione, sciacquare le cellule con un millilitro di PBS preriscaldato e aggiungere 0,5 millilitri di tripsina preriscaldata al 25% lungo la parete del pozzetto.
Incubare a 37 gradi Celsius per circa un minuto fino a quando tutti i miociti cardiaci umani sono quasi staccati. Quindi aggiungere un millilitro di DMEM completo ai pozzetti per neutralizzare la tripsina. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e pellettare gli HCM centrifugando a 500 volte G per tre minuti, a temperatura ambiente.
Dopo la centrifugazione, aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare i pellet. Quindi aggiungere 5 millilitri di terreno completo per miociti cardiaci umani e 5 millilitri di soluzione di lavoro JC-1 a ciascuna provetta. Risospendere gli HCM pipettandoli su e giù.
Coprire le provette con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento dell'indicatore fluorescente e incubare le cellule in condizioni normali per 20 minuti. Dopo aver pellettato i miociti cardiaci umani centrifugando a 500 volte G per tre minuti in una centrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius, sciacquare le cellule due volte con due millilitri di tampone di colorazione JC-1 ghiacciato. Dopo il secondo risciacquo, risospendere i miociti cardiaci umani in 300 microlitri di tampone per colorazione ghiacciata.
E filtrare i campioni nelle rispettive provette. Analizzare le cellule mediante citometria a flusso entro 30 minuti. Avviare il citometro a flusso e assicurarsi che il software sia collegato.
Eseguire l'avvio fluidico. Avvia lo streaming e imposta la pausa. Apri due finestre dot plot nel software di citometria a flusso.
Selezionare la luce diffusa in avanti sull'asse X e la luce diffusa lateralmente sull'asse Y nel primo grafico a punti. Per rappresentare le caratteristiche delle cellule in termini di dimensioni e granularità, rispettivamente. Selezionare il canale di rilevamento PE per l'asse Y.
E FITC per l'asse X, utilizzando una scala logaritmica nel secondo grafico a punti, che viene utilizzato per misurare l'intensità di fioritura del colorante JC-1 nelle cellule. Fare clic su scarica per far uscire il braccio di supporto della provetta e posizionare la provetta del campione vuota contenente miociti cardiaci umani che non sono stati colorati con JC-1. Fare clic su carica per riportare il braccio di supporto nella posizione di lavoro.
Fare clic su Registra per raccogliere le particelle dalla sospensione nella provetta del campione vuoto. E regola le tensioni dei canali di fluorescenza nel secondo grafico a punti. Gate la popolazione cellulare per ulteriori analisi nel primo dot plot.
Successivamente, analizza i miociti cardiaci umani. Visualizza le statistiche di ciascuna provetta del campione e calcola gli MMP di ciascun campione dividendo il rapporto tra l'intensità della farina rossa e quella dell'intensità della farina verde. L'ipossia e la riossigenazione inducono significativamente l'apoptosi dei miociti cardiaci umani, rispetto alle cellule normali, misurate dal rapporto PI dell'annessina.
una medicina tradizionale cinese con effetti cardioprotettivi, previene l'apoptosi degli HCM dopo ipossia/riossigenazione. Come mostrato qui, il rapporto rosso/verde JC-1 dopo il trattamento con il CCP mitocondriale era quasi nullo. Coerente con i risultati del test dell'apoptosi.
Il gruppo trattato con H/R ha mostrato un rapporto rosso/verde significativamente più basso, rispetto al gruppo normale. E ha invertito tale cambiamento di rapporto. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di avviare le cellule caricate con JC-1 in un tampone ghiacciato, poiché la temperatura ha un effetto considerevole sulla stabilità del potenziale della membrana mitocondriale.
Seguendo questa procedura, altri metodi come la manipolazione genetica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come se la diminuzione di MMP derivi dall'apertura di MPTP.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo utilizza il colorante JC-1 per valutare il potenziale di membrana mitocondriale (PMM) delle cellule sottoposte a ipossia/reossigenazione. Valuta anche gli effetti protettivi degli agenti contro il danno cellulare.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Biologia cellulare
- Funzione mitocondriale
- Ricerca sull'ipossia
Sfondo
- Il potenziale di membrana mitocondriale è cruciale per la sopravvivenza cellulare.
- L'ipossia/reossigenazione può portare a danni cellulari.
- Gli agenti protettivi possono mitigare questi effetti.
- Il colorante JC-1 è un indicatore affidabile dei cambiamenti del PMM.
Obiettivo dello studio
- Misurare l'impatto dell'ipossia/reossigenazione sul PMM.
- Valutare gli effetti protettivi di agenti specifici.
- Fornire un saggio a basso consumo per la valutazione del PMM.
Metodi utilizzati
- Coltivare miociti cardiaci umani al 70% di confluenza.
- Lavare le cellule con tampone fosfato salina.
- Incubare con farmaco o veicolo in DMEM privo di siero.
- Esporre le cellule a condizioni di ipossia per la valutazione.
Risultati principali
- Dimostrati cambiamenti nel PMM dovuti all'ipossia/reossigenazione.
- Identificati effetti protettivi degli agenti sul PMM.
- Mostrati bassi requisiti di materiale per il saggio.
- Evidenziata l'influenza della dimensione mitocondriale sulla rilevazione del PMM.
Conclusioni
- Il saggio JC-1 è efficace per valutare i cambiamenti del PMM.
- Gli agenti protettivi possono influenzare significativamente i risultati del PMM.
- Questo metodo è accessibile ed efficiente per gli studi cellulari.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial membrane potential (MMP) is critical for evaluating cardioprotective strategies in ischemia-reperfusion injury models. This flow cytometry-based JC-1 assay provides a quantitative, high-throughput readout of mitochondrial depolarization in human cardiac myocytes, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting reperfusion injury. The method supports target validation by linking MMP changes to mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, a key event in cardiomyocyte death.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures MMP as a functional readout of mitochondrial health and mPTP opening in disease-relevant human cardiac myocytes.
- Operational Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding cytoprotective agents under hypoxia/reoxygenation stress.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating MMP preservation with reduced apoptosis, as demonstrated by Annexin PI ratio.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: JC-1’s red/green fluorescence ratio provides a ratiometric, mitochondria-specific readout independent of cell size or granularity.
- Operational Value: Low material requirements and compatibility with standard flow cytometry platforms support assay scalability and reproducibility.
- Screening Readiness: Enables rapid evaluation of compound libraries for effects on MMP in a physiologically relevant human cell model.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses human cardiac myocytes to enhance translational relevance over rodent models in ischemia-reperfusion studies.
- Operational Value: Standardized hypoxia/reoxygenation protocol allows consistent induction of mitochondrial depolarization for compound testing.
- Predictive Value: Facilitates go/no-go decisions by linking MMP protection to functional outcomes like reduced apoptosis.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insights into mitochondrial dysfunction in cardiovascular disease models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of MMP as a biomarker of mPTP activation and reperfusion injury severity.
- Screening: Delivers quantitative, normalized fluorescence ratio data suitable for hit selection and dose-response profiling.
- Analytics: Generates red/green intensity ratio metrics that allow statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Uses human-derived cells to improve predictive confidence for preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted across cardiotoxicity and cardioprotection screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mitochondrial depolarization as a convergent point of reperfusion injury pathways.
- Operational Value: Minimizes variability by normalizing MMP readout to mitochondrial content via ratiometric JC-1 detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of compounds that preserve MMP and reduce apoptotic commitment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating MMP stabilization in human cardiac myocytes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cardiac myocyte culture and hypoxia/reoxygenation modeling.
- Dependent on flow cytometry with FITC and PE detection channels and logarithmic fluorescence scaling.
- Necessitates strict temperature control during JC-1 staining to preserve mitochondrial membrane potential integrity.
- Requires standardization of hypoxia duration and reoxygenation timing across experimental groups.
- Limited to adherent cell types amenable to trypsinization and washing without loss of viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Establishment of Hypoxia/Reoxygenation Model
1:57
Preparation of HCMs for Flow Cytometry
3:49
Flow Cytometer Setup
4:43
Flow Cytometry Measurement and Data Analysis
5:40
Results: Validation of the Establishment of Hypoxia/Reoxygenation (H/R) Model by Flow Cytometry
6:34
Conclusion
