Un saggio di Neurosphere per valutare l'attivazione delle cellule staminali neurali endogene in un modello murino di ferita del midollo spinale Minimal

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande relative al ruolo delle cellule precursori neurali nella medicina rigenerativa. In particolare, possiamo chiederci in che modo la lesione influisce sul comportamento delle cellule precursori neurali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un approccio per studiare l'effetto della lesione del midollo spinale sulla cinetica endogena delle cellule precursori neurali.

La dimostrazione visiva di queste tecniche è fondamentale. Poiché le fasi chirurgiche e di dissezione richiedono precisione e possono essere difficili da imparare, anche se possono essere perfezionate con la pratica. Prima di iniziare la procedura, utilizzare un tagliacapelli per rimuovere il pelo dal dorso di un topo anestetizzato dalla metà della schiena al collo e alle orecchie.

Dopo aver fissato il topo in un dispositivo stereotassico, posiziona quattro o cinque pezzi di garza arrotolata sotto l'addome, tirando leggermente la base della coda per raddrizzare il corpo e la colonna vertebrale. Spingere il rotolo di garza toracica rostralmente dall'addome del topo verso la parte superiore del torace per sostenere la colonna vertebrale toracica. E usa del nastro adesivo da laboratorio per fissare la coda e gli arti con un orientamento simile a una stella.

Dopo aver disinfettato la pelle esposta con tamponi sequenziali di etanolo al 70% e iodio povidone, utilizzare una lama di bisturi numero 10 per praticare un'incisione verticale parallela all'asse longitudinale dell'animale, dal punto medio di entrambe le scapole, alla curvatura della colonna vertebrale toracica. Ritrarre la pelle per esporre i tessuti molli e il contorno della colonna vertebrale. E identificare il bordo inferiore del cuscinetto adiposo super scapolare.

Quindi, usa il bisturi per tagliare con attenzione ma con forza lungo entrambi i lati delle ossa vertebrali da T5 a T8 e nove ossa, per staccare i tendini dei muscoli posteriori dalla colonna vertebrale. Riposizionare i divaricatori in modo che i denti dei divaricatori siano inseriti nel sito di incisione su entrambi i lati della colonna vertebrale. Ed espandere ogni divaricatore per regolare l'esposizione, fino a quando la colonna vertebrale non è sufficientemente sollevata senza mettere a dura prova gli strati muscolari retratti.

Sotto un microscopio operatorio, pulire accuratamente il muscolo residuo e altri tessuti molli sovrastanti la colonna vertebrale, per esporre l'osso vertebrale. Afferrare il processo spinoso delle vertebre con una pinza dentata e muovere leggermente la pinza su e giù per identificare le vertebre che verranno rimosse. Successivamente, inserire una punta di un paio di forbici smussate ricurve su entrambi i lati del forame intervertebrale esposto, caudale alla lamina vertebrale da asportare.

E tagliare bilateralmente le articolazioni intervertebrali di collegamento. Quindi, sollevare la lamina verso l'alto e tagliare l'attacco superiore della lamina per isolare e rimuovere l'osso. Quando si taglia e si rimuove la lamina vertebrale, fare attenzione a inclinare sempre le forbici verso l'alto per non danneggiare il midollo spinale sottostante.

Con le vene della linea mediana dorsale che fungono da punto di riferimento, inserire l'asta piegata di 45 gradi della punta di un ago da 30 calibri, con il lato smussato rivolto verso l'alto, a un millimetro di profondità nella superficie laterale dorsale del midollo spinale. E circa 0,5 millimetri lateralmente a entrambi i lati della linea mediana. Spostare l'ago di circa due millimetri dalla direzione caudale a quella rostrale, in modo che l'intera lunghezza dello smusso sia inserita nel cordino.

Quindi, ripercorri il percorso dell'ingresso per rimuovere l'ago. Per chiudere la ferita, rimuovere il divaricatore e utilizzare una sutura assorbibile 6-0 per unire i muscoli della schiena su entrambi i lati della lesione lungo la linea mediana. E una sutura di seta 4-0 per chiudere la pelle sovrastante.

Per isolare le neurosfere, praticare un'incisione sulla linea mediana della pelle lungo l'intera lunghezza della schiena per esporre il contorno del muscolo e dell'osso vertebrale. Solleva l'aspetto mediale di ciascuna scapola e usa le forbici per tagliare via il tessuto molle tra la scapola e le vertebre. Quando la colonna vertebrale sottostante è stata esposta, inserire le forbici nell'apertura toracica superiore, seguendo la curvatura della colonna vertebrale, e tagliare le costole attaccate, i muscoli e gli organi interni per isolare la colonna vertebrale.

Inserire le forbici nel forame vertebrale caudale e tagliare le articolazioni intervertebrali ai lati delle lamine, facendo attenzione a non danneggiare il midollo integro. Quando la lunghezza appropriata del midollo è esposta, tagliare con cura tutti i nervi spinali che si estendono lateralmente dal midollo, prima di trasferire il tessuto del midollo spinale in una capsula di Petri di liquido cerebrospinale artificiale regolare su ghiaccio. Sotto un microscopio da dissezione, tagliare il tessuto del midollo spinale in modo da includere circa due millimetri di tessuto rostrale e caudale al sito della lesione e utilizzare due paia di pinze sottili per separare delicatamente il midollo in due metà longitudinali, lungo le fessure dorsali e ventrali.

Usa le micro forbici per tagliare la sostanza bianca laterale dorsale ferita. E posizionare il tessuto danneggiato in un tubo conico da 15 millilitri. Tenendo una metà del midollo spinale con la pinza, stuzzicare e rimuovere la sostanza bianca illesa con due paia di pinze lungo l'estensione caudale rostrale del midollo spinale, per isolare la regione periventricolare appropriata.

Dopo aver isolato la sostanza bianca lesa e le regioni periventricolari associate dall'altra metà del midollo spinale allo stesso modo, posizionare i pezzi di tessuto periventricolare in singoli tubi conici da 15 millilitri. E usa le micro forbici per tritare delicatamente il tessuto contro le pareti delle provette. Una volta completata la procedura di digestione dei tessuti e ottenuta la sospensione di una singola cellula, impostare una coltura della neurosfera aggiungendo 10 millilitri del terreno appropriato in un pallone di coltura tissutale da 25 millilitri per condizione cellulare.

E aggiungere le cellule staminali neurali isolate fino a una densità clonale di 10 cellule per microlitro per la loro coltura in un incubatore di colture cellulari. Dopo 24 ore, agitare delicatamente i palloni e travasare il contenuto in singole provette coniche da 15 millilitri per la centrifugazione. Risospendere i pellet in uno o due millilitri di terreno basale neurale fresco per il conteggio.

E piastrano le cellule a densità clonale in una piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti per condizione, contenente 500 microlitri del terreno integrato con mitogeno corrispondente appropriato per pozzetto. Quindi, far crescere le neurosfere nell'incubatore di coltura cellulare per sette giorni. Cinque giorni dopo la lesione minima del midollo spinale, il numero assoluto di neurosfere derivate da cellule staminali neurali definitive è maggiore del numero di neurosfere derivate da cellule staminali neurali primitive.

Le neurosfere definitive mostrano un diametro maggiore e un grande centro scuro. Mentre le neurosfere primitive sono di dimensioni più piccole e più compatte. Una lesione minima del midollo spinale induce un aumento significativo delle neurosfere cresciute dal canale centrale a livello della lesione, rispetto a un aumento relativamente modesto del canale centrale, rostrale al livello della lesione.

Le neurosfere definitive possono anche essere generate dalla sostanza bianca lesionata a livello della lesione. Una regione che non contiene neurosfere che formano cellule negli animali da soli laminectomia. Un aumento simile delle cellule staminali neurali primitive si osserva dopo la lesione, con l'eccezione delle neurosfere primitive nella sostanza bianca a livello del sito della lesione.

Una volta padroneggiata, la tecnica chirurgica può essere eseguita in meno di 40 minuti. E la dissezione e l'isolamento dei tessuti possono essere eseguiti in meno di 30 minuti, se eseguiti correttamente. Dopo la procedura chirurgica, a seconda del ceppo animale, possono essere utilizzate metodologie aggiuntive come l'immunoistochimica e lo shock del lineato, per rispondere a ulteriori domande come la cinetica di proliferazione e l'auto-destino delle cellule precursori neurali dopo la lesione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il test della neurosfera per valutare l'attivazione delle cellule staminali neurali, dopo una lesione del midollo spinale.