Name: Ca2 + risposte di imaging durante linfezione delle cellule epiteliali Shigella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri l'imaging delle risposte del calcio in cellule epiteliali HeLa durante l'infezione da Shigella. Questo metodo di microscopia a fluorescenza con sonde chimiche caratterizza segnali Ca2+ locali e globali atipici.

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Ringraziamo Thomassin Jenny-Lee per il suo aiuto nella redazione del manoscritto. Il lavoro è stato supportato da ANR concede MITOPATHO e PATHIMMUN, concede dal Labex Memolife e PSL IDEX Shigaforce. Chunhui Sun è un beneficiario di una sovvenzione di pH.d. dal Consiglio di borsa di studio di Cina. Laurent Combettes e Guy Tran Van Nhieu sono destinatari di un cambio di WBI-Francia Tournesol programma N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des Partenariats Hubert Curien).

1. preparati
<ol><li>
Preparazione di batteri
	<ol>
<li>I batteri del piatto — ceppo selvaggio-tipoShigella esprimendo l'adesina AfaE (M90T-AfaE) — su un trypticase agar soia (TCS) piastra contenente 0,01% Congo rosso (CR) e li Incubare per 18 h a 37 ° C. Nota: Per aumentare la loro riproducibilità, le piastre di Shigella ottenute al passaggio 1.1.1 sono conservate a 4 ° C e devono essere utilizzate entro una settimana, perché tutte le colonie su supporto CR alla fine diventerà rosse nel corso del tempo.</li>
		<li>Inoculare TCS brodo di pre-coltura selezionando 3 colonie rosse dalle piastre striatura. Nota: Un'inoculazione con 3 colonie viene eseguita per limitare la probabilità di scegliere un singolo clone cui plasmide di virulenza ha subito una ricombinazione genetica.</li>
		<li>Crescere le colture batteriche liquide in un incubatore d'agitazione per 16 h a 37 ° C a 200 giri/min. Aggiungere ampicillina ad una concentrazione finale di 75 mg/mL. Le concentrazioni di antibiotiche non devono superare 3 x la concentrazione inibitoria minima, come un eccesso di antibiotico può portare alla perdita del plasmide di virulenza grande. Nota: La manutenzione del plasmide di virulenza di Shigella deve essere verificata da colture batteriche su piastre CR completati con concentrazioni di antibiotiche appropriate di placcatura. La presenza di colonie bianchi indica una perdita di plasmide.</li>
		<li>Inoculare la cultura TCS con la pre-coltura batterica ad una diluizione di 1: 100. Incubare a 37 ° C in un incubatore d'agitazione per 2 h a 200 giri/min. Garantire che la densità ottica a 600 nm (OD600nm) è di 0,2 - 0,4.</li>
		<li>Centrifugare la coltura batterica per 2 min a 13.000 x g a 21 ° C e risospendere il pellet in un volume equivalente di mezzo EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, glucosio di 5 mM e 25 mM HEPES pH = 7.3).</li>
		<li>Diluire la sospensione batterica in un buffer di EM un finale OD600nm di 0.1 e utilizzarlo da subito o conservarlo a 21 ° C e utilizzarlo entro i prossimi 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle cellule
	<ol>
<li>Cellule HeLa di cultura in DMEM con 1 g/L di glucosio completati con 10% siero fetale di vitello (FCS) e farle crescono a 37 ° C con 10% CO2. Crescere TC-7 coltivate in DMEM con 4,5 g/L di glucosio, contenente 10% FCS e gli aminoacidi non essenziali in un incubatore a 37 ° C contenente 10% CO2.</li>
		<li>Per la manutenzione delle cellule, dividere le celle regolarmente, per evitare un'inibizione di crescita-contatto collegata agli Stati confluenti; Questo è fondamentale per un'elevato Ca2 + sonda caricamento/efficienza transfezione.</li>
		<li>Piastra di cellule HeLa sulla sterile 25 mm diametro circolare coprioggetti in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 3 x 105 cellule/pozzetto il giorno prima dell'esperimento per le cellule HeLa.</li>
		<li>Per cellule TC-7, tripsinizzano e contare le celle. Semi a 4 x 105 cellule/pozzetto e incubare li 5-7 giorni a 37 ° C in un 10% CO2-incubatore prima degli esperimenti per consentire una polarizzazione.<ol>
<li>Aggiornare il mezzo di coltura cellulare ogni giorno fino al giorno dell'esperimento. Nota: Chambers USA e getta di diametro 35 mm con fondo di vetro può anche essere utilizzato come alternativa ai pozzetti contenenti coprioggetti. Se questi ultimi sono utilizzati, controllo della temperatura attraverso un piatto riscaldato o obiettivo non è sufficiente, e una camera di incubazione termostato montato sul tavolino del microscopio è necessario.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, rimuovere il supporto e lavare le cellule 3 x con il mezzo di 1ml EM a 21 ° C.</li>
	<li>Caricare le celle con 3mm Fluo-4am14 in un buffer di EM per 30 min a 21 ° C. Nota: Mentre il caricamento delle cellule HeLa Sub-confluenti non genera problemi principali, il caricamento di cellule polarizzate TC-7 è spesso eterogeneo e scarsamente efficiente. Per queste cellule, abbiamo trovato che l'efficienza di caricamento è migliorata con l'aggiunta dell'agente disperdente — pluronic acido — ad una concentrazione finale di 0,1% e l'anione-trasportatore inibitore bromosulfophtalein ad una concentrazione finale di 20 µM per il Fluo-4-AM-contenente EM. L'uso di raziometrici chimico sonde o geneticamente codificato-FRET sonde che richiedono dual-acquisizione non è compatibile con la velocità di acquisizione necessaria per l'imaging del locale Ca2 + le risposte.</li>
	<li>Lavare i campioni 3 x con EM buffer e ulteriormente li Incubare in 1 mL di tampone di EM a 21 ° C per consentire l'idrolisi della parte dell'AM. Uso Fluo-4 caricato cellule immediatamente o entro i prossimi 90 min (mantenuta a 21 ° C).</li>
</ol>2. infezione e acquisizione di immagini di locale Ca2 + risposte
<ol><li>Posizionare il vetrino coprioggetto contenente le celle di Fluo-4 caricato in una camera di imaging o con fondo di vetro camera. Lavare i campioni nella camera di imaging o USA e getta con fondo di vetro camera 3x con buffer di EM per rimuovere i composti potenzialmente derivanti da lisi cellulare. Aggiungere 1 mL di tampone di EM.</li>
	<li>Posizionare la camera su un palcoscenico di microscopio di fluorescenza invertito riscaldato a 33 ° C. Nota: Questa temperatura è selezionata come un compromesso tra le temperature ottimali compatibili con il processo di invasione di Shigella e il rallentamento del Ca2 + le risposte di visualizzare risposte locali. Usiamo un 63 X obiettivo a immersione in olio (NA = 1.25) dotati di anelli di contrasto di fase.</li>
	<li>Selezionare un campo di microscopia e impostare i parametri di acquisizione, incluso il tempo di esposizione e binning se necessario, per ottimizzare il segnale fluorescente Fluo-4. Nota: Le principali sfide del locale Ca2 + formazione immagine sono la bassa ampiezza e la piccola durata delle risposte, che richiedono acquisizione almeno ogni 30 ms più commercialmente disponibili retro-illuminato EM-CCD o C-MOS telecamere presentano la necessaria sensibilità per rilevare locale Ca2 + risposte utilizzando Fluo-4. Sensibilità di rilevazione è anche una questione importante per limitare photodamage o manufatti quali risposte spontanee collegate all'eccitazione fluorescente di Fluo-4 ad alta frequenza. Qui, un'illuminazione basati su LED di 470 nm, con un filtro di eccitazione di 480 ± 40 nm passa-banda, un filtro dicroico 505 nm e un 527 emissione del passa-banda ± 30 nm usato al 5% della sua massima intensità combinata con un filtro a densità neutra 1,0 sono stati utilizzati per ridurre al minimo questi problemi sotto un flusso di acquisizioni di durata limitata. Un'analisi del Ca2 + segnali locali di lotti di 120 flussi di s è stata effettuata ordinariamente. In queste condizioni di bassa illuminazione, fluoroforo photobleaching non è stata osservata durante le acquisizioni di min-flusso 2. Acquisizioni successive sullo stesso campione possono essere eseguite, condizione diversi campi sono utilizzati. Come regola generale, un primo flusso di acquisizione viene eseguito su un campo di controllo in assenza di stimolazione di batteri per garantire l'assenza di risposte spontanee. Se si osservano le risposte spontanee, i campioni sono lavati con un tampone di EM fino a quando non risposte sono osservate.</li>
	<li>Per aggiungere i batteri al campione, rimuovere 500 µ l di tampone di EM dalla camera e aggiungere 500 µ l della sospensione batterica preparata al punto 1.1.6 per ottenere un finale OD600nm di 0.05, con la cura adeguata per evitare di spostare il campo selezionato microscopia; i volumi di garantiscono una corretta miscelazione dei batteri e una distribuzione omogenea dei batteri su campioni di cellule.</li>
	<li>Eseguire un'acquisizione su aggiunta batterica. In alternativa, eseguire un'acquisizione 10 min dopo l'aggiunta di batterico, che corrisponde al tempo necessario per i batteri di sedimento sulle cellule nelle circostanze usate. Alla fine del flusso acquisizione, acquisire un'immagine di contrasto di fase del campo selezionato per visualizzare i batteri a contatto con le cellule e il volant di membrana associato ai siti di invasione batterica.</li>
	<li>Ripetere la procedura di acquisizione come descritto al punto 2.5, a intervalli che sono favorevoli alla durata delle acquisizioni di immagine, file risparmio e selezione di un nuovo campo per coprire l'intero processo. Nota: Per Shigella, abbiamo trovato che acquisizione flussi ogni 5 min per 20 min, seguendo la sedimentazione batterica di 10 min, ha permesso di coprire la maggior parte degli eventi invasione.</li>
	<li>Al termine della procedura di acquisizione, è necessario aggiungere una concentrazione finale di 2 µM di Ca2 + ionoforo ionomicina campioni per determinare la massima ampiezza di Ca2 + segnali. Acquisire immagini ogni 3-5 s fino al segnale di stabilizzazione, di solito per meno di 10 min.</li>
	<li>Seguire con l'aggiunta di Ca2 + chelante EGTA ad una concentrazione finale di 10 mM per determinare il segnale di fluorescenza in assenza di Ca2 +. Acquisire immagini ogni 3-5 s fino al segnale di stabilizzazione, di solito per meno di 10 min. Nota: A causa della relativamente lenta dinamica delle variazioni2 + Ca globale, eseguire queste acquisizioni ogni 3-5 s (non in modalità streaming), permettendo per Ca2 + imaging nello stesso campo microscopico durante i trattamenti successivi.</li>
</ol>3. analisi
<ol><li>Rapidi2 + variazioni di Ca citosolici nel tempo come la percentuale di ΔF/F0, dove ΔF rappresenta la variazione dell'intensità di fluorescenza media della regione di interesse (ROI) e F0 la fluorescenza di base nello stesso ROI, a cui un regione non rilevanti del campo privo di cellule viene sottratto.<ol>
<li>Rimuovere i livelli basali di fluorescenza per ogni cella in diversi campi, corrispondenti ai livelli basali; questi livelli possono essere determinati in modo non ambiguo a causa della bassa frequenza e relativamente di breve durata di Ca2 + risposte locali in un'acquisizione di flusso specificato. Nota: Quantificare caratteristiche sorprendenti delle risposte relazionate alle domande poste e il modello patogeno studiato. Classicamente, vari parametri sono presi in considerazione per analizzare il Ca2 + segnali, tra cui la frequenza delle cellule risultati locali o globali Ca2 + risposte, così come la durata, ampiezza e frequenza di queste risposte. Nel caso di Shigella e risposte locali, un altro aspetto importante dell'analisi è l'associazione spaziale delle risposte con i siti di invasione batterica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per quantificare la percentuale di cellule rispondenti le risposte globali o locali, disegnare ROIs in cellule, nelle serie temporali corrispondenti alle variazioni di intensità di Fluo-4.<ol>
<li>Impostare parametri precisi per identificare locale Ca2 + risposte, ad esempio un'ampiezza di variazioni dello sfondo sopra triplice della linea di base delle cellule di fluorescenza media intensità o una durata di almeno 200 ms, per evitare segnando un falso positivo. Nota: Come regola generale, anche i piccoli Ca2 + risposte locali possono essere distinto da qualsiasi rumore di fondo dal loro profilo. Il ROIs dovrebbe essere sufficiente per integrare abbastanza segnali di fluorescenza per consentire la rilevazione delle variazioni locali. A seconda dell'intensità della rilevazione Fluo-4, questi ROIs può corrispondere a cerchi con diametri che vanno da 2-5 mM.</li>
		<li>Misurare le variazioni dell'intensità di fluorescenza di Fluo-4 media in 2 regioni in una zona distinta della cella stessa, per determinare se le risposte sono locali o globali. Nota: L'analisi di un gran numero di cellule è facilitato dall'uso di software che permette la visualizzazione on-line delle variazioni dell'intensità di fluorescenza media nel tempo per le regioni selezionate di imaging. Software di imaging disponibili in commercio ha una tale opzione, ma questo può essere eseguito anche utilizzando il freeware di Icy , utilizzando il plugin di ROI intensità Evolution .</li>
		<li>Determinare la percentuale di cellule che mostrano risposte locali. Nota: Questa percentuale è calcolata dal numero totale delle cellule analizzate nel campo della microscopia, che dovrebbe essere in numero sufficiente per supportare un statisticamente significato utilizzando un test non parametrico.</li>
		<li>Determinare la durata delle risposte locali. Nota: Locale Ca2 + le risposte possono essere ulteriormente distinti secondo le loro gamme di durata (cioè, meno di 500 ms, tra 5 e 10 s, o superiore a 10 s) e la loro associazione con siti di invasione di Shigella .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificare l'ampiezza delle risposte. In primo luogo, calibrare i Ca2 + e delle cellule sfondo i livelli massimi determinati come descritto al punto 2.1.7. Poiché il carico di Fluo-4 può variare per ogni cella, è possibile eseguire queste determinazioni per le singole celle nel campo.<ol>
<li>L'ampiezza delle risposte si esprime come percentuale relativa della risposta massima.</li>
		<li>Eseguire il test statistico utilizzando un test di normalità, seguito da un test parametrico per analizzare le differenze di potenziale nell'ampiezza delle risposte tra i campioni.</li>
		<li>Determinare l'associazione di queste risposte riguardante i siti di invasione batterica dalla loro rispettiva localizzazione per il volant di membrana batterica-indotta visualizzati nelle immagini di contrasto di fase corrispondente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li>
<li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+Ca2%2B+requirement+of+calpain+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fluorescent+Ca2%2B+indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li>
<li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2%2B+signals+during+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li>
<li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes%2C+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Questo manoscritto descrive il protocollo che abbiamo progettato per seguire Ca2 + segnali locali durante la cinetica relativamente breve di un'invasione di Shigella , nonché global Ca2 + le risposte durante la cinetica estesa di Shigella. Di seguito, chiave possono essere rilevati problemi che devono essere affrontate per ottimizzare l'individuazione di Ca2 + segnali, riducendo al minimo qualsiasi interferenza con i processi biologici.
Chimica <...

CA2 + regola tutti i processi conosciuti delle cellule, tra cui la riorganizzazione del citoscheletro, le risposte infiammatorie e vie di morte cellulare relazionate al ospite-patogeno interazioni1,2,3. In condizioni fisiologiche, basale concentrazioni Ca2 + citosoliche sono basse, in alcune centinaia di nM, ma possono essere soggetti ad aumenti transitori dopo stimolazione agonista. Queste variazioni mostrano spesso comportamento oscillatorio attraverso l'azione delle pompe e canali alle membrane del reticolo endoplasmatico e del plasma. Il modello di queste oscillazioni si caratterizza per il periodo, la durata e l'ampiezza del Ca2 + aumenta e viene decrittografato dalle cellule che, a loro volta, innescano risposte specifiche in quello che è noto come il Ca2 + codice4,5 . Un aumento marcato la concentrazione Ca2 + citosolico in condizioni patologiche può portare alla morte cellulare connessa con la permeabilizzazione delle membrane mitocondriali e il rilascio di pro-apoptotici o necrotico fattori6, 7.
Shigella, l'agente eziologico della dissenteria bacillare, invade le cellule epiteliali iniettando effettori nelle cellule ospiti utilizzando un tipo di secrezione di III (T3SS) sistema8,9. Un'invasione di Shigella delle cellule dell'ospite è associata con Ca2 + segnali locali e globali suscitati dalla T3SS. Per quanto riguarda poro-formare tossine, il Traslocone T3SS inserisce in membrane cellulari host e è necessario per l'iniezione di T3SS effettori è probabile responsabile dell'attivazione di PLC e la (1, 4, 5) l'inositolo trifosfato (InsP3)-dipendente Ca2 + rilascio. La combinazione di stimolazione localizzata PLC e l'accumulo di actina polimerizzata in siti di un risultato di invasione di Shigella in un insolitamente lunga durata InsP3-dipendente Ca2 + rilascio10. L'effettore III tipo IpgD, un fosfatidil 4,5 bifosfato (PIP2) -4-fosfatasi, limita la quantità di locale di PIP2, controllando così la quantità di substrato disponibile per PLC generare InsP3, che contribuisce al confino di locale Ca2 + risposte all'invasione batterica siti11,12. Questi Ca2 + risposte locali probabile contribuiscono per la polimerizzazione dell'actina Shigella invasione siti10. Ca2 + risposte globale che sono anche suscitate da Shigella, tuttavia, sono indispensabili per il processo di invasione batterica ma innescare l'apertura del connexin adenosina alla membrana del plasma e il rilascio di ATP in extracellulare vano. ATP rilasciato agisca in modo paracrino, a sua volta, stimola Ca2 + oscillatorio responses in cellule accanto alla cellula infettata. IpgD è anche responsabile per la modellatura del global Ca2 + le risposte nelle risposte erratiche isolate con dinamica lenta. Finalmente, dopo un'infezione batterica prolungata, IpgD conduce all'inibizione di InsP3-mediata di Ca2 + segnali. Attraverso la sua interferenza con segnalazione di Ca2 + , IpgD ritarda a Ca2 +-dipendente calpaina attivazione che conduce lo smontaggio delle strutture di adesione focale e il distacco prematuro della infettato cellule13.
Mentre Ca2 + segnali sono coinvolti in aspetti critici della patogenesi, l'uso di un microorganismo solleva una serie di sfide tecniche che non vengono rilevati negli studi classici agonista. I protocolli descritti qui utilizzano il comunemente usato fluorescente Ca2 + indicatore chimico Fluo-4 che abbiamo progettato per caratterizzare il Ca2 + segnali locali durante un'infezione Shigella . Passaggi critici per la rilevazione di questi segnali sono discusse, così come le procedure attuate per la loro analisi quantitativa necessarie per caratterizzare il ruolo di effettori batterici nella segnalazione di Ca2 + .

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph versione 7.7</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolLED sistema di illuminazione pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-piatto 35 mm, alto</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di soia tripticasica (TCS)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>TCS agar</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>Congo red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>Shigella flexneri sierotipo V. che esprime l'adesina</td><td></td> AfaE</tr><tr><td>ipgD-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>ceppo mutante isogenico ipgD che esprime l'adesina</td><td></td> AfaE</tr></tbody></table>

ca2 + risposte di imaging durante l'infezione delle cellule epiteliali shigella

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

CA2 + è un ione onnipresente coinvolti in tutti i processi cellulari conosciuti. Mentre global Ca2 + le risposte possono influenzare il destino delle cellule, variazioni locali in Ca2 + citosolico le concentrazioni libere, legate per rilasciare da negozi interni o un afflusso attraverso i canali della membrana plasmatica, regolano i processi delle cellule corticali. Gli agenti patogeni che aderiscono a o invadere host cellule grilletto una riorganizzazione del citoscheletro di actina sottostante la membrana plasmatica di host, che probabilmente colpisce sia globale che locale di Ca2 + segnalazione. Perché questi eventi possono verificarsi alle basse frequenze in modo pseudo-stocastico sopra estesa cinetica, l'analisi del Ca2 + segnali indotti da agenti patogeni solleva grandi sfide tecniche che devono essere affrontate.
Qui, segnaliamo i protocolli per la rilevazione di globale e locale Ca2 + segnali su un'infezione di Shigella delle cellule epiteliali. In questi protocolli, manufatti legati ad un'esposizione prolungata e photodamage connesso con l'eccitazione di sonde Ca2 + fluorescenti sono Troubleshooting controllando rigorosamente i parametri di acquisizione su periodi di tempo definiti durante un Shigella invasione. Le procedure vengono implementate per analizzare rigorosamente l'ampiezza e la frequenza di Ca2 + segnali citosolici globali durante la cinetica di infezione estesa utilizzando la sonda chimica Fluo-4.

Invasione di Shigella è associato con atipico lunga durata Ca2 + risposte locali:
A seguito del protocollo di cui sopra, le cellule HeLa Fluo-4-caricati sono state sfidate con WT Shigella e acquisizioni di flusso sono stati effettuati per analizzare segnali di Ca2 + . Un esperimento rappresentativo è mostrato in Figura 1, con serie di time-lapse immagini dell'int...

Qui, presentiamo protocolli per visualizzare le risposte di calcio (Ca2 +) indotte dalle cellule HeLa infettate da Shigella. Ottimizzando i parametri di infezione batterica e di imaging con sonde Ca2 + fluorescenti, atipico globali e locali Ca2 + segnali indotti da batteri sopra una vasta gamma di cinetica di infezione sono caratterizzati.

Ca2 + risposte di imaging durante l'infezione delle cellule epiteliali Shigella

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

L'obiettivo generale di questa analisi al microscopio a fluorescenza con sonde chimiche è analizzare le risposte locali e globali del calcio suscitate dalle cellule ospiti durante l'infezione da Shigella patogena. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia cellulare, come la segnalazione indotta da agenti patogeni che porta alla riorganizzazione del citoscheletro o alla morte cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizzando sonde chimiche si possono seguire i segnali locali di calcio associati ai processi locali deviati dal patogeno.Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa dell'impostazione di parametri che consentono di seguire i segnali locali del calcio preservando l'integrità dei campioni biologici. Per iniziare, impiattare la Shigella wild-type che esprime l'adesione AfaE su una piastra di soia tripticasi o agar TCS contenente lo 0,01% di rosso Congo e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 18 ore. Preparare le pre-colture dalle piastre striate raccogliendo tre colonie rosse e inoculare il brodo TCS con 75 microgrammi per millilitro di ampicillina.Coltiva le colture liquide in un incubatore vibrante a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per 16 ore. Successivamente, inoculare il TCS con la pre-coltura batterica a una diluizione 1:100. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante a 200 giri/min per due ore.Assicurarsi che la densità ottica a 600 nanometri sia compresa tra 0,2 e 0,4. Centrifugare la coltura a 13.000 g e 21 gradi Celsius per due minuti e risospendere il pellet in un volume equivalente di terreno EM. Diluire la sospensione batterica in tampone EM a un OD finale di 600 di 0,1 e utilizzarla immediatamente o conservarla a 21 gradi Celsius e utilizzarla entro i successivi 60 minuti.Coltivare cellule HeLa in DMEM con un grammo per litro di glucosio integrato con il 10% di FCS e coltivare la coltura a 37 gradi Celsius con il 10% di CO2. Coltivare cellule TC7 in DMEM con 4,5 grammi per litro di glucosio, 10% di FCS e aminoacidi non essenziali e coltivare a 37 gradi Celsius e 10% di CO2. Per il mantenimento delle cellule, dividere regolarmente le cellule per evitare l'inibizione del contatto di crescita legata agli stati confluenti.Questo è fondamentale per l'elevato carico della sonda di calcio e l'efficienza di trasfezione. Tripsinizzare e contare le cellule TC7. Il giorno prima dell'esperimento con le celle HeLa, le cellule vengono piastrate su teli circolari sterili di 25 millimetri di diametro in piastre a sei pozzetti con una densità di tre volte 10 per le cinque celle per pozzetto.Quindi, per consentire la polarizzazione prima degli esperimenti, seminare le cellule da quattro volte 10 a cinque cellule per pozzetto e incubarle per cinque-sette giorni, sostituendo il terreno ogni giorno. Il giorno dell'esperimento, rimuovere il terreno e utilizzare un millilitro di terreno EM per lavare le cellule tre volte. Caricare le cellule con tre micromolari Fluo-4 AM e EM buffer e incubare le piastre a 21 gradi Celsius per 30 minuti.Con il tampone EM, lavare i campioni tre volte, quindi aggiungere un millilitro di tampone EM e incubare le cellule a 21 gradi Celsius per consentire l'idrolisi della porzione AM. Posizionare il vetrino coprioggetti contenente le cellule caricate con Fluo-4 in una camera di imaging o con fondo di vetro. Utilizzare il tampone EM per lavare il campione tre volte per rimuovere i composti potenzialmente derivanti dalla lisi cellulare.Quindi, aggiungere un millilitro di tampone EM. Posizionare la camera su un tavolino per microscopio a fluorescenza invertita riscaldato a 33 gradi Celsius. Seleziona un campo di microscopia e imposta i parametri di acquisizione, tra cui il tempo di esposizione e il binning, se necessario, per ottimizzare il segnale fluorescente Fluo-4.Per aggiungere batteri al campione, rimuovere con cura 500 microlitri di tampone EM dalla camera e aggiungere 500 microlitri di sospensione batterica per ottenere un OD finale di 600 di 0,05. Eseguire immediatamente un'acquisizione o attendere 10 minuti per consentire ai batteri di sedimentare sulle cellule. Al termine del flusso di acquisizione, acquisire un'immagine a contrasto di fase del campo selezionato per visualizzare i batteri che entrano in contatto con le cellule e le increspature della membrana associate ai siti di invasione batterica.Ripetere la procedura di acquisizione a intervalli che siano compatibili con la durata delle acquisizioni delle immagini, il salvataggio dei file e la selezione di un nuovo campo per coprire l'intero processo. Al termine della procedura di acquisizione, aggiungere al campione due micromolari dello ionoforo di calcio ioomicina per determinare l'ampiezza massima dei segnali di calcio. Acquisisci immagini ogni tre-cinque secondi fino a quando il segnale non si stabilizza, di solito per meno di 10 minuti.Seguire aggiungendo il chelante del calcio EGTA a una concentrazione finale di 10 millimolari per determinare il segnale fluorescente in assenza di calcio. Acquisire immagini ogni tre-cinque secondi fino alla stabilizzazione del segnale, di solito per meno di 10 minuti. Eseguire l'analisi delle immagini secondo il protocollo di testo.In questo esperimento, le cellule HeLa caricate con Fluo-4 sono state sfidate con Shigella wild-type e sono state eseguite acquisizioni di flussi per analizzare i segnali del calcio. Una serie di immagini time-lapse dell'intensità di fluorescenza della sonda Fluo-4 viene mediata in una regione di interesse per una singola cella e viene mostrata la corrispondente immagine a contrasto di fase. Aumenti locali atipici del calcio citosolico libero sono osservati nel sito di invasione di Shigella con un'ampiezza variabile e durate che vanno da 2,5 a 5 secondi, seguiti da aumenti globali nella cellula infetta.In questo esempio, un ceppo mutante isogenico, carente per l'effettore di tipo III IpgD, una fosfatidil-4, 5-bisfosfato fosfatasi, ha indotto risposte locali più globali e meno atipiche con lunghe durate rispetto al ceppo wild-type Shigella. Come si è visto in questo esperimento, l'imaging delle risposte globali del calcio durante la cinetica di infezione estesa mostra una diminuzione della frequenza delle risposte 30 minuti dopo la sfida con Shigella wild-type. Infine, la quantificazione delle risposte cellulari dose-dipendenti all'istamina, agonista del calcio, illustra l'inibizione del rilascio di calcio dipendente dall'inositolo trifosfato nelle fasi avanzate di un'infezione da Shigella.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire simultaneamente tutti i metodi che combinano fluidi compatibili e imaging per affrontare il ruolo dei segnali di calcio in un determinato processo. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lo smaltimento dei rifiuti, la pulizia di superfici o attrezzature contaminate.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

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Ca^{2 +} risposte di imaging durante l'infezione delle cellule epiteliali Shigella

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