Name: Preparazione di silice funzionale utilizzando un metodo bioinalati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Scopri la sintesi di silice bioinspirata con immobilizzazione enzimatica in situ. Questo metodo rapido ed ecocompatibile permette di personalizzare le proprietà dei materiali per applicazioni nei biomateriali.

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Gli autori ringraziano il sostegno finanziario dal dipartimento di chimica e ingegneria biologica (Università di Sheffield) ed EPSRC (EP/L017059/1 e 1/P006892/EP).

1. preparazione di soluzioni precursore (e incapsulante opzionale)
<ol><li>In un contenitore di plastica di 180 mL, misurano 1,5 mmol di silicato di sodio pentaidrato (318,2 mg) e sciogliere in 20 mL di acqua deionizzata.</li>
	<li>Allo stesso modo, in un secondo contenitore, misurare 0,25 mmol di Pentaetilenglicol dell'esammina (PEHA, 58,1 mg) e sciogliere in 20 mL di acqua deionizzata.<ol>
<li>Quando si utilizza alternativi contenenti composti ad es.,dietilentriammina (DETA) o triethylenetetraamine (TETA), assicurarsi che il rapporto di mole Si:N totale rimane costante a 1 (cioè, corrispondenti a 0,5 mmol di DETA o 0,375 mmol di TETA in la procedura descritta)15.</li>
		<li>Quando si utilizza additivi polimerici ammina per esempio,poly(ethyleneimine) (PEI) o poly(allylamine hydrochloride) (PAH), mantenere una concentrazione di 1 mg/mL (volume di reazione finale)15. Attenzione: Maneggiare queste ammine solo all'interno di una cappa aspirante, come sono corrosivi o tossici nelle loro forme pure (soprattutto come vapori).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per eseguire l'incapsulamento in situ durante la sintesi, sciogliere una pre-determinata massa della proteina (qui 50 mg di albumina di siero bovino, BSA) in 5 mL di acqua deionizzata. Sottrarre la quantità di acqua dal volume di acqua deionizzata per essere utilizzato per la dissoluzione del silicato di sodio pentaidrato.<ol>
<li>Per facilitare la dissoluzione della proteina senza alterare la sua struttura, una volta mescolato con acqua deionizzata, tappare il contenitore e conservare a 4 ° C. Verificare occasionalmente l'avanzamento di dissoluzione, preferibilmente senza mescolare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. silice sintesi
<ol><li>Combinare le soluzioni di silicato di sodio pentaidrato e PEHA in uno del contenitore 180 mL e aggiungere sufficiente acqua deionizzata per fare la finale soluzione volume 41 mL (o 46 se in situ incapsulamento viene omesso).</li>
	<li>Mettere la miscela preparata di silicato di sodio e soluzioni PEHA sulla cima di una piastra di agitatore, aggiunta di una barra di agitatore per fornire coerente di miscelazione.</li>
	<li>In questo vaso, sospendere una sonda di pH e registrare il pH iniziale.<ol>
<li>In questa fase, facoltativamente, rimuovere un'aliquota di 750 µ l della miscela iniziale per la successiva determinazione della concentrazione iniziale [Si] usando l'analisi spettrofotometrica di molibdeno blu, come descritto al punto 8.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inizia la sintesi aggiungendo una quantità predeterminata di 1 M HCl, come calcolato dalla Figura 1e osservare l'evoluzione immediata di torbidità (Vedi Figura 2)</li>
	<li>Appena finira ' l'aggiunta di acido, aggiungere la soluzione incapsulante (se presente) più velocemente possibile. Nota: Il volume finale dato queste quantità è 50 mL di miscela di reazione totale, conducendo a concentrazioni Si e N di 30mM. Questo può essere scalato come desiderato moltiplicando tutti sopra la quantità per una quantità costante.</li>
	<li>Registrare il pH dopo 5 min per determinare il completamento della reazione; Assicurarsi che il pH è di 7 ± 0.05.</li>
</ol>3. acido eluizione dei materiali
<ol><li>Modificare la composizione del silice prodotta dopo la reazione ha raggiunto il completamento (sia come un coagulamento come fatti o risospensione un precedente campione sintetizzato di silice) tramite l'aggiunta di ulteriore acido.</li>
	<li>Se risospendere silice, mescolare circa silice come preparato bioinalati di 150 mg con 100 mL di acqua deionizzata in un contenitore di plastica di 180 mL e posto sulla cima di una piastra di agitatore.</li>
	<li>Quando la sospensione è ben amalgamata, sospendere una sonda di pH nel vaso.</li>
	<li>Titolare in ulteriore HCl fino a pH desiderato (tra 7 e 2) è stato raggiunto e permettono di stabilizzare per ca. 1 min.</li>
	<li>Aspettare un ulteriore 5 min per assicurarsi il sistema è completamente equilibrato e poi procedere per isolare la silice solida.</li>
</ol>4. silice separazione e asciugatura
<ol><li>Decantare la sospensione di silice bioinalati in provette centrifuga da 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a 5.000 g per 15 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante dopo centrifugazione e store per ulteriori analisi (ad es., analisi di Bradford, vedi sotto). Riempire le provette per centrifuga con acqua deionizzata e risospendere la silice utilizzando un miscelatore vortex.</li>
	<li>Ripetere due volte la centrifugazione, deposito surnatante e risospensione.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione finale, rimuovere il supernatante e raschiare la silice in un crogiolo in ceramica.</li>
	<li>Secco in un forno durante la notte a 85 ° C.<ol>
<li>Se incapsulamento ha avuto luogo, è possibile utilizzare un impianto di liofilizzazione o un forno di funzionamento sotto vuoto per evitare la denaturazione proteica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. produzione di molibdeno blu reagente (MBR) per determinazione [Si]
<ol><li>In un matraccio plastica 1 L, aggiungere 8 mmol (10g) Ammonio molibdato tetraidrato in una cappa.</li>
	<li>Questo sciogliere in 500 mL di acqua deionizzata sotto agitazione.</li>
	<li>Acidificare la soluzione aggiungendo attentamente 60 mL di soluzione di HCl 10 M.</li>
	<li>Regolare il volume finale di 1 L.</li>
</ol>6. produzione di para-amminofenolo solfato riducente (RA) per la determinazione di [Si]
<ol><li>Posto un matraccio di vetro 500 mL in un bagno di acqua a temperatura ambiente su una piastra di agitatore in una cappa.</li>
	<li>Aggiungere 111 mmol (10 g) di acido ossalico anidro, 19,5 mmol (3,35 g) di para-amminofenolo solfato e 16 mmol (2 g) di sodio solfito e sciogliere in 250 mL di acqua.</li>
	<li>Lentamente e con cautela aggiungere 92g (50 mL) di acido solforico saturo continuando a mescolare e attendere che la soluzione raffreddare.</li>
	<li>Infine, diluire a 500 mL con acqua deionizzata.</li>
</ol>7. Silicomolybdic acido Assay su specie di silice monomerico
<ol><li>In un flaconcino di plastica da 5 mL, diluire 300 µ l di MBR prodotta nel passaggio 5.4 con 3 mL di acqua deionizzata.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di una soluzione di test di acido silicico e agita per mescolare. Nota: Questa soluzione lentamente diventerà di colore gialla.</li>
	<li>Dopo esattamente 15 min, aggiungere 1,6 mL del riducente preparato dalla sezione 6 per ridurre il silicomolybdate giallo complesso al suo isomero blu.</li>
	<li>Consentire un colore blu di sviluppare per almeno 2, ma non più di 24 h.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza del campione a 810 nm in uno spettrofotometro UV-vis e calcolare [Si] contro una curva di calibrazione.</li>
</ol>8. Silico dosaggio acido molibdico su specie di silice polimerici
<ol><li>Per misurare la concentrazione di specie polysilicate utilizzando il metodo di molibdeno blu, in un tubo del microcentrifuge, combinare 750 µ l di soluzione di idrossido di sodio di 2 M con sospensione di silice 750 µ l.</li>
	<li>Guarnizione e posto in un microcentrifuga galleggiante.<ol>
<li>Garantire sufficiente spazio di testa è rimasto nel tubo per evitare la rottura a causa di accumulo di pressione. Nota: Uno spazio di testa di 500 µ l è solitamente sufficiente per evitare questo. In alternativa, la procedura può essere effettuata in fiale aperte purché liquido perdita dovuta all'evaporazione viene contabilizzata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Galleggiare la microcentrifuga in un bagno di acqua riscaldato a 80 ° C e lasciare sciogliere per 1 h.</li>
	<li>Una volta trascorso 1 h, rimuovere le provette microcentrifuga e asciugare l'esterno.</li>
	<li>Una volta raffreddato, [Si] può essere determinato come descritto in precedenza come descritto ai punti 7.2-7.5.</li>
</ol>9. Bradford procedura di dosaggio per la determinazione di concentrazione nella proteina in silice
<ol><li>Inserire un importo predeterminato di reagente (temperatura ambiente) Bradford e campione in ogni provetta assegnato (Vedi tabella 1 e tabella 2 per volumi specifici). Utilizzare puntali monouso per ogni provetta per evitare le alterazioni di volume a causa della natura del reagente e ripetere ogni punto in triplice copia.</li>
	<li>Mescolare ogni provetta capovolgendo 3 volte e lasciare sviluppare per 10 min.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 595 nm utilizzando puro surnatante come vuoto.</li>
	<li>Calcolare l'assorbanza originale di ciascuna cuvetta sottraendo da ogni misura l'assorbanza trovato per il campione di controllo (provetta n. 0 in entrambe le analisi).</li>
	<li>Calcolare la concentrazione nella proteina del campione sconosciuto utilizzando una curva di calibrazione (Figura 3). In caso di diluizione del campione originale, il fattore di diluizione deve essere contabilizzata.<ol>
<li>Creare una curva di calibrazione per ogni set di esperimenti di plottaggio assorbanza misurato contro concentrazione di BSA per evitare fluttuazioni casuali che potrebbero influire sulla sensibilità del dosaggio.</li>
		<li>Anche se questa analisi della proteina è pensata per utilizzare BSA come standard per quantificare qualsiasi tipo di proteina, creare una curva di calibrazione per ogni specifica proteina di interesse per una maggiore precisione.</li>
		<li>Se il contenuto proteico del campione sconosciuto dovrebbe essere superiore alla gamma coperta della curva di taratura, diluire se necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare contenuto proteico per ciascun campione durante la risospensione per monitorare la perdita di proteine possibili.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrenti.

Nel lavoro attuale, presentiamo un metodo per la precipitazione rapidamente materiali bioinalati silice e incapsulamento di biomolecole in esso. Dimostriamo passaggi critici all'interno della routine, vale a dire la quantità di acido reazione-avviata da aggiungere e la tempistica di aggiunta di incapsulante la biomolecola. Vi mostriamo l'effetto di aggiunta di acido quantità sulla progressione di reazione e la resa (Figura 4 e Figura 5, rispettivamente) e ha dimostrato un metodo per stretto controllo sulle condizioni di sintesi, permettendo per coerenza nonostante questa sensibilità. Per quanto riguarda l'incapsulamento specie attive, anche se semplice in termini di procedura, incapsulamento è indicato per essere sensibili alle condizioni dell'esperimento (ordine di aggiunta, pH di aggiunta, condizioni ambientali), tuttavia, coerenza in materiale Proprietà è ancora realizzabile.
Le condizioni di sintesi possono essere modificate attraverso l'uso di additivi differenti, molti dei quali sono stati pubblicati altrove,15 fornendo una gamma di morfologie e porosità. Più ulteriormente, post-sintetiche tecniche per modificare e adattare chimicamente materiali bioinalati silice sono state segnalate come decorazione di ammina13 e superficie delicata purificazione. 20 infine, a causa della natura delicata, acquosa della sintesi, in situ incapsulamento è possibile per una vasta gamma di substrati che quelli hanno dimostrato qui, che vanno da enzimi17,18 a celle intere,21 sali metallici, ingredienti farmaceutici attivi22 ,23 e quantum dots. 24
A differenza di altre sintesi di silice organica-mediata (ad esempio la famiglia di materiali MCM-41 o SBA-15), la natura polifunzionale di bioinalati additivi non possono produrre ordinato strutture di poro, né altamente monodispersi distribuzioni di dimensione delle particelle caratteristica di silice Stöber-tipo. 25 questo è a causa della mancanza di micellizzazione ben definito comportamento di bioinalati additivi (di fuori di casi particolari)26 accoppiato con la loro maggiore attività catalitica monofunzionale contenenti additivi eccessivi. 26
D'altra parte, questa natura additivo polifunzionale consente di utilizzare tempi di reazione più brevi e più mite temperatura & pressione rispetto ad altre sintesi di silice organica-mediata. Questo porta anche alla possibilità di eluizione additivo temperatura come descritto sopra, che deve ancora essere raggiunto per queste altre famiglie di silice a causa della specificità della loro chimica di superficie. 27 , 28 , 29 di conseguenza, materiali bioinalati silice sono stati indicati per essere sia più economico e pratico per produrre in larga scala, che conduce allo sviluppo e alla commercializzazione di più facile. 14
In sintesi, sintesi di silice bioinalati rappresenta un metodo veloce e facile per la produzione di specie attive supporti o gas sorbente media. Attraverso il controllo stretto del pH durante e dopo la reazione, una vasta gamma di materiali compositi silice-ammina può essere sintetizzata con diverse proprietà, che viene ulteriormente completato dalla possibilità di in situ incapsulamento di una matrice di diversi organico, materiali inorganici, o bio-organici. Anche se indipendente modifiche post-sintetiche bioinalati additivo e concentrazione di incapsulante deve ancora essere raggiunto, questi metodi rappresentano un passo promettente verso processi chimici ecocompatibili.

L'uso di silice come supporto strutturale per catalizzatori industriali è ben consolidata, che permette per l'attività del catalizzatore migliorata, la stabilità e la lavorabilità,1 quindi potenzialmente riducendo il costo di gestione. Questi benefici sono aggravati in caso di immobilizzazione degli enzimi, come deposito all'interno di un sistema di poro di silice può conferire benefici significativi sulla durata degli enzimi sopra sua controparte gratuita. Di conseguenza, molto sforzo è stato consumato nel trovare il metodo migliore per fissare gli enzimi a specie di silice, con molteplici recensioni confrontando le indagini utilizzando diversi metodi di immobilizzazione su supporti solidi silicei. 2 , 3 , 4
Gli enzimi sono in genere collegati tramite physisorption o legame covalente, oltre a incapsulamento all'interno di un materiale poroso. 5 tuttavia, ci sono svantaggi significativi relazionati a ogni metodo: physisorption si basa su interazioni superficie transitorie tra la silice e biomolecole, che possono molto facilmente essere indebolita dalle condizioni di reazione che porta l'inaccettabile enzima di lisciviazione. Il molto più forte legame covalente provoca solitamente inferiore attività dovuto la libertà conformazionale ridotta della specie attiva. Incapsulamento può comportare attività ridotta a causa della inaccessibilità degli enzimi o limitazioni diffusionale. 6
Recenti sviluppi nel campo della sintesi di silice più lievi (spesso soprannominato ' ispirati') hanno stabilito l'incapsulamento in situ di biomolecole e altre specie attive durante la sintesi del materiale. 7 , 8 , 9 questo metodo nega molti degli svantaggi di immobilizzazione convenzionale - a differenza degli approcci di chemisorbimento la libertà conformazionale delle biomolecole è mantenuta mediante l'uso di interazioni non covalenti più deboli, ma come le forme di cavità poro intorno la biomolecola, lisciviazione è ancora evitata. Infatti, incapsulamento è stato dimostrato di lavorare per una gamma di biomolecole e persino intere cellule,10 e tramite l'incapsulamento in effetti di silice bioinalati come disattivazione a causa di processo difficili condizioni possono essere evitate. 7 , 11
L'obiettivo del metodo descritto nel presente documento è quello di preparare una silice porosa con proprietà controllabile, condizioni ambientali, utilizzando un additivo organico bioinalati. Il metodo può essere facilmente modificato per includere incapsulamento delle molecole di composti inorganici o Bioorganica, una selezione di cui possono figurare. Più ulteriormente indichiamo un facile metodo per modificare i materiali sintetizzati come per ottenere la proprietà desiderata e purificazione rimuovendo il modello organico mediante eluizione acida.
Rispetto alla tradizionale sintesi di silice porosa basato su modelli supporta (ad es.,silice materiali basati su modelli attraverso assemblee di tensioattivo supramolecolari come MCM-41 o SBA-15)12 che questo metodo è significativamente più veloce e più mite, consentendo su misura, in situ incapsulamento senza la necessità di numerosi passaggi di immobilizzazione e laboriosa purificazione. Inoltre, l'uso di eluizione acida anziché calcinazione apre la possibilità di funzionalizzazione superficiale organica.
Questo metodo è altamente applicabile a coloro che lavorano in immobilizzazione di specie attive che hanno trovato physisorption o immobilizzazione covalente di essere inefficace. È anche utile per chi ricerca la scalabilità di processo come la sintesi bioinalati è posizionata in modo univoco per l'industrializzazione rispetto ai materiali convenzionali basati su modelli di silice. 13 , 14 che questo metodo non è consigliato per applicazioni che richiedono una matrice ordinata di pori all'interno il materiale ad es.,per la fotonica, come la struttura del materiale è disordinata nonostante qualsiasi somiglianza nelle proprietà di massa.

<table><tbody><tr><td><forte>Sintesi di silice</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicato di sodio pentaidrato</td><td>Fisher scientific</td><td>10070470</td><td></td></tr><tr><td>Pentaetilene esame (PEHA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>292753</td><td></td></tr><tr><td>Dietilentriammina (DETA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D93856</td><td></td></tr><tr><td>Trietilenetetraammina tossica (TETA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90460</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenimmina) (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>6088</td><td>1.2K MW</td></tr><tr><td>Poli(allilammina cloridrato) (PAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>283215</td><td>17.5k MW</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl) 1M</td><td>Fisher Scientific</td><td>10487830</td><td></td></tr><tr><td>Saggio dell'acido silicomolibdico</ forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molibdato di ammonio tetraidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7302</td><td>Prodotto sostituito da M1019</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl) 37,0%wt</td><td>Fluka Analytical</td><td>84436</td><td></td></tr><tr><td>Acido ossalico anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75688</td><td></td></tr><tr><td>Para-amminofenolo solfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>10446880</td><td></td></tr><tr><td>Sodio solfito</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234400</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84727</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autotitolatore Titrando 902</td><td>Metrohm</td><td>2.902.0010</td><td></td></tr><tr><td>801 piastra di agitazione magnetica</td><td>Metrohm</td><td>2.801.0040</td><td>Per l'uso con oltre</td></tr><tr><td>800 Dosino</td><td>Metrohm</td><td>2.800.0010</td><td>Per l'uso con il sopra</td></tr><tr><td>Aquatrode Plus</td><td>Metrohm</td><td>6.0253.100</td><td>Per l'uso con il sopra</td></tr><tr><td>Centrifuge Sorvall ST16</td><td>Thermo Scientific</td><td>11814243</td><td>Il codice è per Fisher scientific</td></tr><tr><td>UV-Vis spettrofotometro Genesys 10A</td><td>Thermo scientific</td><td>12104972</td><td>Code è per Fisher scientific</td></tr></tbody></table>

preparazione di silice funzionale utilizzando un metodo bioinalati

Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method

L'obiettivo dei protocolli descritti nel presente documento è quello di sintetizzare materiali bioinalati silice, eseguire incapsulamento degli enzimi in esso e parzialmente o totalmente lo stesso purificare mediante eluizione acida. Combinando il silicato di sodio con un polifunzionale bioinalati additivo, silice sono formata rapidamente alle condizioni ambientali al momento di neutralizzazione.
L'effetto di neutralizzazione tasso e biomolecola aggiunta punto sul rendimento di silice sono studiati, e l'efficienza di immobilizzazione di biomolecole è segnalato per variare il punto di aggiunta. A differenza di altri metodi di sintesi di silice porosa, è indicato che le condizioni miti richieste per la sintesi di silice bioinalati sono pienamente compatibili con l'incapsulamento di biomolecole delicato. Inoltre, condizioni miti vengono utilizzate in tutti i passaggi di sintesi e modificazione, rendendolo bioinalati silice un bersaglio promettente per la scalabilità e la commercializzazione sia come un materiale nudo e supporto attivo.
La sintesi è indicata per essere altamente sensibile alle condizioni, cioè, il tasso di neutralizzazione e sintesi finale pH, tuttavia stretto controllo di questi parametri è dimostrato attraverso l'uso di metodi di titolazione automatica, che portano ad alta riproducibilità in percorso di progressione di reazione e rendimento.
Di conseguenza, bioinalati silice sono una scelta eccellente sostegno materiale attivo, mostrando versatilità verso molte applicazioni correnti, non limitate a quelle dimostrate qui e la potenza in future applicazioni.

Le tecniche sopra descritte sono in grado di costante e riproducibile precipitare silice. Questo è più facile da determinare mediante la rapida insorgenza di torbidità all'interno del recipiente di reazione, che al momento della cessazione di agitazione spontaneamente si depositerà in un coagulamento spesso di silice precipitata (Figura 2). Le dimensioni della reazione e quindi la resa può essere confermata misurando la massa di questo coagulo dopo la separazione ed è in genere 58 ± 6,5% (Figura 4, giallo).
Ulteriore comprensione nella progressione di reazione possa essere generati, adattando il metodo spettroscopico di molibdeno blu per rilevare la quantità di specie non reagito silicato monomerico, nonché quelle specie che hanno reagito per formare polysilicates o 'oligomeri', ma non sono riusciti a raggiungere una dimensione sufficiente per coagulare (Figura 4, rosso e blu rispettivamente).
Questi dati di speciazione di silice specifico sono di particolare interesse quando si confrontano le efficienze di titolazione differenti per la reazione di precipitazione - vale a dire come il pH finale di reazione e la velocità con cui questo viene raggiunto colpisce la polimerizzazione di silice monomerica per un 'oligomero' e sua successiva coagulazione alla silice solida. Modificando la quantità di acido aggiunto nella fase 2.4 leggermente sotto o sovra - titration della miscela di reazione può essere eseguita (Figura 5). Misurando la speciazione di silice ancora per questi due casi, una chiara differenza può essere visto il completamento della reazione (Figura 4) nonostante solo lievi modifiche al profilo di titolazione della reazione (Figura 5).
Anche se nessuna differenza è presente tra il consumo di monomerico specie per i casi di tre reazione (restanti tra 29-33%), c'è una netta differenza nella quantità di specie oligomeriche silice che precipitano in ogni caso. Questo è in accordo con la teoria tradizionale il sol-gel silici - nel caso di 'undershoot' il pH è tenuto più alto per più a lungo, consentendo per singole particelle a crescere e quindi aiutando coagulazione efficiente; nel caso di 'superamento' la coagulazione è indotto molto più velocemente a causa della titolazione rapida, quindi un minor numero di specie di silice sono cresciuti a una dimensione sufficiente per coagulare e rimangono intrappolati nella fase di colloide. 16
Data l'importanza della titolazione su formazione di silice, un priori conoscenza del volume titolazione appropriata è essenziale. Anche se non estraibile dalla stechiometria di reazione a causa del comportamento complesso protonazione degli additivi di ammina e cambiamento in silice acidità superficiale sulla coagulazione, altamente affidabili relazioni empiriche tra contenuto del sistema, concentrazioni e titolo i volumi sono prontamente generati (Figura 1).
Al termine della coagulazione, le superfici del materiale possono essere facilmente modificate attraverso l'uso di eluizione acida, come recentemente è stata segnalata dagli autori altrove. 13 in questo modo per ottimizzare le proprietà del materiale come composizione, porosità e attività chimica dell'additivo (Figura 6a e b).
In questo studio, BSA è stato usato come un enzima di incapsulante exemplar, tuttavia, le tecniche qui descritte possono essere utilizzate per più enzimi17,18. La procedura seguita per la rilevazione di proteine è il protocollo di analisi di Bradford,19 utilizzo i surnatanti memorizzati da ogni ciclo di centrifugazione. La quantità di proteine nel surnatante viene calcolata utilizzando una curva di calibrazione creata da quantità note di BSA dissolto nel surnatante di un campione con zero contenuto proteico (campione di controllo). La quantità di proteina incapsulata in silice verrà calcolata per sottrazione della proteina rilevata in surnatanti dalla quantità iniziale di proteina aggiunta. L'unico reagente necessario per il dosaggio è il reagente di Bradford (acquistati o fatti secondo le ricette standard).
Ci sono tre tipi di formato di dosaggio, a seconda del volume di campione, la quantità prevista di proteina per essere rilevato e il metodo di misurazione utilizzato. Nel presente documento, il formato di seguito è specificato per uno spettrofotometro, richiede cuvette monouso di macro e di dimensioni micro e può rilevare da 10 µ g/mL a 1,4 mg/mL di proteina.
Nella Figura 7 la quantità di proteine rilevata dopo ogni lavaggio (punto 4.3) è mostrata come un % dell'importo iniziale della proteina (che era 50 mg). Circa ~ 50% di BSA è stato rilevato nel surnatante dopo la centrifugazione prima, che riguarda l'efficienza ~ 50% immobilizzazione. Come non c'era che nessun BSA rilevato nei seguenti lavaggi, che BSA (o qualsiasi altro enzima) poteva essere incapsulato in modo sicuro durante la sintesi di silice con nessun lisciviazione - questo è un notevole vantaggio di questo metodo. Al fine di confermare la presenza di BSA in silice prodotta, analisi di Fourier Transform Infrared spettroscopia (FTIR) è stata eseguita. La presenza dei caratteristici gruppi di ammide I e II nella zona di 1.500/cm e 1650/cm (Figura 8) nei campioni preparati in presenza di BSA, ma non nel controllo campioni (nessun BSA) ha confermato la presenza di BSA nei solidi.
Oltre al metodo di addizione di enzima descritto sopra (BSA aggiunto durante la neutralizzazione della miscela di reazione), ci sono altre possibili variazioni ad es.,BSA aggiunta durante la miscelazione del silicato e le soluzioni additiva, prima della neutralizzazione o aggiunto alla soluzione di silicato o additivo prima della loro miscelazione e neutralizzazione degli enzimi. Alcune di queste possibilità sono stati esplorati ulteriormente e le efficienze di immobilizzazione (massa di BSA immobilizzato come una percentuale dell'enzima aggiunto per il sistema di reazione, calcolato in base l'analisi di Bradford) e la quantità di BSA nella finale di silice sono stati misurati ( concentrazione di BSA in silice come percentuale del peso totale composito prodotto, vedere la Figura 9). Era chiaro che quando BSA è stato aggiunto ai reagenti non reagiti (casi A-C in Figura 9) non c'erano differenze notevoli in efficienza l'immobilizzazione o la quantità di BSA nel composito risultante. Tuttavia, quando BSA viene aggiunto durante la formazione del silice (caso D in Figura 9), efficienza di immobilizzazione e la quantità di BSA nel prodotto finale erano entrambi significativamente più basso. Nonostante queste differenze, la quantità media di silice prodotta è rimasta invariata (tra 85-90 mg). Queste osservazioni possono essere spiegate in base alla ionizzazione (o punto isoelettrico) di BSA, silicato/silice e l'additivo. I diversi metodi di aggiunta consentono diverse interazioni tra i precursori degli enzimi e silice. Come il pH al momento dell'aggiunta dei cambiamenti degli enzimi, l'ionizzazione di ciascuna specie determinerà le interazioni intermolecolari, che a sua volta controllerà l'efficienza di immobilizzazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cuvetta No</td>
			<td>Concentrazione di BSA (mg/mL)</td>
			<td>Reattivo di Bradford (mL)</td>
			<td>Campione (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>0 (controllo)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>0.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>0,5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0,75</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Campione sconosciuto (X)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: impostazione dell'analisi di Bradford Macro e volumi calcolati componente. Valido per determinazione fascia 0.1-1.4mg/mL (volumi per 1 replicare)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cuvetta No</td>
			<td>Concentrazione di BSA (ug/mL)</td>
			<td>Reattivo di Bradford (mL)</td>
			<td>Campione (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>0 (controllo)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>7.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Campione sconosciuto (X)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: impostazione dell'analisi di Bradford Micro e volumi calcolati componente. Valido per determinazione gamma 1-10 µ g/mL (volumi per 1 replicare)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig1.jpg"> Figura 1 : Volume di titolo contro concentrazione di silice per sistemi di reazione utilizzando DETA o PEHA come additivo richiesto. Silice è stata sintetizzata a concentrazioni variabili pur mantenendo un [N]: rapporto [Si] di 1, per due diverse sostanze chimiche additivi. Barre di errore sono una deviazione standard intorno alla media. 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig2.jpg"> Figura 2 : Fotografie del coagulo di silice nel recipiente di reazione (a) durante e (b) dopo agitazione, dimostrando la torbidità della soluzione e sedimentazione che sono indicativi di una reazione ottima.  
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig3.jpg"> Figura 3 : Curva di calibrazione esemplare per analisi di Bradford macro. Surnatante da bioinalati sintesi di silice in assenza di BSA è mescolato con una quantità nota della proteina, dopo i quali analisi di Bradford sono eseguito come descritto al punto 9.1.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig4.jpg"> Figura 4 : Stati di polimerizzazione finale di silice specie per le condizioni di reazione diversa. Silice sono sintetizzata utilizzando condizioni ottimali (linea di base), nonché come con sovra - o sotto-titolazione, dopo il quale concentrazione di silice relativa è quantificato per monomerica o dimerica silicati (rosso), polysilicate 'oligomeri' (blu) e di coagulazione instabile silice (giallo).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig5.jpg"> Figura 5 : Progressione del pH attraverso il sistema di reazione in funzione del volume iniziale titolo. L'acido viene dosato immediatamente dopo ca. 38s di miscelazione, causando il pH a scendere rapidamente di sotto 8. In seguito, ulteriori quantitativi di acido sono dosati automaticamente tale che il pH era 7,0 ± 0,05 300s dopo aggiunta iniziale. In caso di sovra-titolazione, questo non era realizzabile, poichè la dose iniziale era sufficiente per far cadere il pH inferiore a 7, raggiungendo pH 6,65 dopo 300s. Volume iniziale di HCl aggiunto per 'undershoot,' 'baseline', e 'superamento' era 6,90, 7,05 e 7,20 mL rispettivamente.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig6.jpg"> Figura 6 : Le modifiche delle proprietà rappresentante all'acidificazione del materiale coagulato silice. (a) cambiamento di concentrazione additivo rispetto al pH e (b) cambiamento della porosità di silice rispetto al pH. Riprodotto da Manning et al. 13 sotto licenza Creative Commons. 
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig7.jpg"> Figura 7 : Concentrazione di BSA in surnatanti di sintesi silice bioinalati. Analisi di Bradford sono state effettuate sul surnatanti di reazione dopo la centrifugazione, da cui il restante ammontare relativo (quindi occluso dalla silice sintetizzata) è stato determinato.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig8.jpg"> Figura 8 : Analisi FTIR su silice bioinalati con e senza incapsulamento specie attive. Gli spettri hanno mostrati: linea nera: linea di silice, grigio bioinalati: puro BSA, linea blu: bioinalati silice caricati con BSA. Linee tratteggiate verticali indicano bande caratteristico dell'ammide. 
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig9.jpg"> Figura 9 : Efficienza di immobilizzazione e la quantità di BSA in composito per la silice prodotta utilizzando PEHA. BSA è stato aggiunto (A) nella soluzione PEHA prima della miscelazione con silicato, (B) nella soluzione di silicato prima della miscelazione con PEHA, (C) dopo la miscelazione iniziale di soluzioni PEHA e silicato e (D) dopo la miscelazione PEHA e silicato soluzioni e neutralizzazione. L'efficienza è misurata come % BSA incapsulato dalla miscela di reazione in proporzione al totale BSA aggiunto, mentre BSA in silice significa concentrazione % di BSA in composito di silice finale di massa. Barre di errore sono una deviazione standard intorno alla media.

Qui, presentiamo un protocollo per sintetizzare materiali bioinalati silice e immobilizzare gli enzimi in esso. Silice sono sintetizzata dalla combinazione di silicato di sodio e un'ammina "additiva", che neutralizzano a velocità controllata. Funzione e proprietà dei materiali possono essere alterate in situ immobilizzazione degli enzimi o post-sintetiche eluizione acida di additivi incapsulati.

Preparazione di silice funzionale utilizzando un metodo bioinalati

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally ...

I principali vantaggi di questo metodo sono che è veloce, facile, ecologico e consente la personalizzazione dei materiali. Questo metodo può fornire informazioni su come si forma la silice bioispirata, sui modi disponibili di incorporazione delle biomolecole e sul trattamento post-sintetico dei materiali. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la formazione di silice è rapida e una quantità specifica di acido deve essere aggiunta rapidamente per ottenere i risultati ottimali.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ci siamo resi conto di quanto fosse lieve, in modo tale che le condizioni fossero compatibili con gli enzimi. Abbiamo pensato di utilizzare questo metodo per migliorare le prestazioni e la stabilità degli enzimi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fase di neutralizzazione degli acidi è la più importante per le proprietà finali del materiale.Per prima cosa, pesare 318,2 milligrammi di silicato di sodio pentaidrato in un contenitore di plastica da 180 millilitri e sciogliere in 20 millilitri di acqua deionizzata. In un secondo contenitore, pesare 58,1 milligrammi di pentaetilene esame o PEHA e sciogliere in 20 millilitri di acqua deionizzata. Sottrarre questa quantità di acqua dal volume di acqua deionizzata da utilizzare per la dissoluzione del silicato di sodio pentaidrato.Per eseguire l'incapsulamento in situ durante la sintesi, sciogliere una massa predeterminata di proteine in cinque millilitri di acqua deionizzata e porre la soluzione in frigorifero per la dissoluzione totale. Controllare di tanto in tanto l'andamento della dissoluzione, preferibilmente senza mescolare. Unire le soluzioni di silicato di sodio pentaidrato e PEHA in uno dei contenitori e aggiungere acqua deionizzata sufficiente a rendere il volume della soluzione finale di 41,5 millilitri.Posizionare il composto appena preparato sopra una piastra di mescolamento e aggiungere una barra di mescolamento per fornire una miscelazione uniforme. Quindi, sospendere una sonda di pH nella soluzione di agitazione e registrare il pH iniziale. Iniziare la sintesi aggiungendo una quantità predeterminata di acido cloridrico monomolare e osservare l'evoluzione immediata della torbidità.Il primo passo critico è la rapida aggiunta di acido per avviare la formazione di silice. Il pH deve essere abbassato a sette il più velocemente possibile. Se è in corso l'incapsulamento, aggiungere la soluzione incapsulante non appena l'aggiunta di acido è completa.Quindi registrare il pH dopo cinque minuti per determinare il completamento della reazione. Dopo che la reazione ha raggiunto il completamento, modificare la composizione della silice prodotta aggiungendo altro acido cloridrico alla miscela fino a raggiungere il pH desiderato tra due e sette e lasciare stabilizzare la sospensione per circa un minuto. Successivamente, travasare la sospensione di silice bioispirata in provette da centrifuga da 50 millilitri, quindi centrifugare la sospensione a 5.000 g per 15 minuti.Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e conservarlo per ulteriori analisi. Riempire le provette da centrifuga con acqua deionizzata e risospendere la silice utilizzando un miscelatore a vortice. Nel caso dell'incorporazione di biomolecole, un passaggio critico consiste nel fornire i surnatanti provenienti dal lavaggio con silice bioispirata per essere ulteriormente analizzati.Dopo aver ripetuto due volte le fasi di centrifugazione e risospensione, rimuovere il surnatante e raschiare la silice in crogioli di ceramica. Asciugare la silice in forno per una notte a 85 gradi Celsius. In una fiala di plastica da cinque millilitri, diluire 300 microlitri di reagente blu di molibdeno precedentemente preparato con tre millilitri di acqua deionizzata.Quindi, aggiungere 10 microlitri di soluzione per il test dell'acido salicico e agitare per mescolare. Dopo 15 minuti, aggiungere 1,6 millilitri di agente riducente del para-amminofenolo solfato precedentemente preparato per ridurre il complesso giallo del silicomolibdato al suo isomero blu. Successivamente, misurare l'assorbanza del campione a 810 nanometri in uno spettrofotometro UV-vis e calcolare la concentrazione di silicio rispetto a una curva di calibrazione.Utilizzando i puntali per pipette monouso, aggiungere una quantità predeterminata di reagente Bradford e campione in ciascuna cuvetta assegnata. Mescolare ogni cuvetta capovolgendola tre volte e lasciare sviluppare per 10 minuti. Successivamente, misurare l'assorbanza a 595 nanometri utilizzando il surnatante puro come bianco.Calcolare l'assorbanza originale di ciascuna cuvetta sottraendo l'assorbanza del campione di controllo da ogni misurazione. A questo punto, è possibile creare una curva di calibrazione per ogni serie di esperimenti tracciando l'assorbanza misurata rispetto alla concentrazione di BSA per evitare fluttuazioni casuali che potrebbero influire sulla sensibilità del test. Infine, determinare il contenuto proteico per ciascun campione durante la risospensione per monitorare la possibile perdita di proteine.La resa della reazione di formazione della silice è tipicamente del 58 più o meno il 6,5%Il metodo spettroscopico del blu di molibdeno ha rilevato la quantità di specie di silicati monomerici non reagiti, nonché quelle specie che hanno reagito per formare polisilicati o oligomeri ma non sono riuscite a raggiungere dimensioni sufficienti per coagulare. Una volta completata la coagulazione, le superfici dei materiali possono essere facilmente modificate attraverso l'uso dell'eluizione acida che consente la messa a punto delle proprietà del materiale come la composizione, la porosità e l'attività chimica dell'additivo. Circa il 50% di BSA è stato rilevato nel surnatante dopo la prima centrifugazione, il che si riferisce al 50% di efficienza di immobilizzazione.Poiché non è stata rilevata BSA nei lavaggi successivi, la BSA è stata incapsulata in modo sicuro durante la sintesi senza lisciviazione. Lo spettro FTIR della silice ha mostrato bande ammidiche caratteristiche nei campioni con BSA ma non nei campioni di controllo. Quando la BSA è stata aggiunta ai reagenti non reagiti, non ci sono state differenze considerevoli nell'efficienza di immobilizzazione o nella quantità di BSA nel composito risultante.Quando il BSA è stato aggiunto durante la formazione della silice, l'efficienza di immobilizzazione e la quantità di BSA nel prodotto erano significativamente inferiori. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di cinque minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere precisi con i pesi e i volumi dei reagenti e di aggiungere rapidamente l'acido in una sola dose.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come FTIR, SCM, porosimetria e saggi enzimatici per rispondere a ulteriori domande sulle proprietà e la morfologia del materiale, nonché sull'attività delle biomolecole. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della formazione di silice bioispirata per esplorare un metodo veloce, facile, controllabile e rispettoso dell'ambiente per sintetizzare la silice con la capacità di incapsulare in situ le biomolecole. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare la silice utilizzando un metodo bioispirato, incapsulare le biomolecole in situ, misurare l'efficienza dell'incapsulamento ed eseguire l'eluizione post-sintetica degli additivi.Non dimenticare che lavorare con ammine, acidi, biomolecole può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come DPI e prevenzione delle fuoriuscite.

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Sintesi e caratterizzazione di supramolecolari colloidi

Qui segnaliamo la sintesi e la caratterizzazione di carbonio nanoporosi ordinato (con un diametro dei pori nm 4,6) e SBA-15 (con un diametro dei pori nm 5,3). L'opera descrive la superficie e proprietà tessiturali dei setacci molecolari nanoporosi, loro bagnabilità ed il comportamento in fusione di D2O confinato nei materiali.

Proprietà della superficie di sintetizzato nanoporosi carbonio e matrici di silice

Un nuovo catalizzatore metallico di gruppo IV per la metatesi dell'imina viene preparato innestando complesso metallico di ammina sulla silice dedrosilata. I frammenti metallici di superficie sono caratterizzati da FT-IR, microanalisi elementari e spettroscopia NMR allo stato solido. Ulteriori esperimenti di spettroscopia NMR potenziati con una superficie di polarizzazione nucleare dinamica completano la determinazione della sfera di coordinamento.

Metatesi imine da silice-supported Catalysts Utilizzando la metodologia della chimica dell'organimetallico di superficie

Questo lavoro ha lo scopo di facilitare lo sviluppo di tecniche standardizzate per l'impregnazione o l'innesto di composti aminati su substrati di silice, che sono spesso ampiamente descritte in letteratura. Verranno discusse in dettaglio le quantità specifiche di solvente, substrato, ammine e i valori di altri importanti parametri sperimentali.

Una metodologia sintetica per la preparazione di compositi di silice a base di ammine impregnati e innestati per la cattura del carbonio

Qui, presentiamo un protocollo con un processo sol-gel per sintetizzare l'oro intercalato nelle pareti dei materiali mesoporosi (GMS), che è confermato possedere una matrice mesoporosa con l'oro intercalato nelle pareti che conferisce grande stabilità e riciclabilità.

Sintesi e prestazioni catalitica dell&#39;oro intercalata nelle Mura di mesoporosi silice

Monitoraggio in tempo reale consente la rapida ottimizzazione delle reazioni eseguite utilizzando l'elaborazione a flusso continuo. Qui la preparazione di 3-acetylcoumarin viene utilizzato come esempio. L'apparecchiatura per l'esecuzione in-situ monitoraggio Raman è descritto, come lo sono i passaggi necessari per ottimizzare la reazione.

Monitoraggio in tempo reale delle reazioni eseguita utilizzando la lavorazione a flusso continuo: La preparazione di 3-Acetylcoumarin come un esempio

Viene mostrato un nuovo modo per la produzione di aerogel a base di biopolimeri mediante gelificazione indotta da anidride carbonica (CO2). La tecnica utilizza anidride carbonica pressurizzata (5 MPa) per la produzione di idrogel biopolimerici e CO2 supercritica (12 MPa) per convertire i gel in aerogel. Gli unici solventi necessari oltre alla CO2 sono l'acqua e l'etanolo.

Preparazione del biopolimero Aerogels che utilizzano solventi verdi

Scopri la sintesi di silice bioinspirata con immobilizzazione enzimatica in situ. Questo metodo rapido ed ecocompatibile permette di personalizzare le proprietà dei materiali per applicazioni nei biomateriali.

Preparazione di silice funzionale utilizzando un metodo bioinalati

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