Name: Cryo-sezioni della retina, intero-monta e ipotonico Vasculature isolato preparazioni per la visualizzazione di Immunohistochemical dei Pericytes microvascolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Impara tre tecniche di preparazione tissutale per la visualizzazione immunohistochimica dei periciti microvascolari retinici nel ratto: criosezioni, intero-monta e isolamento ipotonico. Questi metodi sono essenziali per studiare la proliferazione e la migrazione dei periciti in oftalmologia.

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La ricerca è stata finanziata dalla Fondazione Lundbeck, Danimarca.

Il protocollo è stato ottimizzato e dimostrato su ratti adulti maschii dell'albino. In tutte le procedure sperimentali, gli animali sono stati trattati secondo la normativa l'ARVO istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research. Gli animali sono stati eutanasizzati di biossido di carbonio e successiva dislocazione cervicale.
1. ratto tessuto retinico preparazioni
<ol><li>
Cryo-sezione
	<ol>
<li>Rendere ~0.5 anteriori e posteriori fessure cm nella palpebra del ratto con un bisturi.<ol>
<li>Opzionale: Utilizza un bruciatore di diatermia, contrassegnare l'occhio l'angolo interno per orientare l'occhio in modo uniforme durante l'incorporamento e consentire per il sezionamento di criostato verticale tramite il nervo ottico.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Afferrare l'occhio con il forcipe e inclinare con attenzione al lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con le forbici di dissezione nel tessuto muscolare e connettivo. Attenzione: Non tirare troppo l'occhio come eccessiva pressione sul nervo ottico può causare il distacco della retina.</li>
		<li>Mettere l'occhio brevemente in formaldeide 4% in tampone fosfato salino (PBS) per stabilizzare prima di effettuare un foro iniziale al limbus corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi.</li>
		<li>Sotto un microscopio, tagliato lungo il limbus cornea con le forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con il forcipe prima dell'immersione in formaldeide 4% in PBS per 2 – 4 h.</li>
		<li>Sciacquare in modo sequenziale in tampone fosfato di Sörensen con saccarosio di 10% e 25% di saccarosio.</li>
		<li>Incorporare nel mezzo di Yazulla preparato con 3% di gelatina da porcino pelle e 30% albumina da bianco d'uovo di pollo. Nota: Il protocollo può essere sospesa qui con deposito di tessuto a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intero-monta
	<ol>
<li>Rendere ~0.5 posteriori ed anteriori cm fessure nella palpebra del ratto con un bisturi.</li>
		<li>Afferrare l'occhio con il forcipe e inclinare con attenzione al lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con le forbici di dissezione nel tessuto muscolare e connettivo. Attenzione: Non tirare troppo l'occhio come eccessiva pressione sul nervo ottico può causare il distacco della retina.</li>
		<li>Mettere l'occhio brevemente in formaldeide 4% in PBS per stabilizzare prima di effettuare un foro iniziale al limbus corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi.</li>
		<li>Sotto un microscopio, tagliare lungo il limbus cornea con le forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con il forcipe.</li>
		<li>Separare la retina dall'epitelio retinico del pigmento verso il nervo ottico con il forcipe con movimenti di piccola apertura per evitare di strappare principali.</li>
		<li>Gratis la retina al nervo ottico con forbici di dissezione e fare quattro fessure di pochi millimetri lunghezza dalla periferia retinica verso la testa del nervo ottico.</li>
		<li>Diffondere la retina su un vetrino e lasciare asciugare per 5 – 10 min.</li>
		<li>Difficoltà in formaldeide 4% per 20-30 min di sgocciolatura formaldeide sulla retina. Attenzione: Non applicare direttamente sulla retina, come può staccare dal vetro.</li>
		<li>Risciacquare con PBS. Per ottenere risultati ottimali, immuno-macchia direttamente dopo il risciacquo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento ipotonica
	<ol>
<li>Rendere ~0.5 posteriori ed anteriori cm fessure nella palpebra del ratto con un bisturi.</li>
		<li>Afferrare l'occhio con il forcipe e inclinare con attenzione al lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con le forbici di dissezione nel tessuto muscolare e connettivo. Attenzione: Non tirare troppo l'occhio come eccessiva pressione sul nervo ottico può causare il distacco della retina.</li>
		<li>Fare un foro iniziale al limbus corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi.</li>
		<li>Sotto un microscopio, tagliare lungo il limbus cornea con le forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con il forcipe.</li>
		<li>Separare la retina dall'epitelio retinico del pigmento verso la testa del nervo ottico con il forcipe con movimenti di piccola apertura per evitare di strappare principali.</li>
		<li>Gratis la retina al nervo ottico con forbici di dissezione, collocare la retina in 1 mL di acqua deionizzata in una piastra a 24 pozzetti e agitare a 200 giri/min con un'orbita di vibrazione di 1,5 mm per 1 h a temperatura ambiente. Nota: Qui di seguito, verrà visualizzato la retina che meno definiti ai bordi.</li>
		<li>Aggiungere 200 U dnasi 1 per dissociare i detriti di lisato cellulare dal sistema vascolare retinico e agitare per un altro 30 min a temperatura ambiente. Nota: Detriti potrebbero iniziare a forma nei pozzetti.</li>
		<li>Sciacquare almeno 3 volte in acqua deionizzata per 5 minuti con agitazione a 150 – 300 giri/min per rimuovere i detriti di un neurone delle cellule. La retina dovrebbe diventare più trasparente con ogni risciacquo indicativo della rimozione di detriti cellulari neuronali.<ol>
<li>Utilizzare uno sfondo scuro per esaminare la piastra 24 pozzetti di vedere chiaramente il vasculature retinico isolato diafano.</li>
			<li>(Facoltativo): se il sistema vascolare non è gratis di un neurone strati (semi-trasparente) a questo punto o aggiungere ulteriori passaggi di risciacquo, aumentare la velocità di agitazione o utilizzare una pipetta per aspirare il liquido sul sistema vascolare. Attenzione: I passaggi facoltativi possono danneggiare il sistema vascolare.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Difficoltà 10 min in 1 mL di paraformaldeide al 4% in PBS a temperatura ambiente e risciacquo 3 volte in PBS. Nota: Il protocollo può essere sospesa qui con deposito di tessuto a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. esame immuno-istochimico
<ol><li>
Macchiatura di cryo-sezioni
	<ol>
<li>Tagliare 10 µm cryo-sezioni della retina gelatina-incastonati come sezionamento verticale tramite il nervo ottico e la cryo-sezioni su un vetrino e lasciare asciugare (minimo 1 h).</li>
		<li>Immergere il vetrino in PBS con 0,25% Triton X-100 (PBS-T) per 15 min.</li>
		<li>1: 100 PDGFRβ e gli anticorpi primari di 1: 500 NG2, diluiti in PBS-T + 1% BSA sulla cryo-sezione a goccia e incubare in camere di incubazione a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Immergere il vetrino 2 volte in PBS-T per 15 min e 1: 100 anticorpi anti-topo Alexa Fluor 594-linked e 1: 100 anti-coniglio FITC-collegato secondari diluiti in PBS-T con 3% BSA su cryo-sezioni a goccia.</li>
		<li>Incubare il vetrino 1 h a temperatura ambiente al buio.</li>
		<li>Sciacquare il vetrino in PBS-T 2 x 15 min. Nota: Facoltativo: per la macchiatura immunofluorescente doppie e triple, macchiatura sequenziale può essere eseguita ripetendo la procedura dal 2.1.3 a 2.1.6 due e tre volte, rispettivamente.</li>
		<li>Montare il cryo-sezioni macchiate con anti-affievolimento montaggio medio contenente DAPI e un vetrino coprioggetti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Macchiatura del intero-supporto
	<ol>
<li>Coli di PBS-T sull'intero-monta e incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Versare fuori e gocciolamento 1: 100 PDGFRβ e gli anticorpi primari di 1: 500 NG2, diluiti in PBS-T + BSA 1% e incubare in camera umida a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Versare fuori e gocciolare su PBS-T a sciacquare il vetrino in 2 x 15 min.</li>
		<li>Versare fuori e gocciolare su 1: 100 anti-coniglio Cy2 - e 1: 100 anti-Cy3-collegato secondario anticorpo diluito in PBS-T con 3% BSA per Incubare 1h in una camera umida a temperatura ambiente al buio.</li>
		<li>Versare fuori e gocciolare su PBS-T a sciacquare in 2 x 15 min al buio. Nota: Facoltativo: per la macchiatura immunofluorescente doppie e triple, macchiatura sequenziale può essere eseguita ripetendo la procedura da 2.2.2 a 2.2.5 due e tre volte, rispettivamente.</li>
		<li>Montare l'intero-monta macchiato con anti-affievolimento montaggio medio contenente DAPI e un vetrino coprioggetti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Macchiatura del vasculature isolato ipotonica
	<ol>
<li>Bloccare il vasculature isolato ipotonico 1h con agitazione a 100 rpm e temperatura con 500 µ l/pozzetto di 10% di siero di asino diluito in PBS.</li>
		<li>Incubare per una notte a temperatura ambiente e agitare a 100 rpm con 600 µ l/pozzetto di 1: 100 PDGFRβ e 1: 500 NG2 anticorpi primari diluiti in siero di 10% asino in PBS.</li>
		<li>Risciacquo retinico 3x in PBS per 5 min di rete ed incubare 1: 100 anticorpi anti-topo Alexa Fluor 594-linked e 1: 100 anti-coniglio FITC-collegato secondari diluiti con 10% siero di asino in PBS agitazione a 100 rpm e temperatura ambiente per 1 h al buio.</li>
		<li>Risciacquare in PBS-T per 5 min e incubare a 0,2 ng/mL DAPI in PBS-T seguita da risciacqui 3 x 5 min in PBS-T al buio per 15 min.</li>
		<li>Tagliare la punta di una pipetta di Pasteur plastica, inumidirlo con PBS-T e utilizzarlo per trasferire la rete retinica a una diapositiva di alloggiamento vetro 4 pozzetti. Nota: Il passaggio d'inumidimento è importante evitare il vasculature retinico che attacca all'interno della pipetta Pasteur.</li>
		<li>Aprire completamente il sistema vascolare retinico. Evitare di toccare il vasculature retinico con il forcipe come questo può causare il sistema vascolare a groviglio. Nota: Svolgimento può essere fatto inclinando il vetrino camera avanti e indietro o aspirando le gocce di liquido sul sistema vascolare retinico.</li>
		<li>Rimuovere il supporto dai pozzi. La tensione superficiale del liquido si appiattiscono il vasculature sulla parte inferiore della diapositiva.</li>
		<li>Garantire il corretto dispiegarsi sotto un microscopio prima di rimuovere la plastica pozzi dalla diapositiva camera.</li>
		<li>Montare il vasculature macchiato con mezzo di montaggio anti-sbiadimento e un vetrino coprioggetti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Presentiamo tre tecniche di preparazione della retina che possono essere applicate nello studio dei periciti microvascolari. Qui di seguito, forniamo un confronto tra ciascuno dei metodi ed evidenziare passi critici nei protocolli.
Con cryo-sezionamento, la retina è tagliata in sezioni sagittali e quindi, è possibile ottenere numerosi esemplari dalla retina stessa. Le sezioni numerale derivanti da questo metodo lo rendono la scelta ideale per la specificità dell'anticorpo e titolazione test qu...

Periciti sono al centro di molti laboratori di ricerca come queste cellule svolgono un ruolo importante nell'integrità del sistema vascolare. Condizioni patologiche quali retinopatia diabetica1, ischemia2e glaucoma3 hanno caratteristiche vascolari che coinvolgono la funzione di periciti. I periciti sono trovati in plessi capillari retinici interni. Arteria retinica centrale che fornisce i rami retina interna in due strati dei plexuses capillari. Il letto vascolare interno è situato tra la cellula del ganglio e strati interni di nucleare. Lo strato più profondo è più denso e complesso ed è localizzato tra lo strato nucleare interno ed esterno4,5. Inoltre, alcune parti della retina contengono anche una terza rete definita i capillari parapapillary radiale. Questi sono lunghi, dritti capillari che si trovano tra le fibre nervose e raramente anastomotizzare con un l'altro o gli altri due plessi6. All'interno della parete capillare, i periciti sono incorporati nella membrana dello scantinato e linea lato abluminale delle cellule endoteliali vascolari.
A questa data, esiste un marker biologico unico di questi periciti che possibile distinguerle da altre cellule vascolari. Β del ricevitore di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ) e l'antigene del nervo/glial 2 (NG2) sono comunemente utilizzati marcatori che entrambi presentano il pericytes ma anche altre cellule vascolari. Identificazione dei pericytes è ulteriormente complicata dall'esistenza di sottoinsiemi di periciti che variano nell' espressione della proteina e morfologia7. Attualmente, la migliore identificazione si basa su una combinazione di proteine marker e il posizionamento caratteristico del Pericita nella parete vascolare. Dimostriamo qui tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la macchiatura di immunohistochemical PDGFRβ/NG2 di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.
Con cryo-sezioni, la retina e la sclera sono tagliate attraverso il nervo ottico. Ciò consente la visualizzazione di tutte le strutture a strati di neuroni. I dieci strati distinti della retina sono evidenti come lo scambio di strutture nucleari e assonale/dendritiche che possono essere visualizzate con macchie quali ematossilina/eosina o fluorescente nucleare 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. I requisiti metabolici differiscono tra i livelli9 e si fornisce un metodo per determinare lo spessore o la totale assenza di un livello specifico (ad esempio, la perdita delle cellule ganglionari retiniche è uno dei tratti distintivi di ischemia retinica10, 11). Il sistema vascolare è evidente come attraverso la retina, rendendo possibile studiare separatamente i plexuses capillari all'interno i rispettivi strati retinici12,13tagli trasversali.
Più tradizionalmente, le indagini della rete sistema vascolare retinico sono effettuate in intero-monta retinica. Con questa preparazione del tessuto, la retina è tagliata e appiattita come una struttura a forma di fiore. Il metodo è una tecnica di preparazione del tessuto relativamente veloce che permette di evidenziare il vasculature retinico di architettura globale e pertanto è spesso applicato nell'inchiesta della neovascolarizzazione della retina murino. Visualizzazione successo del microvasculature in retine montato tutto è segnalato anche nel sviluppo neonatale topo e nel ratto retina14,15,16,17,18, 19. questi studi rivelano una più definita attività pericitica con grandi aree senza capillare nell'adulto rispetto al retina neonatale14.
Un altro modo di visualizzare è il microcircolo retinico dopo isolamento ipotonica. Questa tecnica di preparazione del tessuto si traduce in vasi sanguigni retinici e capillari viene liberati delle cellule neuronali. Questo tipo di rappresentazione bidimensionale della rete vascolare retinica isolata è solitamente eseguito dopo retinica tripsina digestione20 e utilizzato per valutare le anomalie vascolari della retinopatia diabetica, compreso perdita di periciti e capillare degenerazione20,21,22. Il metodo di isolamento ipotonico offre le indagini del gene vascolare retinica e risposte normative proteina come è stato fatto con RT-PCR e western blotting23,24,25. Forniamo qui un protocollo per la macchiatura di immunohistochemical di flottante del vasculature retinico isolato ipotonico come alternativa alla digestione della tripsina per esaminare i pericytes microvascolari.

<table><tbody><tr><td>Geletina da pelle suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da albume d'uovo di gallina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5253-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desossiribonucleasi (DNAsi) I da pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>Disciolta in 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121, lotto 129348</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-PDGFR&beta;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-432</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Topo anti-NG2</td><td>Abcam</td><td>ab50009</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson</td><td>ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluoresceina (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-151</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td>1:100</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Disciolto in DMSO</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio anti-sbiadimento</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio anti-sbiadimento con vettore DAPI</td><td> Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Vetrino per camera a 4 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr></tbody></table>

cryo-sezioni della retina, intero-monta e ipotonico vasculature isolato preparazioni per la visualizzazione di immunohistochemical dei pericytes microvascolare

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Periciti giocano un ruolo importante in molte malattie dell'occhio. Tecniche dei vasi retinici e microvascolare di macchiatura immunohistochemical periciti sono al centrali di ricerca oftalmologica. È fondamentale scegliere un metodo appropriato di visualizzare i pericytes microvascolari. Descriviamo retinica Pericita microvascolare immunoistochimica in cryo-sezioni, intero-monta e sistema vascolare isolato ipotonico usando gli anticorpi per β del ricevitore di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ) e l'antigene del nervo/glial 2 (NG2). Questo permette di evidenziare vantaggi e difetti di ciascuna delle preparazioni del tre tessuto per la visualizzazione dei periciti microvascolare. Cryo-sezioni forniscono transsectional visualizzazione di tutti gli strati retinici ma contengono solo qualche occasionale taglio trasversale del microvasculature. Intero-monta fornisce una panoramica dell'intero sistema vascolare retinico, ma la visualizzazione del microvasculature può essere fastidioso. Ipotonica isolamento fornisce un metodo per visualizzare l'intero sistema vascolare retinico tramite la rimozione delle cellule neuronali, ma questo rende il tessuto molto fragile.

I protocolli di successo forniscono tre diverse preparazioni della retina per la visualizzazione di periciti microvascolari. Ciascuno di questi metodi utilizza la PDGFRβ e NG2 immunoreactivity co-localizzazione e la posizione unica dei pericytes che avvolgono l'endotelio capillare identifiicazione.
Con cryo-sezioni, gli strati di un neurone possono essere identificati dalla densità fluorescente dei nuclei DAPI-etichettati e inte...

Dimostriamo di tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la visualizzazione di immunohistochemical di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.

Cryo-sezioni della retina, intero-monta e ipotonico Vasculature isolato preparazioni per la visualizzazione di Immunohistochemical dei Pericytes microvascolare

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'oftalmologia come la proliferazione dei perciti o la migrazione. Il vantaggio principale di questa procedura è che forniscono una varietà di opzioni di visualizzazione. A dimostrare le procedure saranno Karin Dreisig e Frank W.Blixt, due post-doc del nostro laboratorio.Per enucleare l'occhio, utilizzare prima un bisturi per fare le fessure posteriori e anteriori di circa 0,5 centimetri nella palpebra del topo. Afferrare l'occhio con le forcep e inclinarsi con cura di lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con forbici di dissezione nel tessuto connettivo e muscolare.Posizionare brevemente l'occhio in formaldeide al 4% e salina tamponata da fosfati per uno o due minuti. Risciacquare brevemente nel tampone di sodio prima di fare un buco al limbo corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi. Tagliare lungo il limbo corneale con forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con le forcep.Immergere il tessuto rimanente con retina in formaldeide al 4% in PBS per due o quattro ore. Crioprotegga il tessuto immergendosi nel tampone fosfato di Sorenson contenente il 10% di saccarosio e quindi il 25% di saccarosio. Trasferire il tessuto una volta affondato sul fondo del contenitore.Incorporare nel mezzo Yazulla preparato con il 3% di gelatina di pelle suina e il 30% di albumina di albume d'uovo di gallina. Quindi, tagliare le criosezioni verticali da 10 micron della retina incorporata nella gelatina fino al nervo ottico. Posizionare le criosezioni su uno scivolo di vetro e lasciare asciugare per un minimo di un'ora.Una volta asciutto, immergere lo scivolo in PBS con 0,25%Triton-X 100 per 15 minuti. Quindi, gocciolare una miscela di 1:100 beta del recettore PDGF e 1:500 anticorpi primari NG2 in PBST e 1%BSA sulla criosezione e posizionare in una camera umida a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare le sezioni immergendo lo scivolo in PBST due volte per 15 minuti ogni volta.Quindi gocciolare una miscela di anticorpi secondari collegati ad Alexa Fluor 594 anti-topo 1:100 e 1:100 anti-coniglio collegati al FITC diluiti in PBST con 3%BSA sulle criosezioni e incubare per un'ora al buio. Dopo l'incubazione, sciacquare lo scivolo di vetro in PBST due volte per 15 minuti ogni volta. Montare le criosezioni macchiate con un supporto di montaggio anti-dissolvenza contenente DAPI e un coverslip.Una seconda tecnica di preparazione del tessuto retinale è a montaggio intero. Dopo la rimozione della cornea, utilizzare piccoli movimenti di apertura delle forcep per separare la retina dall'epitelio pigmentato retinico verso il nervo ottico. Liberare la retina al nervo ottico con forbici di dissezione e fare da tre a quattro fessure di pochi millimetri di lunghezza dalla periferia retinica verso la testa del nervo ottico.Stendere la retina su uno scivolo di vetro e lasciare asciugare per cinque o 10 minuti. Gocciolare il 4% di formaldeide sulla retina e fissare per 20-30 minuti. Dopo la fissazione, sciacquare con PBS.Per risultati ottimali, immunosostenibile direttamente dopo il risciacquo. In primo luogo, gocciolare PBST sull'intero supporto e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Versare il PBST, quindi aggiungere la soluzione anticorpale primaria e incubare in una camera umida a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, versare l'anticorpo primario e gocciolare sul PBST per risciacquare la retina due volte per 15 minuti ogni volta. Dopo aver versato il secondo lavaggio, gocciolare la soluzione anticorpale secondaria sulla retina e incubare per un'ora in una camera umida a temperatura ambiente al buio. Dopo l'incubazione dell'anticorpo secondario, lavare due volte con PBST come prima.Montare l'intero supporto colorato con supporto di montaggio anti-dissolvenza contenente DAPI e uno scivolo di copertura. Alternativa al montaggio completo della retina, la vascolarizzazione retinica può essere isolata dall'isolamento ipotonico. In primo luogo, posizionare la retina in un millilitro di acqua deionizzata in una piastra di 24 pozzetti e agitare a 200 giri/min con un'orbita di vibrazione di 1,5 millimetri per un'ora a temperatura ambiente, quindi aggiungere 200 unità di DNAsi 1 per dissociare i detriti cellulari lisciviati dalla vascucolatura retinica e agitare per altri 30 minuti a temperatura ambiente.Risciacquare la retina in acqua deionizzata per tre volte per cinque minuti ciascuna con scuotimento a 150-300 giri/min per rimuovere i detriti cellulari neuronali. La retina dovrebbe diventare più trasparente ad ogni risciacquo, indicativa della rimozione dei detriti cellulari neuronali. Dopo il risciacquo, fissare la retina in un millilitro di paraformaldeide e PBS al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente.Risciacquare con PBS tre volte. Se si procede all'immunostaining, bloccare la vascucolatura isolata dall'ipotonico con 500 microlitri di siero d'asino del 10% diluito in PBS per un'ora con scuotimento a 100 giri/min. Dopo il blocco, incubare la retina durante la notte in 600 microlitri di soluzione di anticorpi primari costituiti da 1:100 beta del recettore PDGF e 1:500 anticorpi primari NG2 diluiti nel siero di asino al 10% e PBS.Il giorno successivo, sciacquare la rete retinica tre volte in PBS per cinque minuti ogni volta, quindi incubare in anticorpi secondari collegati ad Alexa Fluor 594th anti-mouse 1:100 anti-coniglio e 1:100 anticorpi secondari collegati al FITC anti-coniglio, diluiti nel siero di asino al 10% e PBS con scuotimento a 100 giri/min a temperatura ambiente per un'ora al buio. Dopo un lavaggio di cinque minuti in PBST, incubare in DAPI e PBST da 0,2 nanogrammi per millilitro per 15 minuti. Lavare tre volte per cinque minuti con PBST mentre è protetto dalla luce.Quindi, tagliare la punta di una pipetta Pasteur di plastica. Rimuovere i bordi affilati utilizzando una punta di pipetta e inumidire la pipetta Pasteur con PBST, quindi aspirare la vascucolatura retinica nella pipetta e erogare in uno scivolo a camera di vetro a quattro pozza. Il passo inumidimento è importante per evitare che la vascolarizzazione retinica si attacchi all'interno della pipetta Pasteur.Posizionare la vascolarizzazione retinica inclinando lo scivolo della camera avanti e indietro. Rimuovere il supporto dai pozzi dello scivolo della camera. La tensione superficiale del liquido appiattirà la vascucolatura sul fondo dello scivolo.Se necessario, gocciolare gocce di liquido sulla vascolarizzazione retinica per svolgersi. Assicurarsi che lo svolgimento corretto al microscopio prima di rimuovere i pozzali di plastica dallo scivolo della camera. Montare la vascucolatura macchiata con mezzo di montaggio anti-dissolvenza e uno scivolo di copertura.L'immunoistochimica NG2 rivela vasi positivi all'interno della parte interna della retina. Le frecce indicano un'immunoreattività circolare e a forma di ferro di cavallo nei vasi. La punta della freccia indica un vaso tagliato longitudinalmente.L'immunoistochimica beta del recettore PDGF mostra un'immunoreattività simile a NG2. Ancora una volta le frecce e la punta della freccia indicano l'immunoreattività nei vasi. Questa immagine mostra un'unione di NG2 in verde, beta del recettore PDGF in rosso e DAPI in blu.Sovrapponendo i tre diversi filtri, viene rivelato che NG2 e PDGF-receptor beta sono co-localizzati. Questa immagine mostra una preparazione immunosostenibile a montaggio intero con colorazione NG2 in rosso. L'immunoreattività è visibile lungo la rete vascolare superficiale con colorazione intensa nei periciti abluminali.Le cellule neuronali sono visibili come nuclei blu DAPI tra la microvascolarizzazione macchiata di NG2. Questa immagine mostra la rete vascolare retinica interna del ratto isolata ipotonica macchiata con NG2 in verde e beta del recettore PDGF in rosso. L'intero network ha mostrato NG2-immunoreattività.L'immunoreattività beta del recettore PDGF è stata trovata nei somi cellulari. Ad un ingrandimento più elevato, è chiaro che la colorazione beta del recettore PDGF è osservata solo nei somi cellulari nella rete vascolare, indicando l'immunoreattività dei perciti. L'inclusione della colorazione DAPI insieme alla beta del recettore NG2 e PDGF rivela tre periciti in due celle a parete di vasi indefinite in questa immagine ad alto ingrandimento.Seguendo queste procedure, altre immunosottenizioni come cellule muscolari lisce o colorazioni endoteliali possono essere utilizzate per rispondere a domande aggiuntive. Ad esempio, come stanno le cellule della vascucolatura retinica dopo l'ischemia?

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Viene descritto un protocollo per la preparazione di criosezioni retiniche di topo e l'esecuzione dell'immunocolorazione sui fotorecettori. Questo articolo consente ai ricercatori di produrre in modo coerente sezioni congelate della retina di topo con morfologia ben conservata e risultati di immunocolorazione di alta qualità.

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En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Il metodo attuale consente criostato riproducibile sezionamento di piccole dimensioni, difficili da gestire, pezzi di tessuto, come ad esempio biopsie e fette di cervello. Utilizziamo una semplice fase di congelamento in alluminio da facilitare la manipolazione di tessuti e un criostato standard per produrre regolarmente sezioni 5-10 micron di serie da 400 sezioni di cervello micron di spessore.

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