Valutare il ruolo della funzione mitocondriale in affaticamento legato al cancro

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la disfunzione mitocondriale associata all'affaticamento nei pazienti oncologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della cura del cancro di supporto, come ad esempio se la disfunzione mitocondriale è associata all'affaticamento nei pazienti con cancro dopo aver ricevuto la radioterapia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è meno invasiva e può essere facilmente utilizzata in clinica per identificare i pazienti a rischio di tossicità da terapia antitumorale.

Questa tecnica non solo fa progredire la nostra comprensione del ruolo della disfunzione mitocondriale nell'affaticamento correlato al cancro, ma può anche migliorare la valutazione e può ottimizzarne la gestione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi alla base dell'affaticamento correlato al cancro, può essere applicato anche ad altre condizioni patologiche affaticanti come le condizioni metaboliche e infiammatorie uriniche. In generale, può essere difficile per le persone che non conoscono questo metodo iniettare correttamente gli inibitori respiratori in ciascuna porta della cartuccia del sensore senza una previa dimostrazione visiva.

A dimostrare questa procedura sarà il signor Quang Nguyen, un borsista postbac del nostro laboratorio. Per idratare la cartuccia del sensore, rimuoverla prima dalla confezione. Quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione calibrante a ciascun pozzetto della piastra di servizio.

Riempire anche ogni fossato con 400 microlitri di soluzione calibrante. Quindi, riposizionare la piastra del sensore sulla piastra di servizio e iniziare a idratare la cartuccia in un incubatore senza anidride carbonica a 37 gradi Celsius durante la notte. Misurare il livello di affaticamento in base alla valutazione funzionale di 13 item della terapia per malattie croniche.

Affaticamento al basale, al punto medio, al completamento dell'EBRT e un anno dopo l'EBRT. Per prima cosa preparare il terreno di prova per la misurazione della funzione mitocondriale. Dopo aver preparato il terreno, scaldarlo a 37 gradi Celsius e regolare il pH a 7,4.

È importante assicurarsi che il terreno di prova sia preparato il giorno dell'esperimento e riscaldato fino a 37 gradi prima di regolare il PH a 7,4. Quindi seminare i PBMC in ogni pozzo per raggiungere una confluenza dall'80 al 90 percento. Quindi girare la piastra a 200 volte g per 2 minuti in modo che le cellule aderiscano al fondo dei pozzetti.

Dopo la centrifuga, rimuovere il terreno da ciascun pozzetto e sciacquare i pozzetti una volta con il terreno di analisi. Aggiungere 180 microlitri di terreno di coltura in ogni pozzetto, compresi i pozzetti di fondo. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore senza anidride carbonica per 45-60 minuti.

Per ricostituire i farmaci, aggiungere 252 microlitri di terreno di analisi al farmaco per generare una soluzione madre da 50 micromolari di oligomicina. Aggiungere 288 microlitri di terreno di prova al farmaco per generare una soluzione madre da 50 micromolari di FCCP. Infine aggiungere 216 microlitri di terreno di prova per generare una soluzione madre da 25 micromolari di antimicina a/rotenone.

Dopo aver ricostituito tutti e tre i farmaci, vorticare la sospensione del farmaco per un minuto e poi diluire le soluzioni di lavoro. Quindi pipettare 20 microlitri di oligomicina 10 micromolari nella porta A a una concentrazione finale di un micromolare in ciascun pozzetto. Pipettare quindi 22 microlitri di FCCP da 10 micromolari nella porta B fino a una concentrazione finale di un micromolare in ciascun pozzetto.

Infine pipettare 25 microlitri di 5 micromolari di antimicina a/rotenone nella porta C ad una concentrazione finale di 0,5 micromolari in ciascun pozzetto. Quindi selezionare il Mito Stress Test sullo strumento di flusso extracellulare. Quindi inserire la cartuccia del sensore seguendo le istruzioni dello strumento.

Lo strumentale eseguirà automaticamente la calibrazione del sensore. Una volta terminata la calibrazione, inserire la piastra cellulare dello strumento per completare il resto del saggio. Per preparare la soluzione per il saggio di proliferazione cellulare, aggiungere 5,76 microlitri di colorante di acido nucleico e 28,8 microlitri di soppressore di fondo a 1,405 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato.

Al termine del Mito Stress Test, aggiungere 180 microlitri di soluzione di lavoro 2x direttamente nel terreno in ogni pozzetto. Quindi incubare le cellule con la soluzione per il saggio di proliferazione cellulare a 37 gradi Celsius per 45-60 minuti. Quantificare il numero di cellule vive su un lettore di piastre a 508 nanometri di eccitazione e 527 nanometri di emissione, quindi normalizzare i dati OCR.

Durante l'esecuzione della titolazione FCCP, un micromolare è la concentrazione ottimale del farmaco che viene utilizzata per valutare la funzione mitocondriale della PBMC. L'indagine sulla respirazione mitocondriale e sulle PBMC appena isolate mostra che l'OCR inizia a diminuire a tre ore e continua fino a otto ore. Tuttavia, anche la respirazione massima suscitata dall'iniezione di FCCP non supera il livello basale di OCR.

Qui viene mostrata la normalizzazione della funzione mitocondriale dove le cellule sono isolate da due individui sani. Infatti, l'OCR normalizzato alle cellule vive, rappresentato dal colorante verde legante il DNA a fluorescenza, è simile in entrambi gli individui sani. Infatti, non si osserva alcuna differenza significativa nell'OCR basale tra un soggetto sano e uno affaticato.

Tuttavia, il soggetto affaticato mostra una diminuzione del consumo massimo di ossigeno e una capacità respiratoria di riserva rispetto al controllo. Non sono state riscontrate differenze nel consumo di ossigeno non mitocondriale e ATP correlato o nell'efficienza di accoppiamento tra soggetti sani e affaticati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di determinare prima la densità cellulare ottimale e le concentrazioni di FCCP. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'isolamento di diverse popolazioni cellulari, al fine di guidare le future indagini meccanicistiche incentrate su specifici tipi di cellule. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle cure di supporto per esplorare il ruolo della disfunzione mitocondriale nei pazienti oncologici affaticati.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la funzione mitocondriale e i campioni clinici che possono essere utilizzati anche per identificare in modo proattivo i pazienti a rischio di sviluppare tossicità correlate al trattamento del cancro, incluso l'affaticamento. Non dimenticare che lavorare con inibitori respiratori come l'oligomicina e il rotenone può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale.