Name: Il lavaggio broncoalveolare esosomi in lesioni polmonari settici Lipopolysaccharide indotta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Scopri il ruolo degli esosomi nel danno polmonare acuto indotto da LPS nei topi. Questo metodo permette di isolare e caratterizzare esosomi purificati dal lavaggio broncoalveolare per studiare la comunicazione cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori non hanno dichiarato alcun conflitto di interessi.

Il protocollo generale richiede 2 giorni, inclusi il primo giorno di induzione di sepsi e l'isolamento del liquido di BAL dall'animale e il secondo giorno per l'isolamento di esosomi dal mouse BALF. Tutte le procedure sono state esaminate e approvate dal comitato di uso Atlanta VA medical center e istituzionali Animal Care.
1. Mouse polmone settica acuta lesioni modello
<ol><li>Utilizzare 6-8 settimane - topi di C57BL/6J wild-type maschi vecchi (peso g 20-22) per l'animale modello ed eseguire tutte le procedure usando tecniche asettiche e strumenti. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici, tra cui pinze e le forbici per 20 minuti a 121 ° C.</li>
	<li>Distribuire in modo casuale topi in sperimentale e gruppo di controllo. Trattenga i topi su una tavola chirurgica. Trattamento di topi con il lipopolysaccharide di Escherichia coli (LPS, 15 mg/kg) per via intraperitoneale. Secondo il peso corporeo individuale, diluire appropriati dosaggi di LPS a 0,1 mL di PBS per topo, quindi iniettare la soluzione di LPS usando una siringa da 1 mL con ago 27G e iniettare un volume equivalente di PBS agli animali di controllo.</li>
	<li>Tenere topi nella struttura BSL2 animale, che consiste di gabbie pulite a temperatura appropriata.</li>
	<li>24 ore più tardi, eutanasia topi con inalazione di CO2 .</li>
	<li>Selezionare l'area chirurgica nel centro del collo del mouse. Praticare una piccola incisione (circa 5 mm) e separare delicatamente i muscoli per l'accesso alla trachea con forcipe smussato fino a quando la trachea è esposto.</li>
	<li>Ritirare il liquido di BAL del mouse con siringa sterile da 10 mL con un ago da 27 G. In primo luogo, delicatamente, inserire l'ago nella trachea e iniettare 1 mL di PBS sterile lentamente nella trachea, quindi disegnare BALF in una siringa monouso da 3 mL con ago 27G. Al termine della procedura, smaltire siringhe e aghi in contenitore di sharps di biohazard.</li>
	<li>Trattare gli strumenti chirurgici con biossido di cloro, come descritto in precedenza da Chauret et al. 27e quindi sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave per 20 minuti a 121 ° C.</li>
</ol>2. esosomi isolamento-serie Ultra-centrifugazione e caratterizzazione
<ol><li>Raccogliere il liquido di BAL del mouse in provette coniche da 15 mL. Per raccogliere le cellule alveolari, centrifugare i campioni per 10 min a 1.000 g, a 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante nuove provette coniche da 15 mL, quindi centrifugare i campioni per 30 min a 4.000 x g a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante in ultracentrifuga tubi e centrifugare i campioni per 60 min a 10.000 x g a 4 ° C per rimuovere le particelle più grandi di cellulare.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in nuove provette coniche, quindi filtrare i campioni attraverso 0,2 µm siringa-filtro per rimuovere i restanti particelle più grandi.</li>
	<li>Raccogliere campioni in tubi ultracentrifuga e l'equilibrio di tubi. Centrifugare i campioni per 2 h a 140.000 x g a 4° C a pellet gli esosomi. Nota: La dimensione di esosomi varia 20-200 nanometro. 0,2 µm filtro viene utilizzato per la rimozione di particelle più grandi che sono più di 200 nm in dimensione.</li>
	<li>Scartare i surnatanti delicatamente. Dissolva la pallina con 100 µ l PBS o soluzione di lisi e trasferimento esosomi campioni per provette da 1,5 mL e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo. Nota: Microscopio elettronico a trasmissione è consigliabile verificare gli esosomi isolati.</li>
	<li>Seguire il campione TEM standard elaborazione protocollo28. Analisi di campioni di esosomi usando microscopia elettronica di trasmissione e prendere immagini, scala bar 200 nm.</li>
</ol>3. preparazione del miRNA e Performing miRNA-q-RT-PCR
Nota: miRNA-q-RT-PCR si raccomanda di analizzare il livello di espressione dei miRNA.
<ol><li>Seguire il protocollo di isolamento standard Mirna e assicurarsi di utilizzare una quantità uguale di RNA purificato nella trascrizione inversa single-strand24.</li>
	<li>Seguire il protocollo standard di PCR in tempo reale per rilevare il livello di microRNA exosomal in liquido di BAL. Utilizzare specifici iniettori di PCR in tempo reale contro miR-155, miR-146a e SnRNA U6. Eseguire la reazione di PCR con apparato PCR quantitativa e normalizzare i valori di espressione per controllo interno U6 snRNA. Nota: Ogni gruppo è costituito da campioni triplici24.</li>
</ol>4. esosomi etichettatura e purificazione
<ol><li>Sospendere gli esosomi pellet con 100 µ l di soluzione di sospensione in una provetta di polipropilene da 1,5 mL, quindi aggiungere 0,4 µ l della tintura esosomi nell'altro tubo con 100 µ l della soluzione di sospensione.</li>
	<li>Aggiungere esosomi nella soluzione per la soluzione colorante e mescolare accuratamente pipettando rapidamente. Conservare i campioni per 5 min a temperatura ambiente, proteggere dalla luce.</li>
	<li>Mettere una colonna di esosomi spin in una provetta di eluizione da 1,5 mL. Trasferire la miscela di soluzione al centro della colonna di spin di esosomi.</li>
	<li>Girare la colonna per 2 min a 800 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare la colonna e conservare il campione eluito a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
</ol>5. convalida di esosomi Up preso da cellule recettive
<ol><li>Semi di 1 x 104 MLE 12 prodotto in una diapositiva di 8 pozzetti camera e cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l con etichetta fluorescente esosomi alle celle. Incubare per 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere i mezzi di coltura e lavare le cellule con PBS, quindi fissare le cellule con paraformaldeide 1% per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Montare il vetrino in un mezzo di montaggio con DAPI.</li>
	<li>Analizzare i campioni attraverso un microscopio a fluorescenza e prendere le immagini, ingrandimento 40x.</li>
</ol>6. Verifica dell'interazione tra esosomi e cellule recettive
<ol><li>Seme 2 x 105 MLE12/pozzetto di una piastra di coltura 12-pozzetti contenenti terreno di coltura appropriato e cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ g esosomi dal fluido del mouse BAL MLE12 celle e impostare ripetizioni per gruppo sperimentale.</li>
	<li>24 ore dopo, lavare le cellule con PBS e aggiungere 600 µ l di tampone di lisi in pozzetto. Agitare la piastra delicatamente e raccogliere campioni di lisi in provetta da 1,5 mL con la pipetta.</li>
	<li>Seguire il protocollo di isolamento di RNA totale standard e protocollo di trascrizione d'inversione del cDNA, completare la trascrizione inversa del cDNA del singolo-filo29.</li>
	<li>Seguire il protocollo standard di PCR in tempo reale per rilevare il livello di espressione di mRNA in cellule recettive29. Utilizzare specifici iniettori di PCR in tempo reale contro TNF-α, IL-6 e ZO-1. Eseguire reazioni di PCR con apparato PCR quantitativa e normalizzare i valori di espressione per il controllo interno GAPDH. Nota: Ogni gruppo è costituito da campioni triplici.</li>
</ol>

<ol><li>Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of acute lung injury.</a> Chest. 131, 554-562 (2007).</li>
<li>Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+manipulated+mouse+models+of+lung+disease%3A+potential+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).</li>
<li>Han, S., Mallampalli, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 855-860 (1950).</li>
<li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%3A+A+Review+of+Analytical+Approaches%2C+Pathologic+Features%2C+and+Common+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements.</a> Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).</li>
<li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lung injury.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).</li>
<li>Terrasini, N., Lionetti, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28328650">Exosomes in Critical Illness.</a> Critical care medicine. , (2017).</li>
<li>Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+New+Players+in+Lung+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).</li>
<li>Kubo, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28684288">Extracellular Vesicles in Lung Disease.</a> Chest. 153, 210-216 (2018).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Fanini, F., Fabbri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER-DERIVED+EXOSOMIC+microRNAs+SHAPE+THE+IMMUNE+SYSTEM+WITHIN+THE+TUMOR+MICROENVIRONMENT%3A+STATE+OF+THE+ART%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2016).</li>
<li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental%2C+Systems%2C+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation research. 120, 701-712 (2017).</li>
<li>Prattichizzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNAs+and+endothelial+hyperglycaemic+memory%3A+a+therapeutic+opportunity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+obesity+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity?</a> Diabetes, obesity & metabolism. 18, 855-867 (2016).</li>
<li>Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Novel+Mediators+of+Cell+Communication+In+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).</li>
<li>Khalyfa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Plasma+Extracellular+Microvesicle+MicroRNA+Cargo+and+Endothelial+Dysfunction+in+Children+with+Obstructive+Sleep+Apnea%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).</li>
<li>Thomou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+circulating+miRNAs+regulate+gene+expression+in+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues.</a> Nature. 542, 450-455 (2017).</li>
<li>Gregson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Exosomal+RNA+Profiles+in+Bronchoalveolar+Lavage+from+Lung+Transplants+with+Acute+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Regulation+of+miR-155+and+miR-146a+Genes+during+Induction+of+Endotoxin+Tolerance+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5750-5761 (2015).</li>
<li>Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+and+functional+specialization+of+miR-146+and+miR-155+in+innate+immune+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing.</a> Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).</li>
<li>Alexander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-delivered+microRNAs+modulate+the+inflammatory+response+to+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin.</a> Nature communications. 6, 7321(2015).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+is+induced+in+tumor+associated+macrophages+by+cyclo-oxygenase+pathway+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer.</a> PloS one. 9, e94241(2014).</li>
<li>Xu, R., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+In+Vitro+Co-Culture+Model+in+Anti-Cancer+Drug+Development+Cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+chemistry+%26+high+throughput+screening%22%5BJournal%5D)">Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade.</a> Combinatorial chemistry & high throughput screening. 20, 451-457 (2017).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1-accentuated+lung+injury+via+miR-155+is+inhibited+by+LP17+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).</li>
<li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dose+dexamethasone+accentuates+nuclear+factor-kappa+b+activation+in+endotoxin-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+mediated+epigenetic+modulation+inhibits+TREM-1+expression+in+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 2032-2043 (2012).</li>
<li>Chauret, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine+dioxide+inactivation+of+Cryptosporidium+parvum+oocysts+and+bacterial+spore+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators.</a> Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).</li>
<li>Cizmar, P., Yuana, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+by+Transmission+and+Cryo-Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy.</a> Methods in molecular biology. , Clifton, N.J. 221-232 (2017).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-related+proteins+prolong+macrophage+survival+through+induction+of+Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Scientific reports. 7, 42028(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Transfer+in+Direct+Co-cultures+of+Human+Monocyte-derived+Macrophages+%28MDM%29+and+Mesenchymal+Stem+Cells+%28MSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC).</a> Bio-protocol. 7, (2017).</li>
<li>Fujita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+New+Players+in+Lung+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).</li>
<li>Gunasekaran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-Derived+Exosomes+With+Lung+Self-Antigens+in+Human+Lung+Allograft+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+transplantation+%3A+official+journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection.</a> American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).</li>
<li>Kalra, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+evaluation+of+plasma+exosome+isolation+techniques+and+assessment+of+the+stability+of+exosomes+in+normal+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma.</a> Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma%3A+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PloS one. 10, e0145686(2015).</li>
<li>Nordin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+with+size-exclusion+liquid+chromatography+for+high+yield+isolation+of+extracellular+vesicles+preserving+intact+biophysical+and+functional+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%3A+nanotechnology%2C+biology%2C+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties.</a> Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).</li>
</ol>

Questo lavoro è stato supportato da recensione di merito VA 2I01BX001786-06A1 finanziamenti a RS.

Modelli murini di malattie sono comunemente utilizzati per valutare la funzione fisiologica dei geni specifici e per ridurre il costo della sperimentazione2. La ferita di polmone acuta settica descritta qui imita risposta infiammatoria visto in esseri umani con ARDS. Questo modello è rilevante per studiare la patogenesi molecolare, sviluppo di biomarcatori e per testare potenziali nuove terapie5.
Sistemi di co-coltura sono rilevanti per gli studi...

ALI e ARDS sono le forme pericolose di insufficienza respiratoria con ipossiemia severa causata da edema polmonare non cardiogeno che colpisce circa 1 milione di persone nel mondo ogni anno1. L'eziologia di ARDS include ferita diretta ai polmoni da infezioni o aspirazione e una varietà di insulti indiretti. Nell'ultimo decennio c'è stata una maggiore comprensione della patogenesi molecolare di ARDS, tuttavia, trattamenti specifici mirati per ARDS sono ancora essere sviluppato2,3.
Sono stati sviluppati diversi modelli animali di danno polmonare acuto che forniscono un ponte per la traduzione di terapie sperimentali per studi umani4,5. I modelli comunemente usati includono installazione locale di acido oleico, batteri, LPS e bleomicina. Altri approcci includono ischemia-riperfusione, puntura cecal legatura, lesione elasticizzato indotta da ventilazione meccanica, l'iperossia o somministrazione sistemica di batteri e LPS5. Questi modelli forniscono un sistema biologico utile per testare le ipotesi cliniche e per lo sviluppo di potenziali terapie. Per simulare umano ARDS, modelli animali dovrebbero riprodurre l'infiammazione e lesione acuta alle cellule epiteliali ed endoteliali con difetti nella funzione di barriera nei polmoni.
Gli esosomi sono vescicole di membrana con 20-200 nanometro di diametro, il cui contenuto molecolare contiene proteine, DNA, RNA e lipidi, e facilitano la comunicazione intercellulare nel microambiente del tessuto tramite trasferimento composizione molecolare. Gli esosomi sono secreti da più tipi di cellule, quali cellule endoteliali, cellule epiteliali, cellule muscolari lisce e cellule del tumore e presenti nel fluido del corpo umano. Studi indicano che gli esosomi regolano cross-talk tra le cellule immunitarie e le cellule stromali durante malattie infiammatorie, infettive e sterile, e loro rilascio anormale sembra essere regolata da vari stimoli naturali e sperimentali durante fisiologico e processi patologici6. Tale rete di comunicazione può svolgere un ruolo importante nella patogenesi di malattie polmonari e può influenzare la progressione fisiopatologico7,8. Come 18-22 nucleotidi RNA non codificanti, Mirna esiste nel siero sia dei tessuti e fluidi corporei, al plasma e modula l'espressione di mRNA a livello post-traduzionale9,10.
Mirna confezionati in esosomi influenzano la differenziazione e la funzione di più tipi di cellule, e livelli eccessivi sono associati con una varietà di malattie, compreso il cancro, malattie polmonari, obesità, diabete e malattia cardiovascolare11, 12,13,14,15,16. Entrata in cellule del destinatario e la spola di Mirna exosomal facilitare comunicazioni intercellulari modificando l'emostasi del microambiente17,18. Ferita di polmone acuta è un processo complesso, che prevedono più tipi di cellule con vasta comunicazione intercellulare attraverso esosomi8. miR-155 e miR-146a condividere il comune meccanismo di regolazione trascrizionale e contribuire alla risposta infiammatoria e la tolleranza immunitaria19,20. Gli studi recenti indicano che entrambi modulano la risposta infiammatoria via exosomal Mirna spola tra cellule immunitarie21. Tuttavia, i meccanismi molecolari sottostanti effetti modulatory di Mirna exosomal alveolare risposta all'endotossina rimangono poco chiari, senza dubbio la potenziale rilevanza clinica e traslazionale implicazione merito ulteriore indagine.
Modelli di co-coltura sono impiegati per definire l'interazione dei tipi cellulari specifici nell'ambiente complesso, quali l'infiammazione e cancro22,23. Queste piattaforme forniscono una strategia alternativa per interrogare i cross-talk tra tipi cellulari in particolare per le cellule immuni e strutturali.
Endotracheale, amministrazione aerosolizzato, intraperitoneale o sistemica di LPS sono ampiamente usati per indurre sperimentale del polmone lesioni24,25,26e hanno dimostrato di indurre permeabilità epiteliale ed endoteliale difetti. Qui usiamo LPS intraperitoneale per indurre un modello settico della ferita acuta del polmone in topi. Entro 24 h dalla somministrazione intraperitoneale di LPS, difetti di permeabilità sono indotte nei polmoni con il reclutamento di cellule infiammatorie. Inoltre, mostriamo che esosomi da BAL contengono miRNA-155 e miR-146a, ed esosomi da liquido di BAL inducono l'espressione di citochine pro-infiammatorie in cellule epiteliali destinatario, compreso IL-6 e TNF-α. Questi dati sono il primo a mostrare che i miRNA exosomal vengono secreti nel BAL in questo modello di danno polmonare acuto settico.

<table><tbody><tr><td>lipopolisaccaride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Escherichia coli 055:B5</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH7.2(1X)</td><td>Life technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA kit di isolamento</td><td>Thermo Fisher</td><td>449774</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>mmu-miR-155 (002571) primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-146a (000468) primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>U6snRNA primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;( Mm00443258_m1 ) primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 (Mm00446190_m1&nbsp; &nbsp; )primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 (Mm00493699_m1&nbsp; )primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>terreno essenziale minimo (MEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11095-072</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Trysin-EDTA (0,05%)</td>Gli esosomi <td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>sono stati marcati con PKH67 attraverso PKH67 Mini Kit di collegamento per celle fluorescenti verdi.</td>Colonne di spin per esosomi <td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>(MW3000)</td><td>Ultracentrifuga Thermo Fisher</td><td>4484449</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100XP&nbsp;</td>Provette da centrifuga <td>ultra-trasparenti Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopi elettronici a trasmissione (TEM)</td><td>JEOL Ltd</td><td>120 kV TEM</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX41 microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

il lavaggio broncoalveolare esosomi in lesioni polmonari settici lipopolysaccharide indotta

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Lesioni polmonari acute (ALI) e sindrome da distress respiratorio (ARDS) rappresentano un gruppo eterogeneo di malattie polmonari che continua ad avere un'alta morbosità e mortalità. Patogenesi molecolare delle ALI è essere meglio definiti; Tuttavia, a causa della natura complessa della malattia terapie molecolari devono ancora essere sviluppato. Qui usiamo un modello di topo indotta lipopolysaccharide (LPS) di danno polmonare acuto settica di delineare il ruolo degli esosomi nella risposta infiammatoria. Utilizzando questo modello, siamo stati in grado di dimostrare che i topi che sono esposti a LPS intraperitoneali secernono esosomi nel fluido di lavaggio (BAL) di bronco-alveolare dai polmoni che sono confezionati con miRNA e citochine che regolano la risposta infiammatoria. Ulteriormente utilizzando un sistema di modello di co-coltura, mostriamo che gli esosomi rilasciati dai macrofagi interrompono espressione delle proteine di giunzione stretta in cellule epiteliali bronchiali. Questi risultati indicano che 1) cross-talk tra cellule innate immune e strutturali attraverso la marcia exosomal contribuiscono alla risposta infiammatoria e rottura della barriera strutturale e 2) targeting questi miRNA può fornire una nuova piattaforma per trattare ALI e ARDS.

Per indurre il danno polmonare settico, i topi sono stati trattati con LPS intraperitoneali (15 mg/kg). Entro 24 h dalla amministrazione dei LPS, neutrophilic afflusso è stato visto nei polmoni, come mostrato in Figura 1A. Liquido di BAL del mouse è stato disegnato, seguita da isolamento e purificazione di esosomi. Morfologia di BALF esosomi è stata confermata da microscopia elettronica di trasmissione (Figura 1B).
<p class="...

Topi esposti a LPS intraperitoneali secernono esosomi nel fluido di lavaggio (BAL) bronco-alveolare che sono confezionati con Mirna. Utilizzando un sistema di co-coltura, indichiamo che esosomi rilasciati nel liquido di BAL perturbare l'espressione delle proteine di giunzione stretta in cellule epiteliali bronchiali ed aumentano l'espressione delle citochine pro-infiammatorie che accentuano la ferita di polmone.

Il lavaggio broncoalveolare esosomi in lesioni polmonari settici Lipopolysaccharide indotta

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di delineare il ruolo degli esosomi nelle risposte infiammatorie in un modello murino di lesione polmonare settica acuta indotta da LPS. Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative al cross-talk cellulare nel danno polmonare acuto e nella sindrome da distress respiratorio acuto. In particolare, la comunicazione intercellulare all'interno dell'ambiente alveolare-micro tramite la navetta degli esosomi.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento e la caratterizzazione di esosomi di lavaggio broncoalveolare altamente purificati derivati da topi settici trattati con endotossine con danno polmonare acuto. A dimostrare la procedura è il dottor Zhihong Yuan e il dottor Chetna Bedi. Per iniziare, caricare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 27 con 0,1 millilitri di LPS e PBS per topo e trattenere manualmente il primo topo maschio C57 nero 6J di sei-otto settimane.Erogare l'LPS per via intraperitoneale e riportare l'animale nella sua gabbia. 24 ore dopo, praticare un'incisione di cinque millimetri al centro del collo del primo animale e utilizzare una pinza smussata per separare delicatamente i muscoli per esporre la trachea. Quindi, inserire delicatamente un ago calibro 27 collegato a una siringa sterile da 10 millilitri nella trachea e iniettare un millilitro di PBS sterile.Quindi sostituire immediatamente la siringa da 10 millilitri con una siringa da tre millilitri dotata di un nuovo ago calibro 27. Aspirare il liquido di lavaggio broncoalveolare o BOLF e aggiungere il BOLF in un tubo conico da 15 millilitri opportunamente etichettato su ghiaccio. Per isolare gli esosomi, centrifugare i campioni BOLF e trasferire i surnatanti in nuove provette da 15 millilitri.Centrifugare nuovamente i campioni e trasferire i surnatanti in provette da ultracentrifuga per rimuovere le particelle cellulari più grandi. Trasferire i surnatanti in nuove provette coniche e caricare i campioni in filtri per siringa da 0,2 micron per rimuovere le particelle più grandi rimanenti. Aggiungere i campioni filtrati alle nuove provette per ultra-centrifuga per pellettare gli esosomi.Scartare con cura i surnatanti e risospendere i pellet in 100 microlitri di PBS per provetta. Quindi trasferire i campioni di esosomi in singole provette da 1,5 millilitri per la loro conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per purificare gli esosomi, aggiungere 0,4 microlitri del colorante esosomiale appropriato a una provetta contenente 100 microlitri di soluzione di sospensione per campione e aggiungere rapidamente un campione di esosoma scongelato a ciascuna provetta di colorante.Mescolare accuratamente gli esosomi con il colorante e incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, posizionare una colonna di spin dell'esosoma per campione in una provetta illusione da 1,5 millilitri e trasferire le soluzioni dell'esosoma al centro di ciascuna colonna di spin. Quindi centrifugare i campioni, scartare le colonne e conservare i campioni allusi a meno 20 gradi Celsius.Per misurare l'assorbimento dell'esosoma da parte delle cellule riceventi, il primo seme una volta per 10 al quarto epiteliale polmonare di topo 12 cellule in 0,5 millilitri di terreno in ciascun pozzetto di un vetrino a otto pozzetti per una coltura di 16 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Dopo lo scongelamento, aggiungere 10 microlitri di esosomi fluorescenti purificati a ciascun pozzetto e rimettere le colture cellulari nell'incubatore per un'ora. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con PBS e fissare ogni co-coltura con paraformaldeide all'1% per 10 minuti a temperatura ambiente.Rimuovere il terreno e quindi montare il vetrino con il terreno integrato con DAPI e visualizzare i campioni mediante microscopia a fluorescenza con un ingrandimento di 40 volte. Per verificare l'interazione dell'esosoma con le cellule riceventi, seminare due volte 10 al quinto cellule epiteliali del polmone di topo 12 in due millilitri di terreno per pozzetto in una piastra di coltura a 12 pozzetti contenente il terreno di coltura appropriato per un'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, aggiungere 20 microgrammi di esosomi a tre pozzetti di cellule epiteliali per gruppo sperimentale e rimettere le cellule nell'incubatore.Dopo 24 ore, rimuovere il terreno, lavare le cellule con PBS e aggiungere 600 microlitri di tampone di lisi in ciascun pozzetto agitando delicatamente. Quindi trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto in singole provette da 1,5 millilitri e analizzare i campioni secondo i protocolli standard di PCR in tempo reale. Entro 24 ore dalla somministrazione di LPS, si osserva un afflusso neutrofilo nei polmoni degli animali trattati con LPS.Dopo il loro isolamento e purificazione, come appena dimostrato, la presenza di esosomi nel BOLF da animali con lesioni polmonari settiche può essere confermata mediante microscopia elettronica a trasmissione. L'espressione di alcuni micro RNA pro-infiammatori è significativamente aumentata negli esosomi del liquido broncoalveolare di animali trattati con LPS rispetto ai topi controllati trattati con PBS. Gli esosomi trattati con LPS vengono assorbiti dalle cellule epiteliali dei bronchioli di topo, come evidenziato dalla co-localizzazione di esosomi marcati con colorante fluorescente con cellule marcate con DAPI dopo un'ora di co-coltura.L'espressione del mediatore pro-infiammatorio è significativamente aumentata nelle cellule epiteliali co-coltivate con esosomi di animali trattati con LPS rispetto alla co-coltura con esosomi di topi trattati con PBS di controllo. Inoltre, le cellule trattate con esosomi da topi trattati con LPS dimostrano un'espressione significativamente attenuata di zonula occludens one rispetto ai controlli, indicando una minore integrità cellulare intatta dopo la co-coltura di esosomi trattati con LPS. L'iniezione intra-peritoneale di LPS, l'estrazione del lavaggio broncoalveolare e la delega dell'esosoma dal lavaggio broncoalveolare, tutte le fasi possono essere completate in un lasso di tempo relativamente breve.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la co-coltura di cellule esosomiali ed epiteliali, per rispondere a ulteriori domande sul cross-talk tra cellule innate e strutturali nel microambiente alveolare polmonare. Il cross-talk tra le cellule immunitarie innate e le cellule strutturali tramite lo shuttle degli esosomi contribuisce alla risposta infiammatoria e alla distruzione strutturale della barriera, suggerendo che il targeting dei micro-RNA esosomiali può fornire una piattaforma normale per il trattamento del danno polmonare acuto e della sindrome da distress respiratorio acuto. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come indurre lesioni polmonari settiche nei topi, isolare il liquido di lavaggio broncoalveolare dai topi, isolare gli esosomi dal liquido di lavaggio e utilizzare un modello di co-coltura per interrogare il crosstalk intracellulare.Non dimenticare che lavorare con l'LPS può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati.

bronchoalveolar-lavage-exosomes-lipopolysaccharide-induced-septic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

La risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

Descriviamo un metodo per indurre l'infiammazione polmonare neutrofila dalla sfida di lipopolysaccharide aerosol per nebulizzazione, per modellare danno polmonare acuto. Inoltre, sono anche descritti tecniche chirurgiche di base per l'isolamento del polmone, l'intubazione tracheale e lavaggio broncoalveolare.

Un metodo per generare polmonare Neutrofilia Uso inalato Lipopolisaccaride

lavaggi polmonari ripetute in maiali anestetizzati inducono il danno polmonare simile a importanti aspetti della sindrome da distress respiratorio acuto umana (ARDS). A tal fine i polmoni sono ripetutamente lavaged con soluzione fisiologica 0,9% a 37 ° C. L'obiettivo del protocollo è una attenuazione riproducibile di scambio di gas e emodinamica per la ricerca in ARDS.

Lavage indotta surfattante esaurimento nei suini come un modello della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS)

Lo stato di salute del polmone si riflette il tipo e il numero di cellule immunitarie che sono presenti nei bronchioli dei polmoni. Descriviamo una tecnica di lavaggio broncoalveolare che consente di isolare e studio delle cellule non aderenti e fattori solubili dal tratto respiratorio inferiore dei topi.

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

Qui, descriviamo due protocolli di isolamento delle vescicole extracellulari, centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con centrifugazione su gradiente densità, per isolare le vescicole extracellulari da campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare murino. Le vescicole extracellulari derivate dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino con entrambi i metodi sono quantificate e caratterizzate.

Isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino usando una tecnica di centrifugazione di ultrafiltrazione

Presentato qui è una procedura passo-passo per indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione lipopolysaccharide intracheale diretta ed eseguire l'analisi FACS di campioni di sangue, liquido di lavaggio bronchoalveolar e tessuto polmonare. La minima invasività, la manipolazione semplice, la buona riproducibilità e la titolazione della gravità della malattia sono vantaggi di questo approccio.

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

L'ozono combinato e i topi esposti all'endotossina batterica mostrano una morte cellulare diffusa, compresa quella dei neutrofili. Abbiamo osservato adattamenti cellulari come l'interruzione della lamellipodia citoscheletricha, l'aumento dell'espressione cellulare della complessa subunità V ATP sintasi β e l'angiostatina nella lavanda bronco-alveolare, la soppressione della risposta immunitaria polmonare e il reclutamento ritardato di neutrofili.

Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS

In questo studio, una tecnica di instillazione endotracheale non invasiva è dimostrata per sviluppare l'ALI nei ratti utilizzando un laringoscopio di base per garantire una precisa somministrazione di LPS ai polmoni. La LPS viene immessa tramite un tubo endotracheale tramite un laringoscopio. L'entità della lesione polmonare viene valutata in più momenti temporali.

Somministrazione endotracheale non invasiva di lipopolisaccaridi per indurre lesioni polmonari acute nei roditori

Questo protocollo descrive un metodo per trasfezione efficiente siRNA in appena isolate citotrofoblasti villi umani con microperforazione e identificando complessi DNA-proteina in queste cellule. cellule trasfettate possono essere monitorati da Western Blot e EMSA analisi durante il tempo della cultura di 4 giorni.

siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Scopri il ruolo degli esosomi nel danno polmonare acuto indotto da LPS nei topi. Questo metodo permette di isolare e caratterizzare esosomi purificati dal lavaggio broncoalveolare per studiare la comunicazione cellulare.

Il lavaggio broncoalveolare esosomi in lesioni polmonari settici Lipopolysaccharide indotta

Esplora altri video