Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di esprimere e purificare proteine simili all'elastina derivate in modo ricombinante da utilizzare come idrogel sintonizzabile per l'incapsulamento cellulare 3D. Inoltre, questo protocollo presenta la metodologia per la marcatura fluorescente a valle nella microscopia confocale di cellule incapsulate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dei biomateriali, della medicina rigenerativa e della biologia cellulare, come la comprensione del ruolo delle interazioni cellula-matrice extracellulare nel 3D.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una piattaforma di materiali riproducibile, sintonizzabile e modulare, adatta allo studio di più tipi di cellule. Nel complesso, l'implementazione di questa tecnica può migliorare la nostra comprensione dei parametri critici di segnalazione della ECM cellulare che potrebbero determinare il successo delle future terapie rigenerative basate sulle cellule. Striare una piastra di agar di ampicillina e cloramfenicolo con un ceppo batterico prefabbricato contenente un vettore che codifica per l'ELP di interesse.

Quindi incubare la piastra striata capovolta a 37 gradi Celsius durante la notte per consentire la crescita batterica. Il giorno seguente, raccogli una singola colonia dal piatto e inoculare la coltura starter preriscaldata. Incubare la coltura in uno shaker a 37 gradi Celsius per 16 ore.

Trascorso il periodo di incubazione, trasferire con una pipetta sierologica 20 millilitri di coltura starter in ciascun pallone di espressione. Lasciare agitare il fiasco di espressione per un'ora. Dopo un'ora, misurare la densità ottica a 600 nanometri di un'aliquota dal pallone di espressione.

Non appena la lettura raggiunge 0,6, ridurre la temperatura dello shaker a 32 gradi Celsius. Quando la lettura raggiunge 0,8, aggiungere un millilitro di un molare di IPTG filtrato sterile per indurre l'espressione di ELP nel pallone di espressione. Lasciate che la cultura si esprima per sette ore.

Dopo sette ore, centrifugare il mezzo di espressione a 12.000 x g per 15 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga a pavimento. Dopo la centrifugazione, utilizzare una spatola per raccogliere il pellet di cella dal contenitore della centrifuga e metterlo in un sacchetto con chiusura lampo prepesata. Quindi, sciogliere il pellet cellulare in un tampone TEN filtrato sterile.

Massaggiare il pellet cellulare fino a formare una soluzione omogenea. Congelare il sacchetto ziploc con pellet a celle risospese in un contenitore secondario a 80 gradi Celsius. Al pellet cellulare scongelato, aggiungere circa 30-40 milligrammi di desossiribonucleasi e un millilitro di PMSF 100 millimolare per ogni 100 millilitri di lisato cellulare.

Incubare il lisato a quattro gradi Celsius su uno shaker per una notte. Dopo il terzo ciclo di congelamento-scongelamento, centrifugare i campioni ad almeno 15.000 x g per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante dal contenitore della centrifuga e trasferire la soluzione in un nuovo contenitore della centrifuga.

Per ogni 100 millilitri di surnatante, aggiungere 5,84 grammi di cloruro di sodio in tre parti fino a una concentrazione finale di un molare. Incubare la sospensione in un'incubatrice vibrante a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni ad almeno 15.000 x g per un'ora a 37 gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante dal contenitore della centrifuga e ammassare il pellet. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di acqua ultrapura autoclavata per grammo di pellet ottenuto dopo centrifugazione. Per assicurarti che la proteina si dissolva completamente, usa una spatola di metallo per schiacciare e risospendere il pellet.

Incubare il pellet risospeso a quattro gradi Celsius per una notte su un agitatore orbitale. Ripetere le fasi di centrifugazione a freddo e a caldo per un totale di tre cicli per purificare ulteriormente l'ELP. Successivamente, comporre il surnatante residuo in una membrana di dialisi da 3,5 kilodalton contro quattro litri di acqua ultrapura prerefrigerata a quattro gradi Celsius per tre giorni per desalinizzare la soluzione proteica.

Centrifugare la soluzione dializzata finale in una centrifuga preraffreddata. Congelare il surnatante a 80 gradi Celsius in una provetta conica prepesata. Infine, liofilizzare la soluzione congelata per tre giorni e quindi pesare il prodotto liofilizzato finale per determinare la resa proteica.

Con l'aiuto di un punzone per biopsia, creare dei fori in un foglio di silicone spesso 0,5 millimetri. Quindi taglia un quadrato attorno a ciascun foro. Quindi, usa una pinzetta per rimuovere l'involucro di plastica su ciascun lato dei singoli stampi.

Dopo aver rimosso l'involucro di plastica, utilizzare le pinzette per posizionare lo stesso numero di stampi in silicone nudo e vetrini di copertura in file alternate sul coperchio di una piastra a 48 pozzetti per il successivo incollaggio al plasma. Dopo che tutti i materiali di coltura cellulare sono stati fabbricati, può iniziare la preparazione del tipo di cellula di interesse per l'incapsulamento dell'idrogel a valle. Dopo aver dissociato le cellule in una sospensione a cellula singola, aliquotare il numero desiderato di cellule in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi, centrifugare le celle a circa 200 x g per tre minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e conservare il pellet su ghiaccio. Risospendere il pellet cellulare in soluzione madre ELP all'80% del volume finale.

Quindi utilizzare una pipetta per miscelare la soluzione in una sospensione omogenea di cellule in ELP. Per il restante 20% del volume finale, aggiungere la soluzione madre di THPC alla sospensione ELP della cella. Pipettare più volte per garantire la formazione di una miscela omogenea, evitando la formazione di bolle d'aria.

Quindi, con un movimento circolare, pipettare la miscela di cellule ELP THPC in ogni stampo in una piastra a 24 pozzetti. Quindi incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo 15 minuti, incubare i campioni a 37 gradi Celsius per altri 15 minuti.

Una volta terminata l'incubazione, aggiungere con cautela 750 microlitri di terreno di coltura cellulare caldo a ciascun pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Lasciare l'idrogel a 37 gradi Celsius per la durata della coltura desiderata. Per prima cosa, aspirare il terreno da ogni pozzetto.

Quindi lavare i pozzetti con un millilitro di DPBS caldo. Al termine del lavaggio, aggiungere 750 microlitri di soluzione di fissaggio a ciascun pozzetto. Quindi, incubare la piastra a 24 pozzetti a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di fissazione da ciascuno dei pozzetti e gettare il fissativo in un contenitore per rifiuti pericolosi. Quindi, aggiungere un millilitro di DPBS al campione e gettare immediatamente il DPBS in un contenitore per rifiuti pericolosi. Successivamente, aggiungere 750 microlitri di soluzione di permeabilizzazione per permeabilizzare il campione per un'ora a temperatura ambiente sul bilanciere a 15 giri al minuto.

Dopo un'ora, aspirare la soluzione di permeabilizzazione e aggiungere 750 microlitri di soluzione bloccante al campione. Lasciare il campione sul bilanciere a temperatura ambiente per tre ore. Quindi diluire gli anticorpi primari desiderati con la soluzione di diluizione degli anticorpi.

Quindi, aggiungere 500 microlitri della soluzione anticorpale a ciascun campione. Incubare i campioni per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, aspirare la soluzione di anticorpi primari, quindi lavare i campioni con PBST per un'ora tre volte a temperatura ambiente a 15 giri al minuto.

Successivamente, diluire gli anticorpi secondari appropriati in cinque milligrammi per millilitro di soluzione madre DAPI per ottenere una concentrazione finale di 2,5 microgrammi per millilitro. Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione a ciascun campione. Quindi, utilizzare un foglio di alluminio per coprire la piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, aspirare la soluzione di anticorpi secondari e lavare i campioni con PBST tre volte ciascuno per 30 minuti a temperatura ambiente su un bilanciere. Quindi, posizionare una goccia di terreno di montaggio rigido sulla superficie di un vetrino e posizionare il campione sul mezzo di montaggio. Infine, utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i campioni al vetrino di copertura per evitare la contaminazione o il movimento del campione.

Qui, l'espressione della proteina bersaglio con l'ELP a lunghezza intera in condizioni controllate è convalidata dalla presenza di bande a 37 kilodalton sia nell'analisi SDS-PAGE che in western blot. Tuttavia, in condizioni non controllate, diverse bande a basso peso molecolare sono visibili anche utilizzando il western blot. Le bande di peso molecolare più basse corrispondono a proteine con meno di quattro ripetizioni di dominio simili all'elastina, indicando che la proteina non è completamente tradotta durante l'espressione.

Questo risultato è comune quando si esegue l'espressione sopra i 32 gradi Celsius. Per variare la concentrazione del ligando adesivo cellulare mantenendo costanti le proprietà meccaniche dell'idrogel, viene regolato il rapporto tra la variante ELP contenente l'adesivo cellulare derivato dalla fibronectina e le sequenze adesive non cellulari. Inoltre, le cellule progenitrici neurali murine sono vitali anche per un periodo di sette giorni se incapsulate in un idrogel al 3% di ELP.

Le cellule vive sono identificate in verde a causa della colorazione AM della calceina, mentre l'omodimero rosso dell'etidio è preferenzialmente assorbito dalle cellule morte. Per convalidare il fenotipo delle cellule staminali progenitrici neurali, l'espressione di marcatori canonici come Sox2 e nestina viene visualizzata anche mediante immunocolorazione quando le cellule sono incapsulate negli idrogel 3D ELP. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere e purificare la proteina simile all'elastina per l'incapsulamento a valle di vari tipi di cellule e, inoltre, studiare il ruolo del microambiente 3D nella modulazione del fenotipo cellulare.