Frazionamento subcellulare dagli esemplari gastrointestinali freschi e surgelati

L'obiettivo del seguente protocollo è quello di generare frazioni subcellulari da campioni gastrointestinali congelati o freschi. Le proteine partecipano a quasi tutte le funzioni biologiche all'interno di una cellula. In qualsiasi variazione vengano estratti in una posizione può portare a uno scenario patogeno.

Alcuni studi trarranno vantaggio dalla valutazione della localizzazione proteica o dovranno invadere una proteina da uno specifico compartimento cellulare. Quindi il frazionamento riproducibile delle proteine intatte è importante in questo senso. I campioni di biopsia intestinale sono recentemente ottenibili durante le procedure endoscopiche e possono essere efficacemente utilizzati per la quantificazione delle proteine o gli studi di immunoprecipitazione.

I campioni intestinali clinici sono una risorsa importante per l'identificazione efficace delle proteine tissutali e specifiche della malattia. Il nome di questo metodo è quello di frazionare il tessuto intestinale umano ottenuto mediante endoscopia in compartimenti nucleari e citoplasmatici per l'analisi della localizzazione di una specifica proteina o di complessi proteici. Questo metodo serve per il frazionamento di entrambi.

In primo luogo, avviene la nostra biosi intestinale congelata. Per la procedura di congelamento dei tessuti, congelare i campioni immediatamente dopo l'estrazione e conservarli in azoto liquido fino al momento dell'uso. È importante mantenere il campione congelato fino all'aggiunta del tampone di omogeneizzazione a freddo.

Per i campioni freschi, trasferire la biopsia in una microprovetta da 1,5 ml e tenerla in ghiaccio fino all'inizio della procedura. I campioni di tessuto congelati sono solitamente attaccati alla parete della crioprovetta e il tessuto può essere rilasciato utilizzando una punta di pipetta sterile prima di essere trasferito in una microprovetta conica da 1,5 mL. Aggiungere 200 mL di tampone uno integrato con DDT e inibitori della fosfatasi e della proteasi alla microprovetta contenente il campione.

Omogeneizzare il campione con un recipiente fino a quando il tessuto non è completamente distrutto e tenerlo in ghiaccio. Incubare il campione su ghiaccio per 10 minuti. Aggiungere 10 ml di detergente all'1% a ciascun campione fino a una concentrazione finale dello 0,05% per distruggere la membrana cellulare.

Incubare su ghiaccio per cinque minuti. Agitare brevemente e centrifugare a 400 g a 4 gradi per due minuti. Rimuovere il surnatante contenente la frazione proteica citoplasmatica e trasferirlo in una provetta pulita.

Non gettare il pellet. Risospendere il pellet in 200 mL di tampone due integrato con DDT e inibitori della fosfatasi e della proteasi. Centrifugare a 400 g per 2 minuti.

Eliminare il surnatante e ripetere la procedura di lavaggio altre due volte. Dopo il terzo lavaggio, risospendere il pellet in 100 mL di tampone due. Agitare energicamente a 4 gradi per 30 minuti.

Centrifugare a 4 gradi alla massima velocità per 10 minuti. Trasferire il surnatante contenente la frazione proteica nucleare in una provetta pulita. Le frazioni citoplasmatiche e nucleari sono ora pronte per la quantificazione e gli esperimenti a valle.

La mucosa intestinale è ricca di diverse proteasi e quindi la degradazione delle proteine deve essere controllata durante l'estrazione al fine di ridurre al minimo la degradazione delle proteine, più inibitori della proteasi dovrebbero essere inclusi nei tamponi di estrazione delle proteine. Inoltre, gli estratti devono essere utilizzati per ulteriori saggi. È essenziale evitare la denaturazione delle proteine o la proteolisi.

Poiché ciò causa una perdita di attività proteica. Come conseguenza dei contatti cellula-cellula e cellula-matrice presenti nei tessuti, è necessario implementare alcune modifiche nei protocolli di estrazione delle proteine abitualmente utilizzati con le colture cellulari. La separazione delle cellule dalla matrice transcellulare senza influire sulla qualità delle proteine è un fattore critico per l'isolamento efficiente delle proteine del tessuto intestinale.

A sinistra, la tabella mostra le concentrazioni proteiche di ciascuna delle frazioni provenienti da campioni di biopsia da 2 ml freschi e congelati. Le concentrazioni sono indicate in microgrammi per microlitro. In questo esperimento, un campione fresco e congelato sono stati frazionati contemporaneamente seguendo il protocollo.

E un Western blot è stato eseguito utilizzando 20 mg di ciascun campione. Per verificare la purezza delle frazioni, HSP90 e Tubulina sono stati utilizzati come controlli citoplasmatici e HDAC1 e H3 come controlli nucleari. Come si può osservare, HSP90 e Tubulina si trovano principalmente nel citoplasma e HDAC1 e H3 nel nucleo con una miscelazione molto residua tra le due frazioni.

Per vedere se il protocollo influisce sulla morte cellulare, abbiamo anche rilevato CASP3. Entrambi i campioni presentano una colorazione molto minima per CASP3, confermando che la procedura non influisce sulla via di morte cellulare anche dopo il congelamento rapido delle biopsie. I campioni congelati utilizzati in questo esperimento provenivano da un individuo con una condizione infiammatoria intestinale e, come previsto, pSTAT1 appare nel citoplasma di questo campione, confermando che le modifiche proteiche vengono mantenute dopo il frazionamento e quindi può essere utilizzato per l'analisi funzionale a valle.

La riproducibilità dei risultati nelle biopsie congelate è mostrata in questa figura. Le frazioni sono pulite con una minima miscelazione di proteine nel compartimento. Le biopsie fresche e congelate possono essere utilizzate allo stesso modo in questi protocolli, con le biopsie congelate che forniscono risultati puliti e riproducibili, come mostrato nelle Figure 1 e 2.

Il protocollo qui descritto è progettato per generare le possibili frazioni proteiche. Tuttavia, una certa variabilità intrinseca all'interno del campione, comprese le dimensioni e lo stato del tessuto, può portare a deviazioni nelle quantità di proteine e nelle quantità di distribuzione nelle frazioni.