Name: In Vivo Elettrofisiologici misurazione del potenziale di azione muscolare composto da arti anteriori in modelli murini di degenerazione del motoneurone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Scopri la misurazione elettrofisiologica in vivo del potenziale d'azione muscolare composto nelle zampe anteriori di modelli murini di degenerazione del motoneurone. Questa tecnica minimamente invasiva consente il rilevamento precoce di degenerazione assonica e demielinizzazione nei nervi periferici.

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Questa ricerca è stata sostenuta da KU Leuven ('Apertura al futuro' e C1), il fondo per le Fiandre di ricerca scientifica (FWO-Vlaanderen), la Fondazione di Latran Thierry, l'Association Belge contre les Maladies neuro-muscolari (ABMM), la distrofia muscolare Associazione (MDA), la e ALS Association e la Liga di ALS (Belgio). PVD tiene un investigatorship senior di FWO-Vlaanderen. RP è stata sostenuta da sovvenzioni dall'Irlanda centrale correttive clinica (CRC) e attualmente è supportata la National University of Ireland (NUI) e il FWO.

Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni standard secondo le linee guida di KU Leuven - Università di Lovanio e le linee guida europee associate (direttiva 2010/63/UE Unione europea, per gli esperimenti sugli animali). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico locale di KU Leuven.
1. anestesia e preparazione animale
<ol><li>Indurre l'anestesia nel topo con inalazione di ossigeno/isoflurano. Utilizzare 4% di isoflurane per l'induzione dell'anestesia e 2-3% per la manutenzione a portata di 2,5 L/min di ossigeno. Regolare la percentuale di isoflurane per il mantenimento dell'anestesia in base alla condizione del mouse, vale a dire, topi piccoli e deboli richiedono meno anestetici. Confermare un'anestesia adeguata per esempio, applicando pressione lieve a hindlimb camminare pad per verificare l'assenza di un riflesso di ritiro di dolore.</li>
	<li>Controllare la temperatura del corpo del mouse utilizzando una piastra di riscaldamento termostatico a 37 ° C per evitare la diminuzione della temperatura corporea durante l'anestesia.</li>
	<li>Montare il mouse con la punta conica per il mantenimento dell'anestesia. Assicurarsi che l'animale abbia sufficiente consegna di ossigeno controllando che la punta conica non blocchi airways e che l'animale sta respirando costantemente.</li>
	<li>Durante la registrazione, controllare se il mouse è sufficientemente anestetizzato osservando la frequenza respiratoria (circa 1 Hz in anestesia) e l'assenza di un riflesso di ritiro su lieve pressione. Aumentare la concentrazione di isoflurane manualmente se l'anestesia non è abbastanza profonda.</li>
	<li>Dopo le misurazioni, lascia il mouse per recuperare sulla piastra riscaldante o nel calore di una lampada a raggi infrarossi fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale, per circa 2-5 min. Fino a quando non ha pienamente recuperato dall'anestesia, non lasciare il mouse automatica e in compagnia di altri topi.</li>
</ol>2. misura di CMAP in Hind - e arti anteriori
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig1.jpg"> Figura 1. Posizionamento degli elettrodi per misurazioni di CMAP. La posizione degli elettrodi è presentata per hind-(A) e arti anteriori (B). Gli elettrodi sono numerati come segue: 1: anodo e 2: catodo gli elettrodi, 3 di stimolazione: elettrodo di registrazione attiva, 4: elettrodo di riferimento e 5: elettrodo di messa a terra. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>Utilizzare gli elettrodi dell'ago 27 G per misurazioni di CMAP hindlimb e zampa anteriore. Vedere la Figura 1 per luoghi raccomandati di posizionamento elettrodi.</li>
	<li>Posizionare gli elettrodi sull'arto posteriore come segue.<ol>
<li>Posizionare il mouse sul tappetino riscaldamento in posizione prona. Estendere l'arto posteriore al ginocchio e allegare la zampa sulla superficie di lavoro con del nastro adesivo (Figura 1A).</li>
		<li>Posizionare gli elettrodi di stimolazione per via sottocutanea su entrambi i lati della tacca sciatic con una distanza di circa 2 cm (1 = anodo e 2 = catodo) tra gli elettrodi. Sollevare la pelle per inserire l'ago perpendicolarmente attraverso la pelle e spingere circa 5 mm dell'ago sotto la pelle senza perforare i muscoli sottostanti.</li>
		<li>Allo stesso modo, posizionare l'elettrodo di registrazione (3) per via sottocutanea allineando il muscolo gastrocnemio. Inserire l'elettrodo di riferimento (4) per via sottocutanea accanto il tendine di Achille in un angolo di 30 gradi e lasciare 2-5 mm dell'ago sotto la pelle. Posizionare l'elettrodo di terra (5) per via sottocutanea laterali del mouse in un modo simile come gli elettrodi di stimolazione, ma la posizione di questo elettrodo non è critica per la misurazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare gli elettrodi sulle zampe anteriori, come segue.<ol>
<li>Posizionare il mouse sul termocuscino nella posizione supina e usare nastro adesivo per estendere entrambe arti anteriori ai lati del corpo (Figura 1B).</li>
		<li>Posizionare gli elettrodi di stimolazione (1 = anodo e 2 = catodo) per via sottocutanea su entrambi i lati dell'arto anteriore per allineare con il nervo del plesso brachiale. Sollevare la pelle per inserire l'ago perpendicolarmente attraverso la pelle e spingere circa 5 mm dell'ago sotto la pelle senza perforare i muscoli sottostanti.</li>
		<li>Posizionare l'elettrodo di registrazione (3) per via sottocutanea in cima il muscolo bicipite brachiale alzando la pelle. Posizionare l'elettrodo di riferimento (4) sui pattini a piedi in profondità di 3 mm con un angolo di 30 gradi. Posizionare l'elettrodo di terra (5) per via sottocutanea laterali del mouse. Nota: Gli elettrodi sono in prossimità di ogni altro in questa configurazione. Impedire gli elettrodi di toccante vicenda come questo distorce la registrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. acquisizione dati
<ol><li>Avviare la stimolazione premendo il pulsante di stimolo ricorrente nell'unità controller e ruotare la manopola del regolatore di intensità per aumentare lo stimolo. Stimolare tutti gli assoni utilizzando 1 impulso/s con durata dello stimolo 0,1 ms. Dal menu a discesa nel software, selezionare la corretta frequenza e la durata.</li>
	<li>Raggiungere gli stimoli supramaximal (5-20 mA; in demielinizzanti condizioni fino a 60 mA), applicare stimoli crescenti girando la manopola del regolatore di intensità fino a quando l'ampiezza della risposta CMAP non cessa di aumentare. Da lì, aumentare ulteriormente lo stimolo del 20% per garantire che l'ampiezza CMAP ha raggiunto la sua risposta massima. Fine la stimolazione premendo nuovamente il pulsante di stimolo ricorrente .</li>
	<li>Utilizzare lo strumento indicatore per indicare i seguenti punti nella registrazione: iniziazione di stimolo, l'inizio della risposta, massimo picco positivo e massimo picco negativo (Figura 2).</li>
	<li>Determinare la latenza (in ms) come un ritardo dalla data di inizio dello stimolo per l'inizio della risposta (Figura 2). Definire l'inizio della risposta come punto più recente dove l'ampiezza comincia ad aumentare. Utilizzare la latenza per valutare il demyelination negli assoni.</li>
	<li>Misurare l'ampiezza (mV) dal massimo negativo a picco positivo massimo (Figura 2). Utilizzare la grandezza dell'ampiezza per correlare il numero degli assoni funzionali.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig2.jpg"> Figura 2. Immagine rappresentativa della risposta CMAP. Una risposta CMAP descrittiva che indica i punti utilizzati per calcolare l'ampiezza e la latenza (A). Latenza è determinato dal ritardo dallo stimolo alla comparsa della risposta CMAP. Ampiezza di picco-picco è misurata dal massimo negativo al massimo picco positivo dell'onda bifasica. Registrazioni rappresentative di un animale sano non transgenica (B) e un animale malato con prolungata latenza e ampiezza ridotta (C). <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="6"><li>Poiché l'esatto posizionamento degli elettrodi può influenzare il valore del risultato della registrazione, sostituire gli elettrodi e misurare il nervo stesso per tre volte con stimolo supramaximal per garantire che la risposta più grande viene ottenuta. Utilizzare la media delle registrazioni.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28700839">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> N Engl J Med. 377 (2), 162-172 (2017).</li>
<li>Prior, R., Van Helleputte, L., Benoy, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+axonal+transport%3A+A+common+pathological+mechanism+in+inherited+and+acquired+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective axonal transport: A common pathological mechanism in inherited and acquired peripheral neuropathies.</a> Neurobiol Dis. , 300-320 (2017).</li>
<li>de Carvalho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrodiagnostic+criteria+for+diagnosis+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Electrodiagnostic criteria for diagnosis of ALS.</a> Clin Neurophysiol. 119 (3), 497-503 (2008).</li>
<li>Krajewski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+dysfunction+and+axonal+degeneration+in+Charcot-Marie-Tooth+disease+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neurological dysfunction and axonal degeneration in Charcot-Marie-Tooth disease type 1A.</a> Brain. 123 (Pt 7), 1516-1527 (2000).</li>
<li>Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+axonal+and+demyelinating+neuropathies%3A+identical+segments+recorded+from+proximal+and+distal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles.</a> Muscle Nerve. 18 (4), 402-408 (1995).</li>
<li>Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+abnormalities+in+P0-deficient+mice+resemble+human+hereditary+neuropathies+linked+to+P0+gene+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations.</a> Muscle Nerve. 19 (8), 946-952 (1996).</li>
<li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Motor+Unit+Number+Estimation+%28MUNE%29+Measuring+Compound+Muscle+Action+Potential+%28CMAP%29+in+Mouse+Hindlimb+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Motor Unit Number Estimation (MUNE) Measuring Compound Muscle Action Potential (CMAP) in Mouse Hindlimb Muscles.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Schulz, A., Walther, C., Morrison, H., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+measurements+on+mouse+sciatic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological measurements on mouse sciatic nerves.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).</li>
<li>Mitchell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+human+wild-type+FUS+causes+progressive+motor+neuron+degeneration+in+an+age-+and+dose-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of human wild-type FUS causes progressive motor neuron degeneration in an age- and dose-dependent fashion.</a> Acta Neuropathol. 125 (2), 273-288 (2013).</li>
<li>Robertson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+new+pmp22+transgenic+mouse+line+with+other+mouse+models+and+human+patients+with+CMT1A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Comparison of a new pmp22 transgenic mouse line with other mouse models and human patients with CMT1A.</a> J Anat. 200 (4), 377-390 (2002).</li>
<li>Huxley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+varying+levels+of+PMP22+expression+and+the+degree+of+demyelination+and+reduction+in+nerve+conduction+velocity+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Correlation between varying levels of PMP22 expression and the degree of demyelination and reduction in nerve conduction velocity in transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 7 (3), 449-458 (1998).</li>
<li>Turner, B. J., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenics%2C+toxicity+and+therapeutics+in+rodent+models+of+mutant+SOD1-mediated+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS.</a> Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).</li>
<li>Manganelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+conduction+velocity+in+CMT1A%3A+what+else+can+we+tell%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Nerve conduction velocity in CMT1A: what else can we tell.</a> Eur J Neurol. 23 (10), 1566-1571 (2016).</li>
<li>Cornett, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Variability+of+Childhood+Charcot-Marie-Tooth+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Variability of Childhood Charcot-Marie-Tooth Disease.</a> JAMA Neurol. 73 (6), 645-651 (2016).</li>
<li>Jacobson, W. C., Gabel, R. H., Brand, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+vs.+fine-wire+electrode+ensemble-averaged+signals+during+gait%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electromyogr+Kinesiol%22%5BJournal%5D)">Surface vs. fine-wire electrode ensemble-averaged signals during gait.</a> J Electromyogr Kinesiol. 5 (1), 37-44 (1995).</li>
<li>Parker, V., Warman Chardon, J., Mills, J., Goldsmith, C., Bourque, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramaximal+Stimulus+Intensity+as+a+Diagnostic+Tool+in+Chronic+Demyelinating+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+J%22%5BJournal%5D)">Supramaximal Stimulus Intensity as a Diagnostic Tool in Chronic Demyelinating Neuropathy.</a> Neurosci J. 2016, 6796270(2016).</li>
<li>Benoy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Improved+HDAC6+Inhibitors+as+Pharmacological+Therapy+for+Axonal+Charcot-Marie-Tooth+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Development of Improved HDAC6 Inhibitors as Pharmacological Therapy for Axonal Charcot-Marie-Tooth Disease.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 417-428 (2017).</li>
<li>Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+caudal+tail+and+sciatic+motor+nerve+conduction+studies+in+adult+mice%3A+technical+aspects+and+normative+data%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data.</a> Muscle Nerve. 41 (6), 850-856 (2010).</li>
<li>Srivastava, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+HSPB1+overexpression+in+neurons+is+sufficient+to+cause+age-related+motor+neuronopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Mutant HSPB1 overexpression in neurons is sufficient to cause age-related motor neuronopathy in mice.</a> Neurobiol Dis. 47 (2), 163-173 (2012).</li>
<li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Biomarkers+in+Spinal+Muscular+Atrophy%3A+Preclinical+Proof+of+Concept%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Biomarkers in Spinal Muscular Atrophy: Preclinical Proof of Concept.</a> Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Metodi di registrazione sensibili sono essenziali per valutare la progressione della malattia e soprattutto l'efficacia di una terapia in modelli animali di malattie neuronali. Determinare il CMAPs è una tecnica elettrofisiologica minimamente invasiva, che è usata ordinariamente nelle cliniche e nelle configurazioni sperimentali per valutare la conduzione del nervo in disordini neuromuscolari e neuropatico3,18. Qui, descriviamo una nuova applicazione per CMAP in topi di registrazione al fine di misurare la conduzione del nervo nel nervo del plesso brachiale dell'arto anteriore. Il metodo proposto permette una valutazione longitudinale più versatile e dettagliata della funzione di un neurone nel topo modelli di neurodegenerazione.
Gli elettrodi dell'ago sono leggermente più invasivi rispetto agli elettrodi anello e soprattutto in studi longitudinali devono prestare attenzione per ridurre al minimo i danni ai tessuti. Uno svantaggio possibile del metodo è ferita risultante da piercing un nervo o del muscolo. Tuttavia, dopo attento posizionamento sottocutaneo di elettrodi, il pregiudizio e la rottura dei muscoli e dei nervi può essere evitate. Contrariamente al metodo usando elettrodi di anello, il metodo presentato qui non richiedono la rasatura del pelo dalle grandi parti del corpo. Di conseguenza, non c'è nessun fastidio o effetto sulla termoregolazione per l'animale.
Il posizionamento degli elettrodi è fondamentale per la registrazione corretta e coerenza delle ampiezze CMAP e latenze. Si consiglia di riposizionare gli elettrodi ed effettuare due o tre misure in ogni sito per confermare che la stimolazione massima e le risposte vengono raggiunti. Le registrazioni corrette dovrebbero produrre curve bifase come dimostrato nella Figura 2. Per standardizzare la metodica, non transgenici senza ferita del nervo sono i migliori modelli per stabilire l'elettrodo corretto e coerenza posizionamento per la stimolazione ottima. Elettrodi ad ago riutilizzabile sono adatti per usi ripetuti se sono regolarmente sterilizzati, per esempio con glutaraldeide per 20 minuti tra gli animali e controllati per la nitidezza.
In topi adulti sani, le ampiezze CMAP, registrate con il metodo proposto sono tipicamente 80-100 mV dopo stimolazione del nervo sciatico e del plesso brachiale. Questo è in particolare più grande le risposte misurate con elettrodi di anello, perché c'è una maggiore impedenza causata dalla pelle per gli elettrodi di anello che produce risultati di 20-40 mV8,19,20. In modelli murini di ALS, le ampiezze CMAP dopo stimolando il nervo sciatico o del plesso brachiale in membra paralizzate diminuiscono a 10-30 mV. La grandezza dell'ampiezza di CMAP è più piccola in animali giovani, poiché l'ampiezza CMAP aumenta durante lo sviluppo21.
Il metodo che descriviamo qui è particolarmente utile in modelli murini di ALS, in cui denervazione e conseguente deficit motori, si verificano in precedenza le zampe posteriori rispetto a arti anteriori13. Oltre a denervazione, il metodo potrebbe rilevare reinnervazione determinato come declino ha impedito o ritardato dell'ampiezza di CMAP. La drammatica diminuzione dell'ampiezza di CMAP nei muscoli delle zampe posteriori già all'età di insorgenza dei sintomi ostacola il follow-up di ulteriore progressione di malattia; come le ampiezze CMAP raggiungono valori molto bassi nella fase iniziale della malattia, non diminuire ulteriormente durante il processo di malattia. Al contrario, la perdita axonal progredisce a un ritmo più lento nel plesso brachiale nervo degli arti anteriori e presenta un'opzione più sensibile per misurare la progressione di malattia nel corso di una durata più lunga della malattia. Inoltre, gli arti anteriori meno degenerati potrebbero fornire un sito più potente per valutare approcci terapeutici che mirano al miglioramento della funzione assonale.
È chiaro che la tecnica presentata fornisce nuove possibilità per la caratterizzazione del mouse modelli di malattie neuromuscolari. Registrazioni di CMAP con elettrodi ad ago dal nervo sciatico ed il plesso brachiale è un metodo rapido e riproducibile per valutare la perdita assonale e demielinizzazione a posteriori-pure come arti anteriori. La sensibilità del metodo consente il rilevamento di axonal deficit anche prima notevole deficit motori possono essere registrate e così permette la quantificazione precoce di questi difetti. Inoltre, la possibilità di prova ripetuta riduce il numero di animali necessari e fornisce una panoramica dettagliata della progressione delle malattie neuromuscolari e neuropatica in siti diversi in un singolo animale.

Elettrofisiologia è utilizzato come strumento diagnostico in disordini neuromuscolari quali disturbi del neurone di motore, plexopathies, neuropatie, disturbi della giunzione neuromuscolare e miopatie. Nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS), in cui sono interessati principalmente i motoneuroni, il danno assonale e di paralisi muscolare1 vengono riflesse in ampiezze di CMAP ridotte su studi di conduzione nervosa (NCS). Nella malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) sia la degenerazione assonale e demielinizzazione può essere stimati in nervi periferici utilizzando NCS2. Questa tecnica può essere utilizzata per confermare la diagnosi anche per valutare la progressione di malattia3,4. NCS consentono la stima della patologia assonale, che viene dedotto dalla grandezza del potenziale d'azione ampiezza5, e nella misura del demyelination - che si traduce in velocità di conduzione ridotta, prolungato gli stati latenti distali, o blocco di conduzione 6.
Misurazione di CMAP è un metodo veloce e sensibile per valutare la conduzione del nervo sia negli esseri umani e topi. Considerando che in pazienti NCS sono effettuati ordinariamente in vari siti di registrare diversi nervi e muscoli, nei topi, le misurazioni di CMAP sono in genere fatto solo per il nervo sciatico valutare la funzionalità del nervo nelle zampe posteriori. Tuttavia, in alcuni studi sugli animali sarebbe vantaggioso a record CMAP sia in anteriori e posteriori, ad esempio, per seguire la progressione di malattia differenziale tra anteriori e posteriori in modelli murini di ALS.
Qui, presentiamo un metodo per la registrazione di CMAPs da arti anteriori dei topi utilizzando elettrodi ad ago. Inoltre, offriamo un approccio per misurare CMAPs da zampe posteriori, allo stesso modo con gli elettrodi ad ago. La misurazione di CMAPs da zampe posteriori con elettrodi di anello è stata presentata precedenti7,8. La registrazione di CMAPs utilizzando elettrodi ad ago è un metodo di misurazione rapido, non richiede la rasatura del pelo e la procedura per la misurazione sia hind - e arti anteriori prende solo 10 min per animale per un ricercatore esperto. Inoltre, questo approccio mini-invasivo è fattibile per misure ripetute consentire il follow-up longitudinale di nervi multipli negli animali.

<table><tbody><tr><td>Elettrodo ad ago sottocutaneo riutilizzabile, Pl/Ir</td><td>Technomed</td><td>TE/S61-434</td><td>L'ago ha una lunghezza di 13 mm (0,51") e un diametro di 0,4 mm (27G)</td></tr><tr><td>Sistema elettrodiagnostico Natus Natus</td><td>Neurology</td><td>UltraPro S100</td><td>Dispositivo EMG</td></tr><tr><td>Synergy</td><td>Natus Neurology</td><td>versione 20.1.0.100</td><td>Software EMG per UltraPro S100</td></tr><tr><td>Physitem Controller</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td>Termoforo</td></tr><tr><td>combi-vet Sistema di anestesia di base Flussometro digitale con TEC 3 Vaporize</td><td>Rothacher & Partner</td><td>CV 30-301-D</td><td>Vaporizzatore e flussometro</td></tr><tr><td>Iso-Vet 1000 mg/g&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare UK Limited</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td>Topi con isoflurano</td></tr><tr><td>SOD1-G93A</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#002726</td><td>ALS tg e non-tg control cucciolate, solo femmine</td></tr><tr><td>Topi PrP-hFUS-WT3</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#017916&nbsp;</td><td>Compagni di cucciolata di controllo ALS tg e non tg, tutti i gruppi bilanciati per maschi e femmine</td></tr><tr><td>Topi C57BL/6Jax</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>Topi non tg per assotomia, maschi e femmine</td></tr><tr><td>C61-PMP22 topi</td><td>linea di topi è stata generosamente donata&nbsp; dal Prof. M. Sereda (The Max Planck Institute of Experimental Medicine, G&ouml; ttingen, Germania).</td><td></td><td>Compagni di cucciolata di controllo CMT tg e non tg, tutti i gruppi bilanciati per maschi e femmine</td></tr></tbody></table>

in vivo elettrofisiologici misurazione del potenziale di azione muscolare composto da arti anteriori in modelli murini di degenerazione del motoneurone

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Valutare la funzionalità dell'assone del nervo fornisce informazioni dettagliate sulla progressione delle malattie neuromuscolari. Le registrazioni elettrofisiologiche forniscono un approccio sensibile per misurare la conduzione del nervo in esseri umani ed i modelli del roditore. Per ampliare le possibilità tecniche per elettromiografia nei topi, la misura dei potenziali d'azione muscolare composto (CMAPs) dal nervo del plesso brachiale in arto anteriore utilizzando elettrodi ad ago è descritta qui. Registrazioni di CMAP dopo stimolando il nervo sciatico in zampe posteriori sono state descritte in precedenza. Il metodo recentemente introdotto qui permette per la valutazione della conducibilità del nervo presso un sito aggiuntivo e quindi fornisce una panoramica più profonda della funzionalità neuromuscolare. La tecnica fornisce informazioni su entrambi il numero relativo di assoni funzionali e il livello di mielinizzazione. Quindi, questo metodo può essere applicato per valutare axonal malattie nonché condizioni demielinizzante. Questo metodo come minimo dilagante non richiede l'estrazione del nervo e quindi è adatto per misure ripetute per follow-up longitudinale dello stesso animale. Simili registrazioni vengono eseguite nella cliniche messe a punto per sottolineare la rilevanza traslazionale del metodo.

Misure elettrofisiologiche di CMAPs utilizzando elettrodi ad ago è un metodo come minimo dilagante e molto sensibile a seguire la funzione neuromuscolare nel corso del tempo. La tecnica descritta qui permette la valutazione della conduzione del nervo forelimb nei topi e così, fornisce la funzionalità del nervo: approfondimenti.
Le ampiezze di CMAP e latenze sono state misurate da hind - e arti anteriori durante il decorso della malattia in due modelli del topo di ALS, SOD1-G93A9 e PrP-hFUS-WT310 (Figura 3) e in un modello murino di CMT, C61-PMP2211,12 (Figura 4). Modelli murini di ALS sono stati creati da sovraespressione dei geni umani ALS-correlate, vale a dire sia mutato SOD1 o selvaggio tipo FUS. In entrambi i modelli, i topi sviluppano ALS simile a degenerazione progressiva del neurone di motore che conduce alla paralisi. Nei controlli littermate non transgenici, l'ampiezza CMAP di hind - e arti anteriori non ha fatto cambiare nel tempo (Figura 3A). D'altra parte, l'ampiezza CMAP del nervo sciatico dall'arto posteriore è stato diminuito drammaticamente nei topi SOD1-G93A, anche prima dell'inizio di sintomo intorno all'età di 60 giorni (considerando che i primi sintomi di motori si osservano solitamente all'età di tre mesi)13 . L'ampiezza era 90 mV a quell'età in non transgenica littermates (non-tg), considerando che in topi SOD1-G93A era solo 30 mV. C'era solo minima ulteriore declino nell'ampiezza come la malattia ha progredito alla tarda fase sintomatica all'età di 150 giorni. Il declino nell'ampiezza CMAP, e quindi la degenerazione degli assoni, era in ritardo nel plesso brachiale nervo degli arti anteriori in confronto il nervo sciatico dalle zampe posteriori. Negli arti anteriori, la progressione di malattia era anche più evidente come il CMAP ampiezza è diminuito da 70 mV a 30 mV quando misurati prima e dopo la manifestazione del deficit motori in questi topi.
Nel modello del topo di PrP-hFUS-WT3 di ALS, l'insorgenza di deficit motori inizia circa all'età di 28 giorni10, che coincide con l'inizio del declino dell'ampiezza di CMAP. Si tratta di un modello di malattia più accelerato come i topi raggiungono stadio finale circa all'età di 65 giorni. Il declino dell'ampiezza di CMAP avvenne più rapidamente nel nervo sciatico del hindlimb in confronto il nervo del plesso brachiale nell'arto anteriore, che indica una degenerazione assonale prima a posteriori (Figura 3D). Questa osservazione sostiene l'osservazione clinica in entrambi questi modelli del mouse come le zampe posteriori sono paralizzati in particolare precedenti a quelle anteriori che rimangono funzionali fino alla fine delle fasi del processo della malattia.
In generale, la latenza da stimolo per l'inizio del potenziale di azione era più breve negli arti anteriori rispetto ai posteriori (Figura 3B, E). Questo è semplicemente dovuto la distanza più breve tra la stimolazione e gli elettrodi di registrazione. La latenza fornisce un'indicazione del livello di mielinizzazione degli assoni. La nostra osservazione è che gli stati latenti CMAP sono prolungati durante la progressione di malattia in modelli murini di ALS, anche se ALS non è una malattia demielinizzante. Questo è molto probabilmente dovuto la perdita di più grande, più veloce lo svolgimento motore assoni.
I topi di C61-PMP22 che overexpressing il 3-4 copie della PMP22 umana ed i topi eterozigoti ricapitolano un fenotipo di malattia CMT1A molto delicato con lieve demielinizzazione e CMAPs ridotta, ma con nessun fenotipo visibile11,12. In 1,5-2 anni di topi di età C61-PMP22, le ampiezze CMAP sono ridotti e gli stati latenti prolungati sia per le zampe posteriori e anteriori (Figura 4). Rappresentante registrazioni visualizzazione ampiezza diminuita e ritardata risposta rispetto ad una registrazione da un individuo sano sono presentate in Figura 2B, rispettivamente. Le latenze CMAP negli arti anteriori non sono interessate tanto quanto negli arti posteriori. Ciò è coerente con i pazienti di CMT1A, come più spesso i pazienti hanno gravemente CMAPs ridotta o non rilevabili nelle membra più basse a causa della natura patofisiologica di CMT come un disordine lunghezza-dipendente14. Inoltre, il grado di gravità della malattia è correlato con ampiezza CMAP, piuttosto che la velocità di latenza o di conduzione, come ampiezze correlano con il grado di integrità axonal14,15. Tuttavia, i risultati indicano che questo metodo è abbastanza sensibile per il rilevamento demielinizzanti processo come quelle osservate in CMT1A.
Variazione in ampiezza e la latenza era più basso nei gruppi non transgenica (coefficiente di variazione 2-15% e 1-13%, rispettivamente). In tutti i casi transgenici, c'era più variazioni nelle misurazioni (coefficiente di variazione per ampiezza 8-51% e % di latenza 1-21), che molto probabilmente sono causato tramite le differenze nella progressione della malattia tra gli animali. In ogni caso, la variazione era simile in hind - e arti anteriori. La variazione nell'uso dell'ago ed elettrodi di superficie è stata segnalata per essere simili16.
Le intensità di stimolo richiesto non variano notevolmente tra non transgenici e modelli di ALS (Figura 3, F). Allo stesso modo, lo stimolo necessario per raggiungere stimolo supramaximal in questi casi era simile per anteriori e posteriori e varia tra 5-12 mA. Nella CMT, il requisito per intensità di stimolo aumentato è stato riconosciuto17 e lo stesso fenotipo è stato visto nei topi C61-PMP22 (Figura 4). Il fenomeno è stato spiegato da una maggiore impedenza elettrica da ipertrofica endoneurial modifiche17.
Per confermare che l'ampiezza CMAP registrata da arti anteriori era dovuto stimolazione del nervo e non la stimolazione muscolare, abbiamo effettuato assotomia parziale unilaterale sul nervo del plesso brachiale in 5 mesi non transgenici C57BL/6Jax topi (maschi e femminili) ( Figura 5). Assotomia ridotto l'ampiezza CMAP da 90 mV a 20 mV, che indica che la maggior parte degli assoni sono stati disconnessi nell'operazione. C'è stato nessun cambiamento nell'ampiezza in arto anteriore controlaterale o le zampe posteriori. Questo risultato indica fortemente che la risposta rilevata nel muscolo bicipite brachiale è stato a causa di stimolazione del nervo e non ha provocato dalla stimolazione muscolare.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig3.jpg"> Figura 3. Modelli murini di ampiezza CMAP, latenza e stimolo richiesto sopra il decorso della malattia in hind - e arti anteriori in ALS. SOD1-G93A (A–C) e PrP-hFUS-WT3 (D–F) animali transgenici (tg) e non transgenici littermates (non-tg) sono stati misurati al momento della comparsa dei sintomi motori, nella fase sintomatica e nella processo di fase tardo-sintomatica della malattia, a età 57, 91 e 147 giorni (d) o a 29, 38 e 53 giorni per topi SOD1-G93A e PrP-hFUS-WT3, rispettivamente. Nero: Hindlimb Non transgenici, nera tratteggiata: arto anteriore non transgenici, grigio: hindlimb transgenici, grigia tratteggiata: forelimb transgenici. I risultati sono presentati come media ± SD. ampiezze (A, D) sono stabili nel tempo negli animali non transgenica in hind - e arti anteriori. Negli animali transgenici, ampiezze in diminuzione durante il processo di malattia. Latenze (B, E) sono stati meno colpiti dalla malattia e sono state osservate differenze principali tra hind - e arti anteriori, indipendentemente dal genotipo. Variazione nello stimolo richiesto (C, F) era minimo in tutti i gruppi. Per SOD1-G93A N = 4 in tutti i gruppi tranne tg d 147, N = 3. Per topi PrP-hFUS-WT3 nelle fasce d'età 29, 38 e 53, N è per non-tg 4, 5 e 4 e per tg 7, 5 e 3, rispettivamente. Simboli indicano la differenza tra gruppi come segue: *: non-tg hindlimb vs tg hindlimb, n.: non-tg forelimb vs forelimb tg, ¤: non-tg hindlimb vs non-tg arto anteriore, grigio *: tg hindlimb vs arto anteriore tg. ANOVA a due vie con Tukey di prova multipla di confronti, *: p &lt; 0,05, * *: p &lt; 0.01, * * *: p &lt; 0,001, * * *: p &lt; 0,0001. n.: p &lt; 0,05, # #: p &lt; 0.01, # # #: p &lt; 0,001, # # # : p &lt; 0,0001. ¤: p &lt; 0,05, ¤ ¤: p &lt; 0.01, ¤: p &lt; 0,001, ¤: p &lt; 0,0001. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig4.jpg"> Figura 4. CMAP ampiezza, la latenza e stimolo necessario a posteriori - e arti anteriori in topi CMT1A. C61-PMP22 transgenici (tg) e non transgenici littermates (non-tg) sono stati misurati a 1,5-2 anni di età. Ampiezza (A) è stata diminuita in hind - e arti anteriori in topi transgenici. Latenza (B) è stata prolungata in tutte le membra nei topi di CMT e anche sottile cambiamento nelle zampe anteriori è stato rilevato con questa misura. Requisito per intensità dello stimolo (C) è stata aumentata di topi C61-PMP22, che ricorda il fenotipo rilevato in pazienti di CMT1A. I risultati sono presentati come media ± deviazione standard, per non-tg N = 4 e tg N = 3. ANOVA a due vie con Sidak di prova multipla di confronti, * *: p &lt; 0.01, * * *: p &lt; 0,0001. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig5.jpg"> Figura 5. I potenziali di azione degli arti anteriori sono causati da stimolo del nervo. Per escludere la possibilità che la risposta osservata di CMAP è stata causata dalla stimolazione muscolare, assotomia (parziale) è stato effettuato sul nervo del plesso brachiale. Ampiezza CMAP (A) e latenza (B) sono stati registrati prima (pre) e 4 giorni dopo (post) l'assotomia del plesso brachiale in topi adulti non transgenica. Assotomia diminuito l'ampiezza CMAP che indica che la risposta è stata a causa di stimolazione del nervo. Nero: hindlimb, grigio: arto anteriore controlaterale, grigia tratteggiata: arto anteriore ipsilateral. Risultati sono presentati come media ± SD, N = 2. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

La misura della conduzione del nervo è un utile strumento per valutare i modelli murini di neurodegenerazione ma è frequentemente applicata solo per stimolare il nervo sciatico nelle zampe posteriori. Qui, descriviamo una tecnica per misurare muscolare composto (CMAP) del potenziale di azione in vivo nei mouse forelimb muscoli innervati dal plesso brachiale.

In Vivo Elettrofisiologici misurazione del potenziale di azione muscolare composto da arti anteriori in modelli murini di degenerazione del motoneurone

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Con questo metodo possiamo stimare la degenerazione degli assoni e la demielinizzazione nei nervi periferici di modelli murini di neurodegenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questo metodo minimamente invasivo è fattibile per misurazioni ripetute, solo una non ha seguito i nervi multipli negli stessi animali. La sensibilità di questo metodo consente il rilevamento precoce della perdita di assoni nella modulazione anche prima che possano essere registrati altri difetti notevoli, consentendo così il rilevamento precoce di questi difetti.Per iniziare questa procedura, anestetizzare il topo con inalazione di ossigeno isoflurano. Confermare un'adeguata anestesia applicando una leggera pressione sul tappetino da passeggio dell'arto posteriore per verificare l'assenza di un riflesso di astinenza dal dolore. Quindi posiziona un cono nasale sul muso dell'animale per mantenere l'anestesia.Assicurarsi che il cono del naso non ostruisca le vie aeree e che l'animale respiri costantemente. Successivamente, mantieni la temperatura corporea dell'animale a 37 gradi Celsius utilizzando una piastra riscaldante termostatica. Per misurare il CMAP sull'arto posteriore, posizionare il mouse in posizione prona.Estendi l'arto posteriore e attacca la zampa sul piano di lavoro utilizzando del nastro adesivo. Quindi posizionare cinque millimetri degli elettrodi stimolanti calibro 27 per via sottocutanea su entrambi i lati del cenno sciatico senza perforare i muscoli sottostanti con due centimetri tra gli elettrodi. Allo stesso modo, posizionare l'elettrodo di registrazione per via sottocutanea sopra e parallelamente al muscolo gastrocnemio.Successivamente, posizionare l'elettrodo di riferimento per via sottocutanea accanto al tendine d'Achille con un angolo di 30 gradi e lasciare da due a cinque millimetri dell'ago sotto la pelle. Posizionare l'elettrodo di terra per via sottocutanea sul lato del topo in modo simile agli elettrodi stimolanti. Per misurare la CMAP sugli arti anteriori, posizionare il mouse sul cuscinetto di direzione in posizione supina e utilizzare del nastro adesivo per estendere entrambi gli arti anteriori ai lati del corpo.Quindi, posizionare cinque millimetri dell'elettrodo stimolante per via sottocutanea senza perforare i muscoli sottostanti su entrambi i lati dell'arto anteriore per allinearsi con il nervo del plesso brachiale. Quindi posizionare l'elettrodo di registrazione per via sottocutanea sopra il muscolo bicipite brachiale. Successivamente, posizionare tre millimetri dell'elettrodo di riferimento con un angolo di 30 gradi sui tappetini da passeggio e inserire l'elettrodo di terra per via sottocutanea sul lato del mouse.Gli elettrodi sono molto vicini l'uno all'altro in questa configurazione. Evitare che gli elettrodi si tocchino l'un l'altro in quanto ciò distorce la registrazione. Stimola tutti gli assoni utilizzando un impulso al secondo con una durata dello stimolo di 0,1 millisecondi.Per acquisire i dati, avviare la stimolazione premendo il pulsante dello stimolo ricorrente nell'unità di controllo e ruotare la manopola del regolatore di intensità per aumentare lo stimolo. Per raggiungere gli stimoli super massimali, applicare stimoli crescenti ruotando la manopola del regolatore di intensità fino a quando l'ampiezza della risposta CMAP cessa di aumentare. Da lì, aumentare ulteriormente lo stimolo del 20% per garantire che l'ampiezza del CMAP abbia raggiunto la sua risposta massima.Terminare la stimolazione premendo nuovamente il pulsante dello stimolo ricorrente. Utilizzare lo strumento marcatore per indicare i punti successivi nella registrazione. Inizio della risposta, picco positivo massimo e picco negativo massimo.L'avvio dello stimolo è determinato automaticamente dal software. Determinare la latenza come ritardo tra l'inizio dello stimolo e l'inizio della risposta. Utilizzare la latenza per valutare la demielinizzazione negli assoni.Misurare l'ampiezza dal picco massimo negativo al massimo positivo e utilizzare l'ampiezza dell'ampiezza per correlare il numero di assoni funzionali. Poiché l'esatto posizionamento degli elettrodi può influenzare il valore di risultato della registrazione, sostituire gli elettrodi e misurare lo stesso nervo per tre volte utilizzando lo stimolo super massimale per garantire che si ottenga la risposta più grande. Usa la media delle registrazioni.Dopo le misurazioni, rimuovere tutti gli elettrodi e lasciare che il mouse si riprenda sulla piastra riscaldante o sotto una lampada a infrarossi per circa due-cinque minuti fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza. Non lasciare il topo incustodito e in compagnia di altri topi fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia. I topi C61 PMP22 sovraesprimono da tre a quattro copie del PMP22 umano e i topi eterozigoti ricapitolano un fenotipo di malattia CMT1A molto lieve con lieve demielinizzazione e CMAP ridotte ma senza fenotipo visibile.A un anno e mezzo o due anni di età dei topi transgenici C61 PMP22 le ampiezze CMAP sono ridotte e le latenze sono prolungate sia negli arti posteriori che in quelli anteriori. L'ampiezza è diminuita sia negli arti posteriori che in quelli anteriori nei topi transgenici e la latenza è stata prolungata in tutti gli arti nei topi transgenici CMT, e con questa misurazione è stato rilevato anche un sottile cambiamento negli arti anteriori. Il fabbisogno di intensità dello stimolo è stato aumentato nei topi C61 PMP22, che assomiglia al fenotipo rilevato nei pazienti CMT1A.Una volta masterizzata, la registrazione CMAP può essere eseguita sia per gli arti posteriori che per quelli anteriori in 15 minuti, se eseguita correttamente. La tecnica presentata offre nuove possibilità per la caratterizzazione di modelli murini di malattie neurodegenerative come la sclerosi latrica amiotrofica e la malattia di Charcot-Marie-Tooth. La valutazione della funzionalità dell'assone nervoso fornisce informazioni dettagliate sulla progressione dei disturbi neuromuscolari.Registrazioni simili vengono utilizzate in contesti clinici, sottolineando il potenziale traslazionale di questo metodo.

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