Name: Lanalisi genetica di ereditario Transthyretin Ala97Ser relative amiloidosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Scopri un protocollo diagnostico per confermare la mutazione Ala97Ser nell'amiloidosi ereditaria da transtiretina usando PCR ed elettroforesi su gel di agarosio. Questo metodo semplice facilita la diagnosi precoce in laboratorio clinico.

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Desideriamo ringraziare Miss Shin-Fun Wu per il suo aiuto negli esperimenti. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dal programma di ricerca medica di Chang Gung (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) e IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.

I test eseguiti in laboratorio è stato effettuato in conformità con i requisiti della clinica laboratorio miglioramento emendamenti (CLIA) del 1988, il regolamento, approvato dal Consiglio di revisione istituzionale di Chang Gung Memorial Hospital e Università (licenza n. 100 - 4470A3 e 104-2462A3). Consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti.
1. raccolta di campioni di sangue
<ol><li>Prelevare il sangue intero in provette EDTA-trattati commercialmente disponibili. Mescolare delicatamente e conservare il campione di sangue a 4 ° C fino al trattamento.</li>
</ol>2. DNA estrazione da sangue periferico
Utilizzare un Kit di estrazione del DNA per l'estrazione del DNA genomico (Vedi Tabella materiali).
<ol><li>Aggiungere 10 mL di soluzione 1 per il campione di sangue di 4,0 mL. Incubare il campione in ghiaccio per 10 min.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 2.000 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere e gettare il surnatante con attenzione. Risospendere il pellet in 3 mL di soluzione 1.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 2.000 x g per 5 min a 4 ° C nuovo ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 3 mL di soluzione 2.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di soluzione madre pronase (225 mg/mL) per ottenere una concentrazione finale di 100 µ g/mL e mescolare bene. Incubare a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Raffreddare il tubo sul ghiaccio per 10 min Aggiungi 0,8 mL di soluzione 3 al campione e capovolgere 3 - 5 volte. Collocare il campione in ghiaccio per 5 min.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 3.000 x g per 15 min a 4 ° C. Trasferire con cautela il surnatante in una provetta sterile conica per centrifuga 15 mL.</li>
	<li>6 µ l di soluzione madre di RNAsi (10 mg/mL) per ottenere una concentrazione finale di 20 µ g/mL. Incubare a 37 ° C per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 mL di alcool isopropilico e mescolare accuratamente capovolgendo più volte per precipitare il DNA (fili di materiale bianco e fioccoso formerà). Utilizzando una pipetta di grosso calibro, trasferire il precipitante di DNA in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugare a 12.000 x g per 3 min a 4 ° C. Gettare il surnatante con attenzione. Pellet di DNA lavare aggiungendo 500 µ l di etanolo al 70%.</li>
	<li>Centrifugare a 12.000 x g per 1 min ed eliminare il surnatante. Asciugare all'aria a pellet di DNA a temperatura ambiente. Aggiungere 100 µ l di ddH2O e incubare a 65 ° C per 15 min risospendere il DNA.</li>
</ol>3. quantificazione del DNA genomica
Utilizzare uno spettrofotometro (Vedi Tabella materiali) per rilevare la quantità e la qualità del DNA genomic.
<ol><li>Accedere al computer collegato alla macchina spettrofotometro. Aprire il software.</li>
	<li>Inizializzare la macchina spettrofotometro:<ol>
<li>Fare clic su "Acido nucleico" sul software spettrofotometro.</li>
		<li>Pulire il piedistallo con una salvietta USA e getta carta e acqua purificata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lo spettrofotometro in bianco:<ol>
<li>Caricare 2 µ l di acqua purificata sul piedistallo.</li>
		<li>Abbassare il braccio superiore dello spettrofotometro e fare clic su "Vuoto" per calibrarlo.</li>
		<li>Quando è fatto, sollevare il braccio superiore e asciugare il piedistallo con un panno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misura il campione:<ol>
<li>Fare clic su tipo di campione "DNA-50".</li>
		<li>Caricare 2 µ l di campione di DNA sul piedistallo.</li>
		<li>Abbassare il braccio superiore e fare clic su "Misura" per misurare il rapporto A260/A280 e la concentrazione del campione.</li>
		<li>Pulire il piedistallo tra ogni esecuzione con un panno e acqua purificata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare clic su "Print Screen" per raccogliere i dati.</li>
</ol>4. genetiche analisi delle mutazioni
Amplificare il DNA dell'obiettivo con la PCR4. Eseguire PCR in una reazione a 25 µ l miscela utilizzando una DNA polimerasi kit (Vedi Tabella materiali). La tabella 1 Mostra il gene TTR intronic primer.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>gene</td>
			<td>Sequenza più superelegante</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon1</td>
			<td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon2</td>
			<td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon3</td>
			<td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon4</td>
			<td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Gli iniettori introniche del gene TTR. (Sequenza di Riferimento NCBI: NC_000018.10)
<ol><li>Aggiungere i reagenti nella tabella 2 in una provetta PCR 0,2 mL.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Componenti</td>
			<td>Volume (µ l)</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x Buffer</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 GC Enhancer</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polimerasi del DNA 360</td>
			<td>0.2</td>
			<td>2 U/reazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (25 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2 mM ogni</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer F (10 µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer R (10 µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA (100 ng)</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua di PCR-grado</td>
			<td>13,8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume totale</td>
			<td>25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2. Condizioni di reazione di PCR.
<ol start="2"><li>Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente su una centrifuga da banco per raccogliere tutti i componenti alla parte inferiore del tubo. Posizionare il tubo in un termociclatore.</li>
	<li>Eseguire PCR per 30 cicli. Ogni ciclo è costituito da una fase di denaturazione per 30 s a 94 ° C, primer di ricottura per 30 s a 58 ° C e l'estensione della polimerasi per 45 s a 72 ° C (Vedi tabella 3).</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Temperatura (° C)</td>
			<td>Tempo</td>
			<td>ciclo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturazione iniziale</td>
			<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturazione del DNA</td>
			<td>94</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 cicli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Punto di ricottura di primer</td>
			<td>58</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 cicli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Passaggio di estensione della polimerasi</td>
			<td>72</td>
			<td>45 s</td>
			<td>30 cicli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo di allungamento post</td>
			<td>72</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fine della PCR in bicicletta</td>
			<td>4</td>
			<td>Tempo indeterminato</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3. Ciclismo condizioni per amplificare i prodotti di PCR.
<ol start="4"><li>Convalidare il prodotto PCR visualizzando con elettroforesi su gel:<ol>
<li>Preparare un gel di agarosio all'1.2%:<ol>
<li>Mescolare 1,2 g di agarosio in polvere con 100 mL di 0.5 x TBE in un fiasco di microwavable. Forno a microonde per 2 minuti fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Raffreddare la miscela di agarosio a 55 ° C.</li>
			<li>Aggiungere 2 µ l di una soluzione di bromuro di etidio (10 mg/mL) alla miscela di agarosio e mescolare delicatamente. Versare il composto di agarosio in un cassetto del gel per circa 5-7 mm, quindi aggiungere il comb(s) luogo. Lasciare solidificare (almeno 30 min) e rimuovere con attenzione comb(s).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Campioni di caricare ed eseguire un gel dell'agarosi:<ol>
<li>Inserire la cella di elettroforesi su gel e vassoio. Riempire la cella di elettroforesi con 0,5 x TBE fino a quando il gel è coperto.</li>
			<li>Accuratamente caricare 2 µ l di una 100 bp DNA ladder (Vedi Tabella materiali) in una corsia del gel come marcatore molecolare. Miscela di tintura/campione di carico (5 µ l di miscela del prodotto di PCR con 1 µ l 6 x caricamento tintura) nelle corsie aggiuntive.</li>
			<li>Accendere l'alimentazione. Esegua il gel per 25 min a 100 V.</li>
			<li>Rimuovere il gel dalla cella elettroforesi. Visualizzare i frammenti di DNA sotto UV luce in un sistema di imaging.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. sequenziamento
<ol><li>Purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit commerciale e commercialmente o con un sequenziatore automatico di sequenza (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Inviare sequenze nucleotidiche al server NCBI BLAST per confrontare la query del nucleotide al nucleotide database10. Dopo i risultati vengono visualizzati, eseguire allineamenti di sequenza e identificare la mutazione prevista.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ci sono due passaggi critici all'interno del protocollo. In primo luogo, al fine di avere un numero sufficiente di cellule bianche del sangue, un esemplare di hemodiluted dovrebbe essere evitato11. In secondo luogo, l'uso appropriati degli iniettori di PCR è fondamentale per ottenere risultati affidabili12. Abbiamo utilizzato lo strumento web di Primer-BLAST per progettare il primer4,13; un minimo di 40 paia di basi...

Amiloidosi da transtiretina (TTR) (ATTR) sono la forma più comune di amiloidosi sistemica1e possono essere causato da una mutazione dominante ereditata autosomal in gene transtiretina (TTR)2. Mutazioni di TTR destabilizzano la struttura della proteina tetramerica e portano alla sua dissociazione nei monomeri che ricompone in fibrille amiloidi2. Più di 100 mutazioni di TTR amiloidogeniche sono stati segnalati in tutto il mondo1. Analisi genetiche con metodi di reazione a catena (PCR) polimerasi confermano la presenza di mutazione di punto TTR e presentano vantaggi tra cui evitare la manipolazione della sonda marcata radioattivamente a rispetto del sud della macchia3. PCR è una tecnica veloce, facile, economico e affidabile che è stata applicata in numerosi campi in scienze moderne4.
La diagnosi precoce di questa malattia progressiva e fatale è impegnativa, data la sua eterogeneità fenotipica. Con l'aumento dell'attenzione e riconoscimento più ampio su manifestazioni iniziali di ATTR, nonché i trattamenti emergenti5, studi diagnostici adatti tra cui test genetico TTR sono quindi criticamente fondamentali per migliorare la prognosi. Inoltre, mutazioni differenti sono associate con diversa penetranza del tratto, l'età di esordio, i modelli di progressione, sopravvivenza mediana, la gravità della malattia e l'efficacia di trapianto del fegato, o TTR stabilizzatori2,6, e gradi variabili di coinvolgimento neurologico e cardiologico, che hanno grandi implicazioni per la consulenza genetica7,8,9. Inoltre, un accurato test genetico è l'unico strumento che differenzia i due tipi distinti di ATTR: ereditaria (mutante) e wild type (forma non mutante, amiloidosi sistemica senile, SSA)7. È indispensabile per confermare i tipi di ATTR, perché le terapie variano ampiamente2. Di conseguenza, c'è una crescente necessità di descrivere il protocollo graduale del test genetico TTR.
L'approccio molecolare per rilevare la mutazione sarà illustrato utilizzando Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan, come esempio. Modifiche in fase di estrazione di DNA ridurre la quantità delle tre soluzioni utilizzate e produce una quantità sufficiente di DNA. In questo protocollo, tutti e quattro gli essoni TTR sono stati analizzati, mentre le regioni tra cui 5' a Monte, 3' a valle, promotori, introni, e regioni non tradotte (UTR) non sono state sequenziate.

<table><tbody><tr><td>Provette trattate con EDTA</td><td></td> Kit di estrazione del DNA BD <td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del DNA</td><td>Stratagen</td><td>200600</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop ND2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Tergicristalli per compiti delicati</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td></td></tr><tr><td>Kit AmpliTaq Gold 360 DNA polimerasi</td><td>Applied Biosystems</td><td>4398823</td><td></td></tr><tr><td>primer intronici genici TTR&nbsp;</td><td>Exon1</td><td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Esone1</td><td>R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon2</td><td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon2</td><td>R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon3</td><td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon3</td><td>R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon4</td><td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon4</td><td>R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td><td></td></tr><tr><td>termociclatore</td><td>Applied Biosystems</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>cella per elettroforesi&nbsp;</td><td>ADVANCE</td><td>Mupid-2plus</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA</td><td>Protech</td><td>PT-M1-100</td><td></td></tr><tr><td>colorante</td><td>BioLabs</td><td>B7021</td><td></td></tr><tr><td>AlphaImager EC</td><td>Alpha Innotech</td><td>AlphaImager EC</td><td></td></tr><tr><td>sequenziatore automatico&nbsp;</td><td>Analizzatore</td><td></td> <td>di DNA Applied Biosystems 3730xl</td></tr></tbody></table>

l'analisi genetica di ereditario transthyretin ala97ser relative amiloidosi

Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis

Test genetici è la prova più affidabile per transthyretin ereditario legate amiloidosi e deve essere eseguita nella maggior parte dei casi di amiloidosi da transtiretina (ATTR). ATTR è una malattia rara ma fatale con fenotipi eterogenei; di conseguenza, la diagnosi a volte è in ritardo. Con l'aumento dell'attenzione e riconoscimento più ampio su manifestazioni iniziali di ATTR, nonché trattamenti emergenti, studi diagnostici appropriati, tra cui la transtiretina (TTR) genetica test, per confermare i tipi e varianti di ATTR sono pertanto fondamentale per migliorare la prognosi. Analisi genetiche con metodi di reazione a catena (PCR) polimerasi confermano la presenza di mutazioni puntiformi TTR molto più rapidamente e più sicuro rispetto ai metodi tradizionali come la macchia del sud. Qui, dimostriamo la conferma genetica della mutazione ATTR Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan. Il protocollo comprende quattro fasi principali: raccolta dei campioni di sangue intero, estrazione del DNA, l'analisi genetica di tutti e quattro gli essoni TTR con PCR e sequenziamento del DNA.

Elettroforesi del gel dell'agarosi di due pazienti e un sano singole bande ha rivelato delle dimensioni previste, tra cui un prodotto PCR di bp 454 per esone 4 del gene TTR (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57743/57743fig1.jpg"> Figura 1 . Elettroforesi del gel raffigurante PCR amplificato gene TTR. Normale: un in...

Qui, presentiamo un protocollo per confermare la presenza di mutazione di punto per la diagnosi di amiloidosi ereditaria da transtiretina, utilizzando Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan, come esempio.

L'analisi genetica di ereditario Transthyretin Ala97Ser relative amiloidosi

Genetic testing is the most reliable test for hereditary transthyretin related amyloidosis and should be performed in most cases of transthyretin ...

Con la crescente attenzione alle manifestazioni precoci dell'amiloidosi da transtiretina e ai trattamenti emergenti, studi appropriati per confermare i tipi e le varianti dell'amiloidosi da transtiretina sono fondamentali per migliorare la prognosi. Il vantaggio principale di questo protocollo è che questo test è fattibile e facile da eseguire nel laboratorio clinico. Per iniziare il protocollo procurarsi un kit per l'estrazione del DNA, aggiungere 10 millilitri di soluzione uno al campione di sangue da 4,0 millilitri ottenuto in precedenza e incubare il campione su ghiaccio per 10 minuti.Dopo l'incubazione, centrifugare il campione a 2000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con cautela e gettare il surnatante. Risospendere il pellet in tre millilitri di soluzione uno.Centrifugare nuovamente il campione a 2000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in tre millilitri di soluzione due.Successivamente, aggiungere 10 microlitri di soluzione madre di pronasi per ottenere una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro e mescolare bene il contenuto. Incubare il DNA a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, raffreddare il tubo con ghiaccio per 10 minuti.Aggiungere 0,8 millilitri di soluzione tre al campione e capovolgerlo da tre a cinque volte. Quindi, posizionare il campione sul ghiaccio per cinque minuti. Centrifugare il campione a 3000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Trasferire con cautela il surnatante in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 millilitri e aggiungere sei microlitri di soluzione madre di RNasi per ottenere una concentrazione finale di 20 microgrammi per millilitro. Incubare il campione, aggiungere 2,5 millilitri di alcol isopropilico alla provetta e capovolgere delicatamente la provetta più volte per far precipitare il DNA che appare come filamenti di materiale flocculante bianco. Con una pipetta di grande diametro, trasferire il precipitato in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.Centrifugare il precipitato a 12.000 g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Eliminare il surnatante con cura. Quindi lavare il pellet di DNA aggiungendo 500 microlitri di etanolo al 70%.Centrifugare il DNA a 12.000 g per un minuto e scartare il surnatante. Asciugare all'aria il pellet di DNA a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di DDH2O e incubare il campione a 65 gradi Celsius per 15 minuti per risospendere il DNA.Eseguire la PCR in una miscela di reazione da 25 microlitri utilizzando un kit di DNA polimerasi. Aggiungere i reagenti in una provetta PCR da 0,2 millilitri. Mescolare delicatamente il contenuto e centrifugarlo brevemente in una centrifuga da banco.Posizionare il tubo in un termociclatore. Eseguire la PCR per 30 cicli con una fase di denaturazione per 30 secondi a 94 gradi Celsius, l'abilitazione del primer per 30 secondi a 58 gradi Celsius e l'estensione della polimerasi per 45 secondi a 72 gradi Celsius. Preparare un gel di agarosio all'1,2% mescolando 1,2 grammi di polvere di agarosio con 100 millilitri di 0,5 XTBE in un pallone adatto al microonde.Microonde la soluzione per due minuti fino a quando l'agarosio non è completamente sciolto. Raffreddare la miscela di agarosio a 55 gradi Celsius. Aggiungere due microlitri di soluzione di bromuro di etidio alla miscela di agarosio e mescolare delicatamente.Versare il composto in una vaschetta per gel a circa cinque-sette millimetri. Quindi, inserire il pettine. Lasciare solidificare il gel per almeno 30 minuti.Dopo che il gel si è solidificato, rimuovere con cura il pettine. Posizionare il gel e il vassoio nella cella di elettroforesi. Riempire la cella di elettroforesi con 0,5 XTBE fino a coprire il gel.Caricare con cautela due microlitri di una scala di DNA da 100 coppie di basi in una corsia del gel come marcatore di dimensioni molecolari. Caricare il colorante e campionare la miscela nelle corsie aggiuntive. Accendi l'alimentatore e fai funzionare il gel per 25 minuti a 100 volt.Rimuovere il gel dalla cella di elettroforesi. Infine, visualizza i frammenti di DNA sotto la luce UV in un sistema di imaging. L'elettroforesi su gel di agarosio di due pazienti e di un individuo sano rivela bande delle dimensioni previste, tra cui un prodotto PCR di 454 coppie di basi per l'esone quattro del gene TTR.I cromatogrammi di sequenza hanno rivelato una sostituzione nucleotidica T per G nell'esone quattro del gene TTR con conseguente mutazione missenso e una sostituzione da alanina a serina in posizione aminoacidica 97 in due pazienti. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come confermare la presenza di mutazioni puntiformi per la diagnosi di amiloidosi ereditaria da transtiretina.

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