Name: CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Scopri come generare mutanti condizionali glmS in Plasmodium falciparum utilizzando l'editing genomico CRISPR/Cas9. Questo metodo facilita lo studio delle funzioni proteiche nel parassita della malaria umana.

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Ringraziamo Muthugapatti Kandasamy presso il nucleo di microscopia biomedica Università della Georgia (UGA) per l'assistenza tecnica e Jose-Juan Lopez-Rubio per aver condiviso i plasmidi pUF1-Cas9 e pL6. Quest'opera è stata sostenuta da archi Foundation Award di D.W.C. e di H.M.K., concede fondi avvio UGA di V.M., sovvenzioni da marzo di Dimes Foundation (Basil o ' Connor Starter Scholar Research Award) di V.M. e US National Institutes of Health (R00AI099156 e R01AI130139) di V.M. e (T32AI060546) a H.M.K.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'implementazione di CRISPR/Cas9 a p. falciparum ha aumentato l'efficienza di sia diminuito la quantità di tempo necessario per la modifica del genoma del parassita, rispetto ai precedenti metodi di manipolazione genetica. Questo protocollo completo vengono delineati i passaggi necessari per la generazione di mutanti condizionali utilizzando CRISPR/Cas9 a p. falciparum. Mentre il metodo qui è orientato in modo specifico per la generazione di ettari -glmS mutanti, questa strategia può essere ada...

La malaria è una malattia devastante causata da protozoi parassiti del genere Plasmodium. P. falciparum, il parassita della malaria umana mortale la maggior parte, provoca circa 445.000 morti all'anno, principalmente in bambini sotto l'età di cinque1. Parassiti del plasmodio hanno un ciclo di vita intricato che coinvolgono un vettore zanzara e un ospite vertebrato. Gli esseri umani in primo luogo essere infettati quando una zanzara infetta prende un pasto di sangue. Quindi, il parassita invade il fegato dove cresce, si sviluppa e si divide per circa una settimana. Dopo questo processo, i parassiti vengono rilasciati nel flusso sanguigno, dove subiscono asessuale replica in globuli rossi (RBCs). Crescita dei parassiti all'interno di globuli rossi sono direttamente responsabili per i sintomi clinici associati con la malaria2.
Fino a poco tempo, produzione di transgenici da p. falciparum era un processo laborioso, che coinvolge diverse fasi di selezione della droga che ha preso molti mesi e aveva un alto tasso di fallimento. Questa procedura richiede molto tempo relieson la generazione di casuale del DNA si rompe nella regione di interesse e la capacità endogena del parassita per riparare il suo genoma però riparazione omologa3,4,5,6 . Recentemente, l'editing genomico cluster regolarmente intervallate palindromi Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) è stato correttamente utilizzato in falciparum del p.7,8. L'introduzione di questa nuova tecnologia nella ricerca sulla malaria è stato fondamentale per far progredire la comprensione della biologia di questi parassiti Plasmodium mortale. CRISPR/Cas9 permette di targeting specifico di geni attraverso guida RNAs (gRNAs) che è omologo al gene di interesse. Il gRNA/Cas9 complesso riconosce il gene attraverso il gRNA e Cas9 introduce quindi una rotture a doppio filamento, costringendo l'iniziazione dei meccanismi di riparazione nell'organismo9,10. P. falciparum manca il macchinario per riparare le rotture del DNA attraverso unirsi non-omologo fine, si utilizza meccanismi di ricombinazione omologa e integra modelli del DNA omologhe trasfettate per riparare il Cas9/gRNA-indotta rotture a doppio filamento11,12.
Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di mutanti condizionali atterramento in p. falciparum usando CRISPR/Cas9 editing genomico. Il protocollo viene illustrato l'utilizzo del ribozima glmS ai livelli della proteina in modo condizionale atterramento di PfHsp70x (PF3D7_0831700), uno chaperon esportati da p. falciparum in host RBCs13,14. Il ribozima glmS viene attivato dal trattamento con glucosamina (che viene convertito in glucosamina-6-fosfato in cellule) per fendere il suo mRNA associato, che conduce ad una riduzione della proteina14. Questo protocollo può essere facilmente adattato per utilizzare altri strumenti di atterramento condizionale, ad esempio domini di destabilizzazione o RNA aptameri4,5,15. I nostri dettagli del protocollo la generazione di un plasmide di riparazione che consiste di un ribozima emoagglutinina (HA) di tag e glmS sequenza fiancheggiato da sequenze di codificazione che sono omologhi al PfHsp70x open reading frame (ORF) e 3'-UTR. Inoltre descriviamo la generazione di un plasmide seconda espressione di unità del gRNA. Questi due plasmidi, insieme a un terzo che spinge espressione di Cas9, sono trasfettati in RBCs e utilizzati per modificare il genoma del p. falciparum parassiti. Infine, descriviamo una reazione a catena della polimerasi (PCR)-tecnica per verificare l'integrazione del ribozima tag e glmS basata. Questo protocollo è altamente adattabile per la modifica o la completa eliminazione di eventuali geni di p. falciparum , aumentando la nostra capacità di generare nuove intuizioni riguardanti la biologia del parassita della malaria.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>Compriamo quelli che sono confezionati singolarmente</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>Regalo da Akhil Vaidya lab</td><td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parassitolo. 2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali TPP a 6 pozzetti</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali TPP da 100 mm (piastra da 12 mL)</td><td>Piastre per</td><td></td> colture tissutali MIDSCI TP93100 <td></td></tr><tr><td>TPP a 96 pozzetti</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali TPP a 24 pozzetti</td><td>MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0157L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td>#R3131L</tr><tr><td>T4 DNA Polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Unità di filtro per flacone Steritop</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td>Puoi utilizzare qualsiasi dimensione che si adatti alle tue esigenze</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>pMK-U6</td><td>Generato dal Muralidharan Lab</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pHA-glmS</td><td>Generato dal Muralidharan Lab</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pUF1-Cas9</td><td>Dono dal laboratorio Jose-Juan Lopez-Rubio</td><td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ipoxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>Reagente gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Timidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr><td>PL6-eGFP BSD</td><td>Generato dal Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td><td>Generato dal Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td></tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N/A</td><td>Ti consigliamo di provare alcuni lotti per scoprire in cosa cresceranno i parassiti nel miglior</td></tr><tr>campo<td>di globuli rossi umani</td><td>Interstate Blood Bank, Inc</td><td>Invia un'e-mail o chiamali direttamente per ordinare</td><td>Di solito utilizziamo</td></tr> la <tr><td>linea di parassiti O+ blood 3D7</td><td>Disponibile su richiesta</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di lisogenia (LB)</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>Puoi fare il tuo, non è necessario utilizzare esattamente questo</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>Facciamo un brodo 1000X a 100 mg / ml in acqua e immagazziniamo nel -20C</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EF1alpha</td><td>Dr. Daniel Goldberg's Lab</td><td>Washington University a St. Louis</td><td>È possibile utilizzare il controllo di caricamento preferito per i western blot. Questo è solo quello che usiamo nel nostro laboratorio</td></tr><tr><td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonale</td><td>Prodotto da Roche, venduto da Sigma</td><td>11867423001</td><td>Puoi usare il tuo anticorpo anti-HA preferito</td></tr><tr><td>Provette da 0,6 mL</td><td>Fisher</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Fisher HealthCare* PROTOCOLLO* Hema 3* Sistema di colorazione manuale (Fissativo+Soluzione I e II)</td><td>Fisher</td><td>22-122-911</td><td>Puoi anche usare il colorante</td></tr> <tr><td>giemsaVetrini per microscopio smerigliati di alta qualità Fisherfines - Dimensioni: 3 x 1 in.</td><td>Pescatore</td><td>12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 gene editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di malaria umana da p. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

La malaria è una causa significativa della morbosità e della mortalità in tutto il mondo. Questa malattia, che colpisce soprattutto coloro che vivono nelle regioni tropicali e subtropicali, è causata da infezione con parassiti del plasmodio . Lo sviluppo di farmaci più efficaci per combattere la malaria può essere accelerato da migliorare la nostra comprensione della biologia di questo parassita complesso. Manipolazione genetica di questi parassiti è la chiave per comprendere la loro biologia; Tuttavia, il genoma del p. falciparum è storicamente difficile da manipolare. Recentemente, è stato utilizzato CRISPR/Cas9 editing genomico in parassiti della malaria, consentendo per la proteina più semplice tagging, generazione di atterramenti proteina condizionale e delezione dei geni. L'editing genomico CRISPR/Cas9 ha dimostrato di essere un potente strumento per far progredire il campo della ricerca sulla malaria. Qui, descriviamo un metodo CRISPR/Cas9 per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in p. falciparum. Questo metodo è altamente adattabile ad altri tipi di manipolazioni genetiche, tra cui proteine tagging e knockout del gene.

Uno schema dei plasmidi utilizzati in questo metodo, così come un esempio di una mutazione di scudo sono mostrati nella Figura 1. Come un esempio di come identificare parassiti mutanti dopo trasfezione, risultati da PCRs per controllo integrazione del costruttoglmS ettari - sono riportati in Figura 2. Un'immagine rappresentativa di una piastra di clonazione è illustrata nella Figura 3 per di...

Descriviamo un metodo per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in Plasmodium falciparum utilizzando CRISPR/Cas9 editing genomico.

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nella biologia del parassita della malaria umana, P.Falciparum, aiutando a scoprire la funzione proteica attraverso il knockdown condizionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette una generazione relativamente facile di mutanti condizionali rispetto ai metodi precedenti. Per iniziare, vai a Chop Chop e seleziona Fasta Target'Under Target, incolla le 200 coppie di basi dalle tre estremità principali del frame di lettura aperto di un gene e 200 coppie di basi dall'inizio dei tre UTR primi del gene.In In'select P.Falciparum' e selezionare CRISPR/Cas9'under Using'Next, fare clic su Trova siti di destinazione'Selezionare una sequenza di gRNA tra le opzioni presentate, privilegiando il gRNA più efficiente più vicino al sito di modifica e con il minor numero di siti fuori destinazione. Acquista la sequenza di gRNA e il suo complemento inverso come oligo purificato di elettroforesi in gel di poliacrilammide. La sequenza di gRNA utilizzata per colpire PfH-sp70x può essere trovata nel protocollo di testo.Aggiungere 40 microgrammi ciascuno di DNA pMK-U6, pUF1-Cas9 e pHA-glmS in un tubo di centrifuga sterile da 1,5

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Genetica

Sono mostrati i dettagli su come mappare QTL con una mappa genetica basata su una sequenza intero di genoma può essere utilizzata per identificare un gene di resistenza alla droga in Toxoplasma gondii e come questo può essere verificato con il sistema CRISPR / Cas9 che modifica in modo efficiente un obiettivo genomico, in questo caso il Gene di resistenza alla droga.

Mapping QTL e modifica CRISPR / Cas9 per identificare un gene di resistenza alla droga in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Qui, descriviamo un protocollo per introdurre un knockout genico nell'amastigote extracellulare di Trypanosoma cruzi, usando il sistema CRISPR/Cas9. Il fenotipo della crescita può essere seguito sia dal conteggio cellulare della coltura degli amastigote axenico, sia dalla proliferazione degli amastigoti intracellulari dopo l'invasione delle cellule ospiti.

Presentazione di un Gene Knockout direttamente nello stadio Amastigote di Trypanosoma cruzi Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 è sempre più utilizzato per caratterizzare la funzione genica in organismi non modello. Questo protocollo descrive come generare linee knock-out di Culex pipiens, dalla preparazione di miscele di iniezione, all'ottenimento e all'iniezione di embrioni di zanzara, nonché come allevare, incrociare e schermare le zanzare iniettate e la loro progenie per le mutazioni desiderate.

Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9

Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi della mutagenesi mirata CRISPR/Cas9 nelle mosche della sabbia: raccolta, iniezione, allevamento e identificazione degli insetti, nonché selezione di mutazioni di interesse.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi

L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire l'editing CRISPR/Cas9 senza soluzione di continuità del genoma di C. elegans utilizzando complessi di ribonucleoproteine assemblati e il marcatore co-CRISPR dpy-10 per lo screening. Questo protocollo può essere utilizzato per apportare una varietà di modificazioni genetiche in C. elegans tra cui inserzioni, delezioni, sostituzioni geniche e sostituzioni codone.

CRISPR/Cas9 Editing del gene C. elegans rbm-3.2 utilizzando il marcatore di screening dpy-10 Co-CRISPR e complessi di ribonucleoproteine assemblati.

Il protocollo descrive come ottenere modifiche dirette al sito nel genoma delle zanzare Anopheles malaria utilizzando il sistema φC31 . Le modifiche descritte includono sia l'integrazione che lo scambio di cassette transgeniche nel genoma di linee di attP..

Integrazione mediata dal sito φC31 e scambio di cassette in Anopheles Vettori della malaria

Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per la rapida identificazione degli indel indotti da CRISPR / Cas9 e la selezione delle linee mutanti nella zanzara Aedes aegypti utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione.

Rilevamento Indel a seguito della mutagenesi CRISPR/Cas9 mediante analisi della fusione ad alta risoluzione nell'aegittito di Mosquito Aedes

Questo protocollo descrive come eseguire un efficiente editing della base adenina senza limitazioni PAM per costruire un modello preciso di malattia del pesce zebra utilizzando zSpRY-ABE8e.

Editing di base efficiente senza PAM per la modellazione del pesce zebra di malattie genetiche umane con zSpRY-ABE8e

La genetica chimica prevede la sostituzione di un residuo gatekeeper con un amminoacido contenente una catena laterale diversa nel locus bersaglio. Qui, abbiamo generato un parassita mutante contenente un allele ipomorfico di cdpk1 e identificato le vie compensatorie adottate dal parassita nel background mutante.

Comprensione dello sviluppo di vie compensatorie in un parassita mutante della malaria che ospita allele ipomorfico di chinasi simili alle piante

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'editing del genoma attraverso la microiniezione embrionale nella zanzara A. aegypti utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9.

Editing del genoma nella zanzara della febbre gialla Aedes aegypti utilizzando CRISPR-Cas9

Scopri come generare mutanti condizionali glmS in Plasmodium falciparum utilizzando l'editing genomico CRISPR/Cas9. Questo metodo facilita lo studio delle funzioni proteiche nel parassita della malaria umana.

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

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