Misurazione dei livelli di esercizio in Drosophila melanogaster utilizzando il sistema di quantificazione esercizio rotanti (Rich)
27 maggio 2018
La rotazione esercitare quantificazione sistema (Rich) può indurre esercizio in Drosophila melanogaster attraverso rotazione misurando contemporaneamente la quantità di attività svolta dagli animali. Qui, presentiamo un protocollo punto-per-punto dettagliare come misurare i livelli di attività degli animali vivendo rotazionale esercizio trattamenti utilizzando il reqs
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'esercizio, ad esempio in che modo la risposta all'esercizio differisce per animali di età diverse e quali percorsi genetici controllano la risposta all'esercizio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai ricercatori, per la prima volta, di misurare l'attività nei moscerini che eseguono esercizi indotti dalla rotazione in tempo reale. A dimostrare la procedura sarà Louis Patrick Watanabe, uno studente laureato del mio laboratorio.
Prima dell'esperimento pianificato, impostare incroci di mosche maschi e femmine in modo che ogni progenie controllata possa essere raccolta per l'esperimento. Per iniziare, caricare otto provette di vetro con 10 mosche di prova anestetizzate per fiala. Un gruppo sperimentale standard è costituito da 10 fiale di 10 mosche di ciascun sesso.
Per caricare le fiale nel REQS, inserire la fiala in una fessura del monitor di attività dalla parte anteriore. Quindi, mettere il secondo tappo sulla fiala e centrare la fiala, spostando l'O-ring secondo necessità. Alloggiare i REQS in un incubatore per condizioni ambientali controllate.
Lasciare che gli animali si riprendano dall'anestesia per un'ora in questa incubatrice prima di procedere. Per saggi di durata superiore a otto ore, possono essere utilizzati flaconi contenenti alimenti fissati in modo molto sicuro a un'estremità della provetta. Dopo il periodo di acclimatazione, accendere il dispositivo per avviare le rotazioni.
Regolare la velocità alla velocità desiderata, ad esempio quattro giri/min. Nessun tubo deve entrare in contatto con la superficie inferiore se è posizionato correttamente. Per un test tipico, è sufficiente avviare il software e registrare l'attività per il tempo desiderato, ad esempio per due ore quando si utilizzano fiale senza cibo.
All'avvio, il software salva automaticamente i dati in un file di testo. Nel software, una spia di connessione verde indica che il software sta raccogliendo dati. La frequenza di registrazione può essere regolata nella scheda Preferenze.
In genere, vengono utilizzati intervalli di cinque minuti. Durante il test, non aprire l'incubatrice, poiché gli animali sono molto sensibili a qualsiasi disturbo e possono rispondere con un aumento dell'attività. Al termine del test, terminare la raccolta dei dati chiudendo il software, quindi spegnere il REQS e ispezionare le provette.
Prendere nota di eventuali decessi avvenuti durante il regime di esercizio. In generale, quattro giri/min per due ore non sono letali per le varietà sane. Infine, scaricare le fiale anestetizzando le mosche con anidride carbonica.
Il file di dati può essere analizzato con qualsiasi pacchetto statistico. Se ci sono punti temporali in cui viene registrato un punteggio di attività pari a zero per tutte le posizioni, allora c'è stato un taglio nella connessione durante questi punti temporali. Se si verificano interruzioni, stabilizzare i collegamenti che portano alla presa telefonica rotante utilizzando del nastro adesivo.
Quattro linee di drosofila geneticamente distinte sono state analizzate con il REQS utilizzando il protocollo descritto. Ogni gruppo era composto da 100 mosche suddivise in 10 fiale. L'attività media è stata calcolata in contenitori di cinque minuti nell'arco del saggio di due ore, condotto a quattro RPM.
L'attività media di esercizio fisico tra tutti e quattro i genotipi era significativamente diversa, tuttavia, non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra i moscerini vergini maschi e femmine vergini, quindi i loro dati sono presentati insieme in questa analisi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della genetica dell'esercizio per esplorare varie risposte all'esercizio in drosophila melanogaster e hanno studiato l'impatto dell'esercizio sul comportamento e sulla fisiologia animale. Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'analisi della composizione corporea, i test da sforzo e i test di forma fisica, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande riguardanti l'impatto dei trattamenti di esercizio sugli animali.
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Panoramica
Il sistema di quantificazione dell'esercizio rotazionale (REQS) consente di indurre esercizio in Drosophila melanogaster mediante rotazione, misurandone contemporaneamente i livelli di attività. Questo protocollo descrive un approccio dettagliato per valutare l'attività di moscerini sottoposti a trattamenti di esercizio rotazionale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dell'esercizio
- Analisi comportamentale
- Trasduzione del segnale genetico
Sfondo
- Comprensione della risposta all'esercizio in diversi gruppi di età.
- Indagine dei percorsi genetici che influenzano la risposta all'esercizio.
- Misurazione in tempo reale dell'attività delle mosche durante l'esercizio.
- Utilizzo del REQS per allestimenti sperimentali.
Scopo dello studio
- Misurare i livelli di attività in Drosophila durante l'esercizio rotazionale.
- Esplorare come la risposta all'esercizio varia con l'età e la genetica.
- Fornire un protocollo che i ricercatori possano replicare per riprodurre lo studio.
Metodi Utilizzati
- Impostazione di incroci tra maschi e femmine di Drosophila.
- Caricamento di provette di vetro con moscerini anestetizzati.
- Gruppo sperimentale standard costituito da più fiale di moscerini.
- Monitoraggio in tempo reale dell'attività durante l'esercizio rotazionale.
Risultati principali
- Induzione efficace dell'esercizio in Drosophila mediante REQS.
- Raccolta in tempo reale dei dati sui livelli di attività delle mosche.
- Informazioni sulle differenze legate all'età nella risposta all'esercizio.
- Identificazione di vie genetiche che influenzano il comportamento legato all'esercizio.
Conclusioni
- Il REQS è uno strumento prezioso per lo studio della biologia dell'esercizio in Drosophila.
- La misurazione in tempo reale migliora la comprensione delle risposte all'esercizio.
- La ricerca futura può basarsi su questa metodologia per esplorare le influenze genetiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione dell'attività indotta dall'esercizio in Drosophila melanogaster mediante l'utilizzo del Sistema di Quantificazione dell'Esercizio Rotante (REQS) consente una misurazione precisa di fenotipi comportamentali rilevanti per studi genetici e fisiologici. Questa capacità supporta la validazione precoce degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nei percorsi di scoperta focalizzati sulla biologia dell'esercizio, sulla regolazione metabolica e sulla genetica del comportamento. Gli output standardizzati e quantitativi del REQS facilitano il confronto tra diverse linee genetiche e condizioni sperimentali, migliorando la capacità predittiva della ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dei percorsi genetici e fisiologici alla base della risposta all'esercizio in un modello facilmente studiabile.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli quantificando le variazioni di attività tra diversi genotipi, sessi e variabili sperimentali.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico fornendo dati comportamentali quantitativi in tempo reale.
- Migliora l'affidabilità predittiva per studi successivi standardizzando l'esposizione all'esercizio tra i diversi gruppi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara saggi comportamentali validati e riproducibili per lo screening di composti o fattori genetici in Drosophila.
- Fornisce dati quantitativi sull'attività risolti nel tempo, adatti per analisi ad alto rendimento.
- Consente la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi tra diverse prove sperimentali e gruppi di ricerca.
- Supporta lo screening scalabile di modificatori dell'attività indotta dall'esercizio fisico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i fenotipi rilevanti per la malattia, come la regolazione del metabolismo e la risposta allo stress, quando supportato da saggi successivi.
- Garantisce continuità dalla scoperta genetica alla validazione preclinica in organismi modello.
- Consente decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, chiarificando le relazioni genotipo-fenotipo.
- Supporta una riduzione predittiva del rischio nello sviluppo di biomarcatori traslazionali quando integrato con ulteriori endpoint.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo REQS si integra nel percorso iniziale della scoperta, creando un collegamento tra manipolazione genetica, fenotipizzazione comportamentale e sviluppo di modelli preclinici in ambito della biologia dell'esercizio e settori affini.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici quantificando l'attività indotta dall'esercizio in diversi contesti genetici.
- Screening: Fornisce output comportamentali pronti per saggi, riproducibili, per la valutazione di composti o modificatori genetici.
- Analisi: Genera dati quantitativi sull'attività suddivisi in intervalli temporali per confronti statistici robusti tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Permette l'allineamento con endpoint rilevanti per le malattie quando abbinata a saggi fisiologici o biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e riutilizzabile per la fenotipizzazione comportamentale nei portafogli di ricerca su Drosophila.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione precoce dei bersagli.
- Valore operativo: Fornisce saggi comportamentali standardizzati, riproducibili e scalabili per l'uso condiviso tra diversi team.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza del capitale chiarificando le relazioni genotipo-fenotipo.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione e un avanzamento dei bersagli genetici o farmacologici adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella gestione di Drosophila, nella progettazione di saggi comportamentali e nell'analisi statistica.
- Necessita dell'accesso allo strumento REQS, a un software compatibile per il monitoraggio dell'attività e a condizioni ambientali controllate.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i parametri del saggio e i flussi di analisi dei dati.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse ceppi di moscerini, età o variabili sperimentali.
- Le limitazioni potenziali includono la sensibilità ai disturbi ambientali e la necessità di una connessione dati affidabile.
