Name: Formazione di Biofilm orali su differenti materiali per impianti dentali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Scopri la formazione di biofilm orali su titanio e zirconia per impianti dentali. Questo metodo utilizza microscopia avanzata per analizzare la viabilità batterica e le caratteristiche morfologiche.

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Gli autori ringraziano José Augusto Maulin dal laboratorio di microscopia Multiuser (scuola di medicina di Ribeirão Preto) per la sua generosa assistenza con EDS e SEM analisi e Hermano Teixeira Machado per la sua generosa assistenza tecnica nell'edizione dei video.

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della facoltà di odontoiatria di Ribeirão Preto, e il partecipante volontario firmato il consenso scritto (processo 2011.1.371.583).
1. di biofilm in Situ
<ol><li>
Selezione dei partecipanti
	<ol>
<li>Selezionare i pazienti sulla base dei seguenti criteri di inclusione: un individuo sano con una dentatura completa e nessun segni clinici delle malattie orali.</li>
		<li>Escludere i pazienti sulla base dei seguenti criteri di esclusione: gravidanza, allattamento, carie dentale, una malattia parodontale o trattamento antibiotico in ultimi 3 mesi, fumatore o qualsiasi malattia sistemica che poteva influenzare lo stato parodontale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del dispositivo intraorale
	<ol>
<li>Registrare l'arco mascellare mediante un'impressione di alginato.</li>
		<li>Preparare tipo IV pietra aggiungendo 19 mL di acqua per 100 g di polvere di pietra. Versare la pietra nello stampo alginato per fare un modello dell'arco mascellare.</li>
		<li>Progettare e fabbricare un dispositivo intraoral acrilico per supportare i provini (dischi in ceramica e titanio).<ol>
<li>Fabbricare ritentive fermagli da filo NiCr (0,7 mm di diametro) utilizzando pinze ortodontiche #139 e la loro posizione sul modello. Per posizionare la pinza tra i molari superiori, piegare un'estremità di ogni filo in modo che formano un ciclo.<ol>
<li>Adattare il ciclo regione della papilla interdentale. Nella zona occlusale, inserire una delicata curvatura per non interferire con i punti di contatto e con l'occlusione. Rendere un 90° piega all'estremità del morsetto per una ritenzione in acrilico.</li>
				<li>Per montare il morsetto nel secondo molare superiore, adattare la curvatura del filo nel terzo cervicale (vestibolare) di contorno del dente (distale) e fare un 90° piegare all'estremità del morsetto per una ritenzione in acrilico. Nota: Al fine di fornire un'adeguata conservazione/stabilità al dispositivo intraorale, i ganci ritentivi sono stati posizionati tra i premolari superiori e funzione distale del secondo molare su entrambi i lati dell'arcata dentale.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Manipolare la resina acrilica autopolimerizzante secondo le istruzioni del produttore e premere la resina acrilica tra 2 lastre di vetro (con un distanziatore di spessore di 3 mm interposto) durante la fase plastica, per fare un foglio di spessore di 3 mm.</li>
			<li>Stendere il foglio acrilico sulla regione palatale del modello, secondo il disegno del dispositivo e tagliare l'eccedenza della resina acrilica con un carver, prima della polimerizzazione.</li>
			<li>Fabbricare i dischi di cera utilizzando una matrice metallica [10 mm di diametro, 2 mm di spessore (superficie di 78,5 mm2)] posizionando la cera fusa nella matrice e aspettando la cera per solidificare. Manualmente è possibile incorporare 4 dischi di cera in resina acrilica, 2 di loro tra i premolari e gli altri 2 accanto ai secondi molari.</li>
			<li>Lasciare che la resina acrilica polimerizzare in una pentola a pressione sotto 20 psi di aria compressa per 20 min.</li>
			<li>Finire il dispositivo intraorale con un manipolo di laboratorio dentale elettrico e cutter e lucidare con gomma abrasiva.</li>
			<li>Regolare il dispositivo per una misura adeguata in bocca utilizzando le apparecchiature descritte sopra.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione dei campioni di titanio e zirconio Nota: I campioni (n = 14) sono 10 mm di diametro e 2 mm di spessore e hanno una superficie di 78,5 mm2.<ol>
<li>Lucidare superfici degli esemplari con carte abrasive raffreddato ad acqua decrescente di abrasività (600, 1200 e 2000 grana), per circa 20 min. Nota: La lucidatura degli esemplari è stata effettuata per standardizzare la rugosità a 0,2 µm.</li>
		<li>Pulire e disinfettare i campioni e dispositivo intraorale con detersivo liquido e acqua di rubinetto e quindi utilizzare un bagno ad ultrasuoni di alcol isopropilico per 15 min. asciugarli con carta assorbente.</li>
		<li>Difficoltà gli esemplari nel dispositivo orale intraorale con circa 0,1 mL di adesivo non tossico hot melt (Figura 1).</li>
		<li>Installare il dispositivo contenente i campioni nella cavità orale. Nota: Il dispositivo intraorale contenente i campioni dovrebbe essere indossato per 48 h. Il dispositivo è stato rimosso e memorizzato in tampone fosfato salino (PBS), mentre il paziente era mangiare e l'esecuzione di pulizia orale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. valutazione di attuabilità batterica
Nota: Il campione dimensione n = 10.
<ol><li>Preparare una soluzione di tintura con l'aggiunta di 3 µ l di SYTO9 (verde colorante fluorescente dell'acido nucleico) e 3 µ l di ioduro di propidio (tintura fluorescente rosso dell'acido nucleico) a 1 mL di sterile di acqua distillata. Nota: Preparare soluzioni al riparo dalla luce.</li>
	<li>Trasferire gli esemplari di una piastra a 24 pozzetti e lavarli accuratamente con PBS per rimuovere eventuali cellule non aderenti.</li>
	<li>Aggiungere il volume appropriato (1 mL) di soluzione colorante fluorescente per coprire il campione contenente biofilm. Aggiungere il colorante con molta attenzione per non disorganizzare il biofilm.</li>
	<li>Incubare il campione per 20-30 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Lavare delicatamente il campione di biofilm con acqua distillata sterile per rimuovere qualsiasi colorante in eccesso.</li>
	<li>Mettere il preparato in un piatto fondo di vetro ed eseguire laser di multiphoton microscopia per l'analisi di biofilm. Nota: L'analisi della redditività delle cellule batteriche è stato effettuato utilizzando un sistema di microscopia multifotonica. La fluorescenza di ioduro di propidio è stata rilevata utilizzando un filtro con una lunghezza d'onda di eccitazione/emissione di 546/680 nm e 477/600 nm per SYTO9. La dimensione delle immagini ottenute è stata 5.16188 x 5.16188 mm, che corrisponde al 26,64 mm2 di superficie totale di ogni campione (78,5 mm2) o 33.94% dell'area totale. Le immagini sono state fatte dalla parte più centrale del campione, con una risoluzione di 1.024 x 1.024 pixel. Il canale rosso e canale verde immagini sono state analizzate separatamente utilizzando Fiji software31. Ogni cella è stata selezionata utilizzando uno strumento di selezione e l'intensità della fluorescenza è stata misurata attraverso la densità integrata dei pixel, sottraendo l'immagine di sfondo.</li>
</ol>3. analisi della composizione chimica dei campioni di spettroscopia dispersiva di energia (EDS)
Nota: Il campione dimensione n = 3.
<ol><li>Selezionare 3 esemplari di ogni materiale di prova gratuita di biofilm e valutare la composizione chimica in 2 aree diverse di ciascun campione utilizzando un microscopio elettronico a scansione accoppiato ad uno spettrometro a dispersione di energia, con una tensione di fascio di elettroni di 10 kV32.</li>
</ol>4. morfologico del Biofilm batterico di microscopia elettronica a scansione
Nota: Il campione dimensione n = 1.
<ol><li>Difficoltà il biofilm immergendo gli esemplari in glutaraldeide al 2,5%, diluito in tampone cacodilato 0.1 M sodio, pH 7.0-7.3, per 24 h.</li>
	<li>Lavare il campione in tampone PBS (pH = 7.6).</li>
	<li>Postfix il biofilm con tetrossido di osmio 1% per 1 h.</li>
	<li>Lavare il campione in tampone PBS (pH = 7.6).</li>
	<li>Disidratare i campioni di biofilm con cura, tenendoli immersi in aumento delle concentrazioni di soluzioni di etanolo (50%, 70%, 90%, 95% e 100%). Nota: Eseguire 3 scambi di etanolo ad una concentrazione di 100%. Il passo di disidratazione totale impiegano circa 2 ore.</li>
	<li>Trasferire gli esemplari al punto critico asciugacapelli e fare diverse sostituzioni con anidride carbonica (CO2) fino a quando gli esemplari sono asciutti.</li>
	<li>Rimuovere i campioni essiccati dall'apparecchio e montarli sui possessori di microscopio elettronico a scansione.</li>
	<li>Sputter-cappotto uno strato di 20 nm di oro sulla superficie del provino per 120 s.</li>
	<li>Inserire i dischi rivestito in oro nella camera di microscopio elettronico a scansione. Ottenere immagini da 5 diverse aree di ogni esemplare, a 20-30 kV sotto pressione variabile e a 650 X ingrandimento12.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto in questo studio è stato sviluppato per valutare la formazione di biofilm su materiali di titanio e ossido di zirconio per pilastri protesici, compresa l'analisi di attuabilità delle cellule batteriche e caratteristiche morfologiche. Per ottenere questo risultato, è stato progettato un modello di in situ di formazione del biofilm, che consiste di un dispositivo intraorale in grado di ospitare campioni di prova materiali e tenerli esposta all'ambiente orale dinamico per 48 h. Il dispositiv...

Biofilm batterici sono complesse, funzionalmente e strutturalmente organizzato comunità microbiche, caratterizzato da una diversità di specie microbiche che sintetizzano un polimero extracellulare, biologicamente attivo matrix1,2. L'adesione batterica alle superfici di tipo biotiche o abiotiche è preceduto da una formazione della pellicola acquisita, costituita principalmente da glicoproteine salivari1,3,4. Deboli interazioni fisico-chimiche tra i microrganismi e la pellicola sono inizialmente stabilite e seguite da forti interazioni tra adesine batteriche e recettori glicoproteici della pellicola acquisita. Diversità microbica aumenta gradualmente attraverso la coaggregation dei colonizzatori secondarie ai recettori dei batteri già associate, formando una comunità multispecifica1,3,4, 5.
Omeostasi del microbiota orale e il suo rapporto simbiotico con l'host è importante nel mantenimento della salute orale. La disbiosi all'interno del biofilm orale possono aumentare il rischio per lo sviluppo di carie e malattia parodontale2,5. Gli studi clinici dimostrano una relazione di causa-effetto tra l'accumulo del biofilm su denti o impianti dentali e lo sviluppo di gengivite o peri-implantare mucosite6,7. La progressione del processo infiammatorio porta alla perimplantite e la conseguente perdita dell' impianto8.
Impianti dentali e loro componenti protesici sono inclini a colonizzazione batterica e la formazione di biofilm9. L'uso di materiali con una composizione chimica e la topografia di superficie che fornisce bassa adesione microbica può ridurre la prevalenza e la progressione di malattie perimplantari9,10. Il titanio è il materiale più utilizzato per la fabbricazione di pilastri protesici per protesi; Tuttavia, i materiali ceramici sono stati recentemente introdotti e stanno guadagnando popolarità come alternativa al titanio a causa della loro proprietà estetiche e biocompatibilità11,12. Inoltre importante, materiali ceramici sono stati associati con un potenziale presumibilmente ridotto ad aderire ai microrganismi, principalmente a causa di loro rugosità superficiale, bagnabilità ed energia libera di superficie10,13.
Studi in vitro hanno contribuito a progressi significativi nella comprensione dell'adesione microbica al moncone protesico superfici9,14,15,16,17. Tuttavia, l'ambiente dinamico della cavità orale, caratterizzata dalla sua temperatura variabile e il pH e la disponibilità di nutrienti, oltre che dalla presenza di forze di taglio, non è riproducibile in vitro protocolli sperimentali18, 19. Per ovviare a questo problema, un'alternativa è l'utilizzo di modelli in situ di formazione del biofilm, che vantaggiosamente conserva la sua struttura tridimensionale per ex vivo analisi10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
L'analisi della complessa struttura del biofilm formata su substrati orale richiede l'utilizzo di tecniche di microscopia in grado di visualizzare otticamente densa materia25. Microscopia a scansione laser di Multiphoton è una moderna opzione per biofilm analisi strutturale26. È caratterizzato dall'uso di ottica non lineare con una fonte di illuminazione vicino alla lunghezza d'onda infrarossa, pulsato a femtosecondi27. Questo metodo è indicato per l'acquisizione di immagini di autofluorescence materiali o segnato da fluorofori, oltre alle immagini generate da segnali ottici non-lineari, derivati da un fenomeno noto come generazione di seconda armonica. Tra i vantaggi della microscopia multifotonica sono la profondità di grande immagine ottenuta con danno minimo delle cellule causato dall'intensità della luce di eccitazione27.
Per un'analisi di attuabilità del biofilm su superfici abiotiche da microscopia multifotonica, l'uso di acido nucleico fluorescente tinture con differenti caratteristiche spettrali e una capacità di penetrazione nelle cellule batteriche è richiesto28. Fluorophores SYTO9 (verde-fluorescente) e ioduro di propidio (rosso fluorescente) può essere utilizzati per una differenziazione visiva tra batteri vivi e morti28,29,30. Ioduro di propidio penetra soli batteri con membrane danneggiate, mentre SYTO9 entra nelle cellule batteriche con una membrana intatta e compromessa. Quando entrambi i coloranti sono presenti all'interno di una cella, ioduro di propidio sposta SYTO9, contrassegnandolo rosso28,30e ha una maggiore affinità per gli acidi nucleici.
In considerazione l'ambiente orale complessità e oral biofilm eterogeneità, microscopia sono necessarie tecniche che consentono l'analisi di biofilm delle superfici dei denti e materiali dentali. Questo articolo descrive una serie di protocolli implementati per confrontare la formazione di biofilm orali su titanio e materiali ceramici per pilastri protesici, come pure i metodi coinvolti nelle analisi di biofilm orale a livello morfologico e cellulare.

<table><tbody><tr><td>Hydrogum 5</td><td>Zhermack Dental</td><td>C302070</td><td></td></tr><tr><td>Durone IV</td><td>Dentsply</td><td>17130500002</td><td></td></tr><tr><td>filo NiCr</td><td>Morelli</td><td>55.01.070</td><td></td></tr><tr><td>JET acrilico autopolimerizzante</td><td>Cl&aacute; ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera dentale&nbsp;</td><td>Cl&aacute; ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentola a pressione&nbsp;</td><td>Essencedental</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carte abrasive grana 600</td><td>NORTON</td><td>T216</td><td></td></tr><tr><td>Carte abrasive grana 1200</td><td>NORTON</td><td>T401</td><td></td></tr><tr><td>Carte abrasive grana 2000</td><td>Lucidatrice metallografica NORTON</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Arotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo hot melt</td><td>TECSIL</td><td>PAH M20017</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE/DEAD Kit di vitalità per biofilm</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 10 &; L</td><td>KASVI</td><td>K8-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 1.000 &; L</td><td>KASVI</td><td>K8-1000B&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti&nbsp;</td><td>KASVI</td><td>K12-024</td><td></td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver microscopio invertito</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon vision ii laser</td><td>Obiettivo coerente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Olio DIC</td><td>ZEISS</td><td>440452-9903-000</td><td></td></tr><tr><td>Sensori SDD - X-Max 20mm&sup2;</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di glutaraldeide</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di cacodilato di sodio&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>97068&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S9638 Utilizzato</td><td>per la preparazione di soluzione salina tamponata con fosfato</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9791&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>1.06404</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto per analisi EMSURE</td><td>MERK</td><td>1.00983</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Essiccatore a punti critici</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JSM-6610 Series Microscopio elettronico a scansione</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD 050 Sputter Coater</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formazione di biofilm orali su differenti materiali per impianti dentali

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Impianti dentali e loro componenti protesici sono inclini a colonizzazione batterica e la formazione di biofilm. L'utilizzo di materiali che fornisce bassa adesione microbica può ridurre la prevalenza e la progressione di malattie perimplantari. In considerazione l'ambiente orale complessità e oral biofilm eterogeneità, microscopia sono necessarie tecniche che consentono un'analisi di biofilm delle superfici dei denti e materiali dentali. Questo articolo descrive una serie di protocolli implementati per confrontare la formazione di biofilm orali su titanio e materiali ceramici per pilastri protesici, come pure i metodi coinvolti nelle analisi di biofilm orale a livello morfologico e cellulare. Il modello in situ per valutare la formazione di biofilm orali su materiali di titanio e ossido di zirconio per i pilastri di protesi dentale come descritto in questo studio fornisce una buona conservazione del biofilm 48h, dimostrando in tal modo adeguatezza metodologica. La microscopia multifotonica permette l'analisi di un rappresentante di zona del biofilm formato sui materiali di prova. Inoltre, l'uso di fluorofori e l'elaborazione delle immagini usando la microscopia multifotonica permette l'analisi della redditività batterica in una popolazione molto eterogenea di microrganismi. La preparazione di campioni biologici per microscopia elettronica promuove la conservazione strutturale del biofilm, immagini con una buona risoluzione e senza artefatti.

La densità di colonizzazione del biofilm dopo 48 h di crescita in situ è stata rappresentata in questo studio la percentuale dell'area colonizzata sui dischi rispetto alla superficie totale digitalizzata del campione usando microscopia multifotonica (titanio e zirconio 26.64 mm2). Figura 2 rappresenta la densità di colonizzazione batterica sulla superficie dei 3 materiali testati. Una maggiore densità del biofilm è stata osservata sulle su...

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione di biofilm orali su materiali di titanio e ossido di zirconio per i pilastri di protesi dentarie, compresa l'analisi di attuabilità delle cellule batteriche e caratteristiche morfologiche. Un modello in situ associato con tecniche di microscopia potente viene utilizzato per l'analisi di biofilm orale.

Formazione di Biofilm orali su differenti materiali per impianti dentali

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Formazione orale di biofilm su diversi materiali per impianti dentali. I biofilm batterici sono comunità microbiche complesse, funzionalmente e strutturalmente organizzate, caratterizzate da una diversità di specie microbiche che sintetizzano una matrice polimerica extracellulare biologicamente attiva. Gli impianti dentali e i loro componenti protesici sono soggetti a colonizzazione batterica e formazione di biofilm.L'uso di materiali con composizione chimica e topografia superficiale che forniscono una bassa adesione microbica può ridurre la prevalenza e la progressione delle malattie perimplantari. In considerazione della complessità generale dell'ambiente e dell'eterogeneità del biofilm orale, sono necessarie tecniche microscopiche che possano consentire l'analisi strutturale del biofilm dai denti e dalle superfici del materiale dentale. Questo articolo descrive una serie di protocolli implementati per confrontare la formazione di biofilm orale su diversi materiali per impianti dentali.I passaggi coinvolti nell'utilizzo della formazione del biofilm in questo studio sono stati i seguenti: Registrare l'arco mascellare per mezzo di un'impronta di alginato. Versare l'impronta di alginato con pietra di tipo IV per fabbricare un modello di arco mascellare. Fabbricare clip di ritenzione di filo micro cromato e posizionarle sul modello.Manipolare la resina acrilica autopolimerizzante secondo le istruzioni del produttore e premere la resina acrilica tra due lastre di vetro durante la fase di plastica per ottenere una lastra di tre millimetri di spessore. Posare il foglio acrilico sulla regione palatale del modello, secondo il design del dispositivo, e tagliare la resina acrilica in eccesso prima della polimerizzazione. Fabbricare dischi di cera utilizzando una matrice con 10 millimetri di diametro e due millimetri di spessore.Incorporare quattro dischi di cera nella resina acrilica, due dei quali tra i premolari e gli altri due accanto ai secondi molari. Lascia che la resina acrilica polimerizzi in una pentola a pressione sotto 20 libbre di aria compressa per 20 minuti. Rifinire il dispositivo intraorale utilizzando un manipolo elettrico e punti di fresatura e lucidatura.Lucidare le superfici del campione con carta vetrata raffreddata ad acqua di abrasività decrescente. Pulire i campioni con detersivo liquido e acqua di rubinetto e bagno ad ultrasuoni con alcol isopropilico per 15 minuti. Quindi, asciugare con carta assorbente.Fissare i campioni nel dispositivo intraorale con adesivo hot-melt atossico. Installare il dispositivo contenente i campioni nella cavità orale. Il dispositivo intraorale contenente i campioni deve essere indossato per 48 ore.Preparare una soluzione di tintura aggiungendo tre microlitri di SYTO 9 e tre microlitri di ioduro di propidio a un millilitro di acqua distillata sterile. Trasferire i campioni in una piastra a 24 pozzetti e lavare accuratamente con PBS per rimuovere le cellule non aderenti. Aggiungere il volume appropriato di soluzione colorante fluorescente per coprire il campione contenente biofilm.Aggiungi il colorante con molta attenzione per non disorganizzare il biofilm. Incubare il campione per 20-30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Lavare delicatamente il campione di biofilm con acqua distillata sterile per rimuovere il colorante in eccesso.Posizionare il campione in una capsula con fondo di vetro per l'analisi del biofilm, utilizzando la microscopia a scansione laser multifotone. La dimensione delle immagini ottenute è stata di 5,16 x 5,16 mm che corrisponde a 26,64 millimetri quadrati dell'area totale di ciascun esemplare o al 33,94% dell'area totale. Le immagini sono state analizzate utilizzando il software Fiji.Ogni cella è stata selezionata utilizzando lo strumento di selezione e l'intensità della fluorescenza è stata misurata attraverso la densità integrata dei pixel, sottraendo lo sfondo dell'immagine. Selezionare tre campioni di ciascun materiale di prova e valutare la composizione chimica in due diverse aree di ciascun campione, utilizzando un microscopio elettronico a scansione accoppiato a uno spettrometro di energia dispersiva. Fissare il biofilm immergendo i campioni in 2,5% di glutaraldeide diluita in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M per 24 ore.Lavare in tampone PBS. Post-fissare con tetrossido di osmio all'1% per un'ora. Lavare in tampone PBS.Disidratare accuratamente i campioni di biofilm, mantenendoli immersi in concentrazioni crescenti di soluzioni di etanolo. Trasferire i campioni nell'essiccatoio per punti critici ed effettuare diverse sostituzioni con anidride carbonica fino a quando i campioni non sono asciutti. Rimuovere i campioni essiccati dall'apparecchio e montarli sui supporti del microscopio elettronico a scansione.Disperdere un rivestimento di 20 nanometri di strato d'oro sulle superfici del campione per 120 secondi. La densità di colonizzazione del biofilm dopo 48 ore di crescita in situ è stata rappresentata in questo studio dalla proporzione dell'area colonizzata rispetto ai dischi di titanio e zirconia in relazione all'area totale scansionata del campione utilizzando la microscopia multifotonica. La figura mostra i batteri aderenti alle superfici dei materiali di prova.Una maggiore densità di biofilm è stata osservata sulle superfici dei dischi in titanio fusi e lavorati rispetto ai dischi in zirconia. Questa figura mostra batteri vivi e morti aderiti alla superficie dei campioni. In questo protocollo, lo ioduro di propidio tinto con acido nucleico penetra solo nei batteri con membrana danneggiata e quindi emette un segnale fluorescente rosso correlato alle cellule morte.SYTO 9 penetra nelle cellule batteriche con membrana intatta o compromessa ed emette un segnale fluorescente verde da microrganismi vivi. La vitalità batterica cellulare era simile tra i materiali di prova con predominanza di microrganismi vivi in tutti i gruppi. Crepe, scanalature o difetti di abrasione prodotti durante il processo di lucidatura e/o lavorazione erano presenti sulla superficie dei diversi materiali analizzati.Nei dischi di Zirconia sono state osservate ampie aree con assenza di microrganismi e presenza di piccoli aggregati microbici polimorfici costituiti principalmente da cocchi e bacilli e batteri filamentosi. La presenza di cocchi e bacilli era sparsa sulle superfici dei dischi di titanio lavorati. I campioni di titanio colato presentavano colonie di microrganismi coinvolti in una matrice con aspetto simile a un biofilm sulla superficie.Sulla superficie dei dischi di zirconia è stato osservato meno materiale della matrice, rispetto ai dischi in titanio lavorato e in titanio fuso. L'analisi EDS ha rivelato nei dischi di zirconia il 70,83% di zirconia. Nei dischi in titanio fuso, 95,16 di titanio e nei dischi in titanio lavorato, 89,86% di titanio.Il protocollo descritto in questo studio ha fornito una conservazione soddisfacente del biofilm di 48 ore, dimostrando quindi l'adeguatezza metodologica. L'uso di sorgenti al fluoro e l'elaborazione delle immagini mediante microscopia multi-fotone hanno permesso l'analisi dell'integrità batterica in una popolazione molto eterogenea di microrganismi provenienti da un'area rappresentativa di questo campione con un danno cellulare minimo. La preparazione di campioni biologici per la microscopia elettronica ha promosso la conservazione strutturale del biofilm, che ha portato a un'immagine con una buona risoluzione e senza artefatti.Ciò ha permesso la visualizzazione e la caratterizzazione morfologica dei microrganismi aderiti.

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