Name: Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Impara i metodi per coltivare Stentor coeruleus e indurre la rigenerazione cellulare mediante frammentazione e trattamento con saccarosio. Questo protocollo consente di studiare la biologia cellulare a livello di singola cellula.

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Questo lavoro è stato supportato da NIH grant R01 GM113602 (WFM) e NSF 1144247 (AL). Riconosciamo che Mark Slabodnick e Natalie Kirkland per sviluppare le versioni iniziali di alcuni di questi protocolli e le discussioni ben informative. Ringraziamo Karina Perlaza e Greyson Lewis per lettura critica del manoscritto.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Coltura Stentor presenta una serie di sfide. In primo luogo, per eseguire esperimenti che richiedono un numero elevato di cellule, uno ha bisogno di mantenere un gran numero di culture Stentor , come culture diventare malsane quando Stentor concentrazione supera 20 cellule/mL. In secondo luogo, gli organismi che possono contaminare Stentor culture spesso dividono più veloce di Stentor e sopraffare la cultura (un agente inquinante comune è rotiferi). Pertanto, è necessario controllare periodicamente la cultura sotto un microscopio e rimuovere i contaminanti. Occasionalmente, una nuova cultura deve essere avviato da un piccolo numero di cellule salvato manualmente da una cultura contaminata. Questo aumenta il tempo necessario per mantenere sano Stentor culture. In terzo luogo, espandendo una singola cella in una cultura di 400 mL richiede almeno un mese perché Stentor ciclo cellulare è 3-5 giorni. In quarto luogo, a differenza di altri modello ciliati, Stentor raramente andare in forma cistica ed essi non possono essere congelati.
Un aspetto importante della coltura Stentor è la selezione di un organismo di alimentazione adeguata. Precedentemente sono stati descritti vari metodi per la coltivazione Stentor . Uno di loro suggerisce di utilizzare latte scremato ai batteri di cultura che alimentano poi Stentor. Tale tecnica è efficace in coltura Stentor; Tuttavia, l'applicazione di tecniche genomiche richiede campioni puri per evitare confusione derivanti dalla genomiche letture da organismi non definito cibo. Utilizzando il protocollo attuale, Stentor può essere coltivata in massa e, perché il loro cibo, Chlamydomonas, è stato sequenziato, la presenza di contaminazione genomico dall'organismo dell'alimento possa essere rilevata e controllata per. Per ragioni sconosciute, tartaro dovuto ricostituire le sue scorte di ritornare dove trovò Stentor prima. Con il protocollo attuale, siamo stati in grado di mantenere Stentor per anni.
Esperimenti di rigenerazione con Stentor sono generalmente semplici, ma ci sono alcuni dettagli critici da tenere a mente. Per quanto riguarda la sezione 2, taglio Stentor cellule a metà possono essere masterizzate in pochi minuti. Mastering più avanzate procedure di microchirurgia di Stentor possono richiedere una settimana di pratica. Mentre effettuando un trattamento di saccarosio o urea (sezione 3), se all'inizio dell'imaging la maggior parte delle cellule hanno ancora loro bande membranellar, aumentare il tempo di incubazione di 10-30 s per quando saccarosio trattamento viene eseguito successivamente. Non aumentare il tempo di trattamento di saccarosio di là di incubazione 3 min perché il risultato sarà la morte delle cellule.
Imaging di Stentor rigenerazione richiede metodi di grandi cellule di immagine per lunghi periodi di tempo. Il metodo di imaging dettagliato nella sezione 4 è utilizzabile solo con un microscopio dritto. Se invece è disponibile un microscopio invertito, cellule posizionabile su una diapositiva o un vetrino coprioggetti in piccole camere. Un metodo è quello di creare una camera fuori di vaselina e coprire con un altro vetrino coprioggetto per evitare l'evaporazione. In alternativa, una camera per una singola cella può essere fatto facendo un buco con un punzone di foro della dimensione desiderata in un 1 x 1 cm2 quadrati di distanziatore di silicio (tabella materiali), posizionare il distanziale su un vetrino coprioggetti, mettendo le cellule nella camera e che copre la camera con un altro vetrino coprioggetti. Quando imaging, se Stentor non sono con l'orientamento corretto per osservare le caratteristiche di ogni fase di rigenerazione, picchiettare con decisione per rendere il contratto di cella. Guarda la cella estendere per identificare la fase di rigenerazione (estensione completa richiede circa 45 s). Se la cella è ancora nell'orientamento sbagliato, ripetere il tapping. Le immagini mostrate nella Figura 1 e Figura 6 sono state scattate da un microscopio stereo zoom; Tuttavia, tutti gli esperimenti dettagliati possono essere eseguiti utilizzando un 5 X stereo microscopio per dissezione.
Un'altra sfida oltre a coltura e imaging Stentor è il monitoraggio della rigenerazione, in particolare la quantità di tempo necessario per identificare le fasi. Se la cella rigenerante è perfettamente orientata con la regione del primordio orale chiaramente visibile, identificazione della fase richiede pochi secondi. A volte, tuttavia, la cella Stentor è in un orientamento prevenzione chiara assegnazione della fase di rigenerazione, tenendo così più tempo per identificare. La notevole quantità di tempo necessario alla fase di singole celle rigenerante potrebbero ritardare la quantificazione di tutte le cellule rigenerante, diminuendo così la precisione temporale della messa in scena e che richiedono l'osservatore ad aspettare e ricreare l'immagine la cella dopo esso ha spostato a un nuovo orientamento. Di conseguenza, questo esperimento è sia di tempo che di alta intensità di manodopera. Per questi motivi, sarebbe altamente auspicabile sviluppare metodi automatici per la rilevazione di cellule Stentor e assegnazione fasi di rigenerazione in dati video microscopia. Questi consentirebbe anche per ulteriori esperimenti riproducibili, aumenta la dimensione del campione e la rimozione dei pregiudizi umani.
L'emersione dei metodi altamente sensibili di genomica e proteomica ha cominciato a mettere gli studi delle singole cellule in reach. Per tali analisi unicellulare, il formato gigante di una cella Stentor rende auspicabile cavia per esperimenti di proof-of-concept. Per tali esperimenti essere possibili, coltura Stentor è fondamentale, e quindi i metodi descritti qui dovrebbero giocare un ruolo in ulteriore sviluppo delle tecniche più avanzate di cella singola.

Le cellule non sono semplici sacchetti di enzimi, ma piuttosto altamente complesse macchine i cui componenti sono accuratamente adattate alla dimensione corretta e disposti in posizioni ben definite. La morfogenesi delle cellule individuali rappresenta un processo chiave nella cellula e biologia dello sviluppo, ma il suo meccanismo molecolare è sconosciuto1,2. Mentre alcune cellule coltivate assomigliano a BLOB, organismi unicellulari possono estremamente complicato architetture, esemplificati dal complessi corticali modelli visti nelle ciliati3,4.
Forse l'esempio più estremo di una cellula altamente strutturata è Stentor coeruleus, un gigante heterotrichous ciliato in tiepidi Tetrahymena e Paramecium . Stentor è lungo 1 mm ed è coperto con più di 100 strisce longitudinali di pigmento blu alternate a righe di ciglia organizzato da stack in parallelo dei nastri dei microtubuli che corrono la lunghezza dell'intera cella. La cella è a forma di tromba (Figura 1), con una banda di membranellar e un apparato orale (OA) alle sue estremità anteriore e un peduncolo che si collega il cellulare al substrato alla sua estremità posteriore. Oltre la polarità chiaro antero-posteriore, la cella indica un distintivo patterning chirali, tale che la spaziatura tra righe ciliare gradualmente aumenta in senso orario. Questo si traduce in una discontinuità dove la riga più stretta incontra la riga più ampia e questa regione della superficie delle cellule, noto come il locus di contrasto striscia, può indurre la formazione del secondo set di strutture di estremità anteriore quando si innesta su un'altra cella5, rendendola formalmente equivalente all'organizzatore di Spemann. Così, tutti i processi chiave della biologia dello sviluppo hanno loro analoghi in Stentor: axiation, formazione di pattern e induzione. In un embrione, questi processi sono guidati da differenze di destino fra le diverse cellule, ma in Stentor, essi devono essere guidati da differenze di destino tra le diverse regioni all'interno di una singola cella. Ciò che definisce le differenze tra le regioni all'interno di Stentor è un mistero.
Se qualsiasi parte di Stentor è tagliato fuori, il pezzo mancante della cella può rigenerare per produrre una cellula normale in una questione di ore. Se una cella è tagliato a metà, o anche a pezzetti molto piccoli, ogni pezzo riorganizza in una cella di aspetto normale, ma più piccola e ripristina la proporzionalità tra cella parti6,7. Anche piccolissimi frammenti, 1/64th la dimensione della cella originale, sono in grado di rigenerare in una cella piccola ma normalmente proporzionata e quindi crescere per il full-size6. Stentor presenta dunque un'opportunità unica di studiare i meccanismi organello dimensione delle cellule e ridimensionamento della regolazione della crescita con metodi chirurgici che solitamente vengono applicate a livello di tessuti o interi organismi.
Una delle proprietà di Stentor che permette di rigenerare da una vasta gamma di operazioni chirurgiche è che contiene un macronucleo singolo nodulated (Figura 1) con circa 50.000 copie del genoma intero8. Come un frammento di cella contiene almeno un nodo macronuclear, ha la capacità di rigenerare completamente. Un'altra proprietà che sono alla base di Stentorabilità di rigenerazione è la sua capacità di guarigione prodigiosa. Anche se molti tipi delle cellule sono in grado di guarire le loro ferite9, Stentor è in grado di recuperare da una straordinaria gamma di perturbazioni fisiche. Un esempio di recupero Stentor da una perturbazione drastica, insieme ai metodi per visualizzare flusso citoplasmatico in Stentor10 precedentemente sono stati segnalati. Questi metodi consentono lo studio di come ferimento e successiva rigenerazione influenzano lo stato fisico del citoplasma.
Stentordi enormi dimensioni, capacità di rigenerazione straordinaria e il fatto che si manifesta molti dei fenomeni dello sviluppo visti in embrioni multicellulari (quali gli organizzatori, axiation e patterning) ha attirato molti biologi inerente allo sviluppo durante la girata del secolo scorso, tra cui Thomas Hunt Morgan7. Durante gli anni ' 50 e ' 60, approcci microsurgical hanno dimostrato una sorprendente gamma di processi rigenerativi e morfogenetici in questo organismo unicellulare11. Tuttavia, Stentor è stato sviluppato come un sistema di modello di biologia molecolare solo recentemente. Nel corso degli ultimi anni, il genoma di Stentor è stato sequenziato e assemblato8, e il metodo per perturbare l'espressione genica mediante l'alimentazione di RNAi è stato sviluppato12.
Uno dei motivi che Stentor è stato sviluppato in un organismo modello per la biologia molecolare moderna solo recentemente è stato la difficoltà di crescere grandi culture a causa di un lungo ciclo di cella (3-5 giorni). Tuttavia, i metodi moderni di genomica e proteomica richiedono meno materiale che hanno usato per, e il volume di una singola cella di Stentor è sufficiente per questi metodi, anche senza ricorrere a metodi ultrasensibili che sono stati sviluppati per l'analisi del singolo cellule che sono molto più piccole di Stentor. Sezione 1 del protocollo in dettaglio la procedura per la creazione di una grande cultura da una singola cellula Stentor . Lo stesso approccio può essere utilizzato per stabilire una grande cultura da un frammento di cellule ottenuta dal taglio di una cella. Sezione 1, inoltre, fornisce le linee guida per il mantenimento sano Stentor culture per lunghi periodi di tempo. Sezione 2 del protocollo fornisce la metodologia per indurre la rigenerazione delle cellule tagliando le celle manualmente con un ago di vetro. Sezione 3 del protocollo è dedicato ai due metodi di indurre la rigenerazione delle strutture cellulari specifici (membranellar band e orale apparato): trattando le cellule con saccarosio o urea conduce allo spargimento di queste strutture, seguite da loro rigenerazione. Sezione 4 del protocollo in dettaglio un metodo per l'imaging di singole celle rigenerante per lunghi periodi di tempo. Sezione 4 si conclude con la descrizione delle fasi di rigenerazione e suggerimenti sull'analisi delle dinamiche di rigenerazione.

<table><tbody><tr><td>Stentor coeruleus coltura viva</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii su agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di sorgente pastorizzata, bottiglia da 1 litro</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Piastra spot in vetro Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo in vetro a bocca larga con tappo a vite, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore in vetro da 2 tazze con coperchio in vetro</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell materiale in fogli di silicone</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga Posi-Click da 1,7 mL</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita TAP, ottimizzato per colture Chlamydomonas</td><td></td> Distanziatore in silicone ThermoFisher <td>A1379801</td><td></td></tr>, <tr><td>foglio in silicone CultureWell, spessore 0,25 mm/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina, vaselina, spettro bianco</td><td></td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari in vetro borosilicato. OD: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, lunghezza: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore ad aghi P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio Stemi 2000</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereomicroscopio zoom</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodi per lo studio della rigenerazione in stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Le cellule hanno bisogno per essere in grado di rigenerare le parti per recuperare da perturbazioni esterne. Il ciliato unicellulare Stentor coeruleus è un organismo modello eccellente per studiare la guarigione della ferita e la rigenerazione delle cellule successive. Il genoma di Stentor è diventato disponibile recentemente, insieme ai metodi di biologia molecolare moderna, ad esempio RNAi. Questi strumenti rendono possibile studiare unicellulare rigenerazione a livello molecolare. La prima sezione del protocollo copre che stabilisce Stentor colture di cellule da singole cellule o frammenti di cellule, insieme a linee guida generali per il mantenimento Stentor culture. Stentor la coltura in grandi quantità consente l'utilizzo di strumenti preziosi come biochimica, sequenziamento e spettrometria di massa. Le sezioni successive del protocollo coprono diversi approcci per indurre la rigenerazione in Stentor. Manualmente taglio cellule con un ago di vetro permette di studiare la rigenerazione di parti di grandi cellule, mentre trattando le cellule con saccarosio o urea permette di studiare la rigenerazione delle strutture specifiche sull'estremità anteriore della cella. Viene fornito un metodo per le immagini singole celle rigenerante, insieme a una rubrica per sosta e analizzare la dinamica della rigenerazione. L'intero processo di rigenerazione è diviso in tre fasi. Visualizzando la dinamica della progressione di una popolazione di cellule attraverso le fasi, è dimostrato l'eterogeneità nei tempi di rigenerazione.

Stentor culture sono state stabilite in modo affidabile e mantenute da singole celle o frammenti di cellule utilizzando la sezione 1 del protocollo. Un esempio rappresentativo di una grande cultura sana è mostrato nel Video 1.
Il corso di tempo di rigenerazione è stato misurato in Stentor utilizzando il metodo di trattamento di saccarosio per l'avvio di rigenerazione descritta nel passo 3.1, combinato con l'imaging e il metodo di analisi descritto nella sezione 4 (Figura 7). Questo grafico indica che c'è una diffusione di uno-ora-lungo del tempo impiegato dalla popolazione delle cellule di raggiungere qualsiasi particolare fase. Questo tipo di analisi permette lo studio dell'eterogeneità temporale nel processo di rigenerazione in una popolazione di rigenerazione delle cellule.
Di seguito è riportato un riepilogo dei tempi di rigenerazione che sono stato osservato finora dopo decine di trattamenti di saccarosio (Figura 4 e Figura 6). Fase 1 è quando Stentor cellule sembrano lacrime senza qualsiasi banda di membranellar (questa fase inizia immediatamente dopo l'interruzione di saccarosio). Questa fase dura per 3-6 h. fase 2 è quando una banda di membranellar apparirà e cresce (3-6 h dopo il trattamento di saccarosio). Questa fase dura per 3-4 h. Stage 3 è quando un primordio orale viene visualizzato all'estremità posteriore della band membranellar (6-8 h dopo il trattamento di saccarosio), entrambe le strutture vengono spostate verso l'estremità anteriore della cella. Questa fase dura per 1-2 h. Quando la band di membranellar sia l'apparato orale ha raggiunto l'estremità anteriore della cella, questo indicato il completamento della rigenerazione. La cella ha adottato caratteristica Stentor tromba-come forma. Le cellule erano completamente rigenerati 8-9 h dopo il trattamento di saccarosio.
<img alt="Diagramma del paramecio con banda membranellare, apparato orale, vacuolo alimentare, marcatura del macronucleo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1. Istantanea di Stentor. La band membranellar e apparato boccale è mostrato all'estremità anteriore della cella. Il peduncolo è all'estremità posteriore della cella. Stentor macronucleo è nodulated. Un ben nutrito Stentor ha verdi vacuoli alimentari contenenti principalmente Chlamydomonas. Barra della scala è di 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Impostazione del microscopio da dissezione; vetrino con campione di Stentor per l'osservazione nella ricerca biologica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2. Set-up taglio Stentor . Il taglio delle cellule avviene modificando manualmente un ago di vetro mentre guardando la cella utilizzando un microscopio stereo da dissezione commercialmente disponibile. Lo scopo della carta è quello di fornire lo sfondo bianco per vedere le cellule meglio. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Sequenza al microscopio di cellule in divisione, etichettate A-F, che mostra le fasi del processo mitotico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Nella figura 3. Istantanee di 3 Video che illustra come tagliare un Stentor con un ago di vetro. (A) A Stentor immediatamente prima l'ago tocca. (B) un Stentor spremuto leggermente tra una diapositiva di ferro e vetro. (C) A contratto Stentor reagire alla forza dell'ago. (D) A Stentor taglianda premendo delicatamente sulla cella con il lato dell'ago. (E) A Stentor ora tagliata in due, ma non separati. (F) due Stentor frammenti. Barra della scala è di 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Diagramma del processo di rigenerazione dello stentor con fasi d'urto saccarosio/urea, provette da centrifuga, stadi cellulari." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4. Visualizzazione schematica della sezione 3 e sezione 4 del protocollo. Si tratta di un protocollo illustrato per l'esecuzione di saccarosio o urea trattamento e l'osservazione di rigenerazione delle cellule. Il tempo indicato nel pannello inferiore è misurato dall'inizio del lavaggio 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Configurazione del microscopio da dissezione, piastra spot a 9 pozzetti, analisi della reazione delle microgocce, studio ottico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5. Il programma di installazione per l'osservazione diretta e/o formazione immagine di rigenerazione con un microscopio dritto. In ogni goccia di 4 µ l appesi il vetrino coprioggetto, c'è una cella in fase di rigenerazione. Acqua nei pozzetti della piastra spot vetro limita l'evaporazione delle goccioline. Questa configurazione permette dopo la rigenerazione delle cellule multiple in parallelo. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Analisi della struttura cellulare delle piante; immagini al microscopio A-E; enfatizzare le variazioni della morfologia cellulare." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Nella figura 6. Istantanee di Stentor in ogni fase della band membranellar e la rigenerazione dell'apparato orale. (A) fase 1 è caratterizzata da una forma a goccia-tipo delle cellule e l'assenza della band membranellar. (B) fase 2 è caratterizzato dalla comparsa della membranellar band, una struttura basata su ciglia che batte continuamente. Membranellar bande sono contrassegnati con linee bianche tratteggiate nei pannelli B - D. (C e D) fase 3 è caratterizzata dalla comparsa di primordio orale (contrassegnato con una freccia). Orale primordio appare come un'invaginazione all'estremità posteriore della band membranellar. Il primordio orale si muoverà quindi verso l'anteriore della cellula per diventare l'apparato orale. (E) rigenerazione viene completata quando la cella ha adottato la caratteristica forma a tromba Stentor , e apparato boccale (contrassegnato con una freccia) si è allargato all'estremità anteriore della cella. Barra della scala è di 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafico a barre di distribuzione degli stadi delle celle, tempo dopo lo shock da saccarosio, che mostra quattro stadi nell'arco di 9 ore." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figura 7. Impilati visualizzando trama scatola come proporzioni delle cellule in tutte le fasi di rigenerazione dopo il trattamento di saccarosio cambia nel passare del tempo. Il grafico mostra eterogeneità nella sincronizzazione delle fasi di rigenerazione all'interno di una popolazione di cellule rigenerante. "Numero di registrazione fine" indica il completamento della rigenerazione. Il numero di celle: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Bicchiere con coltura di alghe verdi per lo studio della fotosintesi in un esperimento di laboratorio." src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 1"> Video 1. Esempio di una sana cultura Stentor . In genere, se una cultura è questo concentrato, spaccare la cultura è raccomandato. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Cadere al microscopio; studio della tensione superficiale del liquido; metodo di microscopia; analisi educativa." src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 2"> Video 2. Rallentare Stentor con metilcellulosa. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Immagine microscopica di una configurazione microfluidica, che evidenzia il posizionamento delle goccioline su un filo sottile." src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 3"> Video 3. Taglio Stentor. Singole celle possono essere tagliate manualmente in più parti sotto uno stereo microscopio per dissezione premendo un ago di vetro attraverso la cella. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema con la cultura</td>
			<td>Possibile rimedio</td>
			<td>Prevenzione possibile</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura è sopraffatto da rotiferi o altri organismi di grandi dimensioni.</td>
			<td>Rimuovere altretante Stentor possibili in una nuova piastra di coltura. Quindi lavare le cellule tre volte.</td>
			<td>Lavare accuratamente Stentor quando riceverli, anche quando li acquista da un fornitore commerciale.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura è sopraffatto da funghi o altri piccoli organismi.</td>
			<td>Identificare un angolo dove ci sono meno Stentor. In quella zona, rimuovere tanto mezzi possibili senza rimuovere molti Stentor e aggiungere nella nuova PSW. Mescolare delicatamente ma accuratamente per distrubuire gli organismi invasori. Saltare l'alimentazione successiva e Stentor li mangerà.</td>
			<td>Osservare la cultura regolarmente e rimuovere piccoli contaminanti attraverso lo scambio di supporti per PSW fresco.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor stanno ponendo in cima a vicenda.</td>
			<td>Dividere la cultura in modo che la concentrazione è inferiore a 20 cellule/mL.</td>
			<td>Dividere culture più spesso.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor cellule sono accoppiamento.</td>
			<td>Alimentazione ogni 4 giorni invece di ogni 5 giorni.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>La cultura ha un sacco di materiale di scarto scuro.</td>
			<td>Rimuovere la maggior quantità di materiale scuro, Stentor rifiuti, possibile senza rimuovere le cellule. Se Stentor sono attaccati al materiale scuro, pipettare su e giù per rilasciare le cellule Stentor dai loro rifiuti e quindi rimuovere il supporto con i rifiuti senza rimuovere le cellule. O, rimuovere quelli Stentor e mangimi di conseguenza meno.</td>
			<td>Alimentazione Stentor 1ml meno cibo per 100 mL di cultura.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dall'aspetto malsano (vacuolato/gonfio o arrotondati) Stentor.
</td>
			<td>Rimuovere tanto mezzi possibili senza rimuovere molti Stentor celle e aggiungere nuova PSW.</td>
			<td>Scambiare i media regolarmente.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Guida alla risoluzione dei problemi per la coltura Stentor.

Il gigante ciliati, Stentor coeruleus, sono un ottimo sistema per studiare la rigenerazione e la guarigione delle ferite. Vi presentiamo le procedure per stabilire colture cellulari Stentor da singole cellule o frammenti di cellule, inducendo la rigenerazione di cellule di taglio, chimicamente che inducono la rigenerazione della banda membranellar e apparato orale, imaging e l'analisi della cella rigenerazione.

Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di coltivare Stentor per il loro utilizzo come organismo modello per studiare la rigenerazione a livello di singola cellula. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, ad esempio come fanno le cellule a costruire strutture da parti discrete. I principali vantaggi di Stentor sono che sono singole cellule che possono rigenerarsi e che sono abbastanza grandi da poter eseguire interventi chirurgici.In generale, la parte impegnativa di questo protocollo è che le persone sono abituate a lavorare con le cellule come colture piuttosto che come individui. Inizia cercando la capsula di Petri contenente campioni di Stentor sotto uno stereomicroscopio utilizzando la luce obliqua con un ingrandimento 5X. Si noti che le cellule dello stentor mostrano una forma a tromba quando sono attaccate a un substrato.Sebbene non siano attaccate, le cellule dello Stentor nuotatore hanno un aspetto meno esteso. Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire le singole cellule di Stentor nel pozzetto di una piastra di vetro contenente almeno 100 microlitri di acqua di sorgente pastorizzata disponibile in commercio. Quindi rimuovere circa il 90% dell'acqua nel pozzo senza rimuovere le celle di Stentor e aggiungere 500 microlitri di acqua di sorgente fresca pastorizzata al pozzo tre volte per lavare le cellule.Per alimentare le cellule, trasferire prima un'aliquota di un millilitro da una coltura di Chlamydomonas in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per la centrifugazione a 2.095 g per tre minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in un millilitro di acqua di sorgente pastorizzata per una seconda centrifugazione, seguita da risospensione in 500 microlitri di acqua di sorgente pastorizzata. Se è necessaria una coltura clonale di Stentor, trasferire 500 microlitri di terreno condizionato per coltura in pozzetti individuali di una piastra spot di vetro e trasferire una cellula di Stentor in ciascun pozzetto di terreno.Somministrare a ciascuna coltura di Stentor cinque microlitri dei Chlamydomonas preparati ogni 48 ore e conservare le colture in un'area ombreggiata. Contare il numero di nuove cellule Stentor prima di ogni poppata e regolare di conseguenza il volume di Chlamydomonas erogato. Ogni 96 ore, pipettare delicatamente il terreno di coltura alcune volte per staccare lo stentor dal menisco di ciascun pozzetto e utilizzare una pipetta da un millilitro per aspirare accuratamente il terreno dai pozzetti senza rimuovere alcuna cellula.Quindi aggiungere 500 microlitri di terreno condizionato fresco a ciascun pozzetto. Quando il numero di cellule in almeno un pozzetto supera le 20, aggiungere 20 millilitri di acqua di sorgente pastorizzata in un barattolo di vetro sterilizzato in autoclave a bocca larga e staccare con cura le cellule Stentor dal fondo di ciascun pozzetto, come dimostrato. Raccogliere tutte le cellule dello Stentor con una pipetta da un millilitro e trasferire delicatamente le cellule nel barattolo di vetro.Aggiungere acqua fresca di sorgente pastorizzata al barattolo ogni 48 ore per mantenere la densità dello Stentor a circa 20 cellule per millilitro e nutrire le cellule dello Stentor con 200-1.000 microlitri di Chlamydomonas preparato. Quando il volume di coltura raggiunge circa il 90% della capacità del barattolo, trasferire l'intero contenuto del barattolo in un contenitore di vetro da due tazze, alimentando le colture Stentor ad alto volume con due millilitri di Chlamydomonas preparato per 100 millilitri di coltura e aggiungendo acqua di sorgente pastorizzata alla coltura ogni quattro o cinque giorni per mantenere la densità dello Stentor a circa 20 cellule per millilitro. Una volta alla settimana, ispezionare le colture con un microscopio da dissezione 5X per rotiferi, funghi e altre forme di crescita utilizzando una pipetta da un millilitro per rimuovere eventuali microrganismi contaminanti insieme a eventuali cellule di Stentor di forma anomala e incolore.Dividere la coltura quando il contenitore di vetro è pieno al 90%, aggiungendo 25 millilitri di acqua di sorgente pastorizzata alla coltura e utilizzando una pipetta da 50 millilitri per staccare lo Stentor dal vetro come dimostrato. Quindi sposta circa il 50% della coltura in un nuovo contenitore di vetro da due tazze. Per indurre la rigenerazione mediante frammentazione cellulare, utilizzare prima un estrattore di aghi per realizzare diversi aghi dai tubi capillari.Successivamente, raccogli uno Stentor sano con una forma a tromba definita, un vivace colore blu-verde e nessun grande vacuolo in una gocciolina da due microlitri. Posizionare la gocciolina su un vetrino e rallentare il movimento dello Stentor con due microlitri di metilcellulosa al 4%. Posizionare la gocciolina sotto un microscopio da dissezione e tenere l'ago di vetro il più parallelo possibile alla superficie di taglio per evitare la rottura dell'ago.Premere delicatamente lo stentor contratto con il lato dell'ago per dividere l'estremità anteriore della cellula dall'estremità posteriore della cellula. Confermare che entrambi i frammenti abbiano almeno un nodo macronucleare e spostare i frammenti in pozzetti individuali di una piastra spot di vetro. Per indurre la rigenerazione della banda membrolare e dell'apparato orale, trasferire da 30 a 60 cellule Stentor in un millilitro di terreno di coltura in una provetta da microcentrifuga e utilizzare una pipetta da 200 microlitri per raccogliere tutte le cellule dalla provetta in un unico prelievo di volume di 125 microlitri.Erogare le cellule in un tubo contenente 500 microlitri di saccarosio al 25% appena preparato e avviare un cronometro. Dopo aver fatto girare le cellule nella provetta nel rack per un minuto, raccogliere tutte le cellule in un unico prelievo da 200 microlitri e tenere le cellule nella punta della pipetta fino a quando il cronometro non mostra due minuti di trattamento con saccarosio. Quindi espellere lo Stentor in una provetta da microcentrifuga contenente un millilitro di acqua di sorgente pastorizzata per tre lavaggi centrifugati.Per visualizzare la rigenerazione, aggiungere 100 microlitri di acqua di sorgente pastorizzata in un pozzetto di una piastra spot di vetro e utilizzare un puntale per pipetta da 20 microlitri per raccogliere una cellula Stentor in quattro microlitri di terreno di coltura. Depositare la gocciolina al centro di un vetrino coprioggetti di 22 x 22 millimetri quadrati e posizionare altre quattro goccioline attorno alla gocciolina precedente. Capovolgere il vetrino coprioggetti e posizionarlo delicatamente sopra il pozzo con acqua di sorgente pastorizzata.Quindi visualizzare le cellule in rigenerazione al microscopio ottico con la risoluzione temporale appropriata. Durante la prima fase della rigenerazione, che si verifica immediatamente dopo il dilavamento del saccarosio, le cellule dello stentor appaiono come lacrime senza alcuna banda membrolare. Dopo tre-sei ore, appare una banda membrallare.Questa tappa, la seconda, dura altre tre o quattro ore. La terza fase si verifica quando un primordio orale appare all'estremità posteriore della banda membrare ed entrambe le strutture iniziano a muoversi verso l'estremità anteriore della cellula. Questa fase dura da una a due ore.Quando sia la banda membrallare che l'apparato orale raggiungono l'estremità anteriore della cellula, la rigenerazione è completa e la cellula avrà adottato la caratteristica forma a tromba dello Stentor. Tracciate la percentuale di celle in ogni fase di rigenerazione in ogni punto temporale in un box plot in pila. La misurazione del tempo di rigenerazione dopo il taglio cellulare e il trattamento con saccarosio rivela una diffusione di un'ora nel tempo impiegato dalla popolazione di cellule per raggiungere un particolare stadio, dimostrando l'eterogeneità temporale del processo di rigenerazione all'interno di una data popolazione di cellule rigeneranti.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare lo Stentor e avviare la loro rigenerazione e quantificarla. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere pazienti. Lo Stentor impiega dai tre ai cinque giorni per dividersi in coltura e identificare le fasi di rigenerazione dello Stentor richiede pratica.Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori di biologia cellulare per esplorare la rigenerazione in Stentor.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un modello interessante per studiare la differenziazione delle cellule staminali in un animale vivo è il verme piatto planaria. La rigenerazione è studiato da amputazione esperimenti semplici che sono facili da eseguire in un laboratorio di base e sono suscettibili di (farmacologica e...

I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia</em

Un metodo efficace per l'innesto di tessuto di dimensione definita e coerente tra planaria è descritto. È inclusa anche una descrizione di come la tecnica di immobilizzazione utilizzata per il trapianto può essere adattato, in combinazione con scudi piombo, per l'irradiazione parziale di animali vivi.

Planaria immobilizzazione, irradiazione parziale, e di tessuti

Un modello di impianto dello stent nel topo carotidea è descritto. Rispetto ad altri metodi simili, questa procedura è molto rapida, semplice ed accessibile, che offre la possibilità di studiare in un modo conveniente la reazione parete vascolare a diversi stent medicati e dei meccanismi molecolari di restenosi.

Un modello murino di impianto di stent a livello dell&#39;arteria carotidea per lo Studio della restenosi

Lo Stentor coeruleus ciliato gigante è un sistema classico per lo studio della rigenerazione e della guarigione delle ferite in singole cellule. Eseguendo l'imaging simultaneo delle cellule Stentor a basso e alto ingrandimento è possibile misurare i flussi citoplasmatici prima, durante e dopo la ferita.

Visualizzazione del flusso citoplasmatico durante la guarigione delle ferite a singola cellula nello stentor coeruleus

Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti piuttosto che l'embrione / larve, abbiamo sviluppato una linea laterale rigenerativo dosaggio quantitativo che può essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto. Il saggio coinvolto risoluzione al neuromast 1) e 2) livelli di cellule singolo capello.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Qui vi presentiamo un protocollo che si basa su fette midollo spinale coltivate su array multi-elettrodo per studiare la rigenerazione funzionale delle connessioni propriospinali in vitro.

Indagare rigenerazione funzionale in organotipiche midollo spinale Co-culture Grown in array multi-elettrodo

In questo studio viene dimostrato un protocollo video passo-passo di resezione apicale. La resezione apicale è un approccio chirurgico recentemente evidenziato nella ricerca sulla rigenerazione cardiaca dei mammiferi. Questo studio può promuovere l'applicazione della resezione apicale come metodologia standard nella ricerca sul meccanismo alla base della rigenerazione cardiaca.

Modello apicale resezione mouse per primo studio Mammalian rigenerazione cardiaca

Qui dimostriamo come indurre e monitorare la rigenerazione nell'Anemone marino Starlet Nematostella vectensis, un antozoo cnidario modello.  Dimostriamo come amputare e classificare la rigenerazione utilizzando un sistema di stadiazione morfologica e utilizziamo questo sistema per rivelare un requisito per l'autofagia nella rigenerazione delle strutture dei polipi.

Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare Vectensis Nematostella

Presentiamo un protocollo per la caratterizzazione della motilità e del comportamento di una popolazione di cellule da cento micron a millimetri utilizzando la microscopia a campo luminoso e il tracciamento cellulare. Questo test rivela che Stentor coeruleus passa attraverso quattro fasi comportamentalmente distinte quando si rigenera un apparato orale perso.

Analisi dei modelli di motilità dello stentor durante e dopo la rigenerazione dell'apparato orale utilizzando il monitoraggio cellulare

Qui descriviamo il flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema TetON per ottenere l'espressione genica tessuto-specifica nella pinna caudale del pesce zebra adulto che si rigenera.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

Impara i metodi per coltivare Stentor coeruleus e indurre la rigenerazione cellulare mediante frammentazione e trattamento con saccarosio. Questo protocollo consente di studiare la biologia cellulare a livello di singola cellula.

Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

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