Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul sistema nervoso enterico, come il profilo di espressione dei gangli enterici nell'intestino degli esseri umani adulti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per ottenere alte rese di RNA dai gangli enterici umani, preservando al massimo la qualità dell'RNA. Iniziare con il tessuto intestinale tagliato in lunghezze di 20 centimetri.

Per prima cosa, taglia via il tessuto adiposo e connettivo. Evitare di intaccare la sierosa, che può portare a danni strutturali al plesso mienterico. Successivamente, praticare un'incisione longitudinale lungo l'intera lunghezza del campione tagliato, preferibilmente nel sito di attacco mesenterico.

Quindi, seziona e scarta la taeniae coli dal colon in modo che il tessuto possa appiattirsi. Ora, allarga l'intestino, con la mucosa rivolta verso il basso, su un tagliere freddo. Quindi, taglia strisce larghe 1,25 centimetri lungo l'intera lunghezza del tessuto.

Durante il taglio, trasferire ogni pezzo in una soluzione di stoccaggio in tessuto refrigerato per lo stoccaggio temporaneo. Quindi, taglia ogni striscia in segmenti lunghi da due a 1,5 centimetri. Dopo aver tagliato una striscia a spicchi, asciuga gli spicchi.

È importante che il tessuto sia molto asciutto in modo che non si formino cristalli di ghiaccio sul tessuto quando è congelato. Ora, disponi i pezzi di tessuto essiccati, con la mucosa rivolta verso l'alto, su uno stampo di plastica freddo e usa e getta. Quindi, appiattisci ogni pezzo usando una pinza curva per rimuovere le bolle d'aria intrappolate.

I tessuti si espanderanno man mano che vengono appiattiti. Dopo aver appiattito i segmenti di tessuto, valutarne lo spessore prima del congelamento. Se necessario, spingere i bordi del campione verso l'interno fino a quando il campione intestinale non si avvicina al suo spessore originale.

Ora, trasferisci lo stampo di base caricato su un impasto di ghiaccio secco e 2-metilbutano. Il tessuto dovrebbe congelarsi completamente entro 30-60 secondi. Quindi, asciugare immediatamente il fondo dello stampo utilizzando salviettine fredde che sono state conservate su ghiaccio secco.

Ora, controlla il campione. Prendere nota di tutti i campioni che non appaiono piatti. Quindi, avvolgere lo stampo in un foglio di alluminio che è stato pre-etichettato e raffreddato prima dell'uso.

Quindi, copri la pellicola con uno strato di pellicola trasparente per ridurre al minimo la disidratazione. Conservare i campioni in ghiaccio fino a quando non possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver preparato i materiali richiesti, versare un cumulo di TFM da tre a cinque millimetri su un grande portacampioni di criostato e trasferire immediatamente il campione intestinale, con il lato sierosa rivolto verso l'alto, sul TFM.

Dopo alcuni secondi a temperatura ambiente, trasferire il portacampioni nel ghiaccio secco e coprirlo con ghiaccio secco in polvere. Prima di affettare, assicurarsi che il TFM sia al di sotto del piano del plesso mienterico. Quindi, montare il portacampione nella testa del campione del criostato e allineare il campione con la lama del criostato.

Rendere il piano del plesso mienterico parallelo alla lama di taglio. Ora, fai sezioni di otto micron attraverso la sierosa e il muscolo longitudinale fino a raggiungere il plesso mienterico. Per localizzare il plesso mienterico, montare un campione e colorarlo con un colorante acquoso, come l'1% di cristallovioletto.

Per procedere, identificare la giunzione tra gli strati muscolari longitudinali e circolari. All'inizio del sezionamento, la sierosa sarà contrassegnata dalla presenza di tessuto connettivo. Lungo la sierosa può essere presente anche del grasso mesenterico residuo.

Quindi, il foglio dello strato muscolare longitudinale esterno diventa visibile Una volta raggiunto il confine tra gli strati muscolari longitudinali e circolari, si osserverà una porzione dei gangli enterici. Nelle sezioni successive, il plesso mienterico diventerà molto evidente con grandi strisce di gangli presenti all'interno di una singola sezione. Ora, raccogli le sezioni seriali per la microdissezione a cattura laser.

Raffreddare i vetrini PEN nel criostato per cinque-10 secondi e utilizzarli per montare le sezioni. Le sezioni migliori avranno molti neuroni e glia. Ora, procedi a colorare e poi disidratare le sezioni come descritto nel protocollo di testo.

In preparazione, inserire una cartuccia di cappucci LCM nel tavolino del microscopio LCM. Quindi, caricare il vetrino di esempio sul tavolino e acquisire un'immagine panoramica del vetrino. Identificare la posizione desiderata per LCM e caricare un tappo sul vetrino.

Quindi, allineare il laser a infrarossi e regolare la potenza e la durata del laser per ottenere un punto di acquisizione di diametro compreso tra 20 e 30 micron. Successivamente, delinea i gangli desiderati da raccogliere. Assicurati di rimanere entro il limite dell'area collezionabile sul tappo, che viene visualizzato come un cerchio verde.

Per ciascuno dei gangli delineati da una traccia di taglio UV, regolare i punti IR in modo che ci sia almeno un punto IR ogni 100-500 micron per garantire che i gangli vengano raccolti tutti quando il cappuccio viene sollevato dal campione. Quindi, premere il pulsante IR UV Cut per procedere con la raccolta di tutti i gangli marcati. Una volta completate le raccolte, sposta il tappo in una nuova posizione e ripeti il processo di raccolta.

Questo può essere ripetuto per 60-80 minuti. Quando il tappo LCM è caricato con una quantità sufficiente di gangli, trasferirlo in una stazione di controllo qualità. Se sono presenti detriti sul tappo, rimuoverlo con un pennello a punta fine preparato per l'uso dell'RNA.

Utilizzare una punta per pipetta per eventuali detriti difficili da rimuovere. Quindi, fissare il tappo su una provetta per microfughe da 0,5 millilitri riempita con 230 microlitri di tampone per la lisi dell'RNA. Capovolgere il tappo, agitarlo brevemente e quindi incubare il campione a temperatura ambiente per 30 minuti.

Successivamente, centrifugare il campione per cinque minuti a 5.000 g o più velocemente, quindi trasferire la provetta per microfuge sul ghiaccio secco. Il campione è ora pronto per l'estrazione dell'RNA. Quando si tirano due cappucci di gangli enterici per campione, si otteneva più di un nanogrammo di RNA, sufficiente per l'RNA-Seq, e l'RNA era di qualità eccellente.

L'integrità dell'RNA del campione mostrato è 8,3. Sono stati raccolti anche campioni con numeri di integrità di 7,5 e 6,9. In totale, oltre il 95% di tutti i campioni preparati è risultato sufficientemente buono per l'RNA-Seq.

La qualità dei set di dati RNA-Seq è stata valutata utilizzando una pipeline bioinformatica. La distorsione finale indica che i campioni sono stati sequenziati con successo e avevano solo una modesta distorsione a tre estremità prime. Un grafico del biotipo genico mostra che i risultati del sequenziamento erano in gran parte coerenti.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per raccogliere repliche biologiche di RNA dai gangli enterici di qualità e quantità sufficienti per l'RNA-Seq in appena 8-12 ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante che i campioni intestinali umani siano congelati il più possibile in piano. Ciò garantirà la possibilità di raccogliere sezioni trasversali molto grandi di gangli enterici umani che vengono rapidamente e facilmente lavorati con la microdissezione a cattura laser.