Name: Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Impara a valutare la funzione renale nei modelli murini di malattia glomerulare. Questo protocollo consente analisi funzionali, strutturali e meccanistiche dettagliate del glomerulo in vivo.

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Questo lavoro è stato supportato dalla British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust e il MRC.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. Consentono i passaggi critici di ogni metodo per dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, compresa la valutazione della permeabilità dei reni nel suo complesso (misure della creatinina del plasma e dell'uACR), la permeabilità della singoli dei glomeruli (glomerulare LpA / Vho), esame delle alterazioni strutturali (PAS, Trichrome blu ed EM), la localizzazione della proteina (se) e l'espressione genica glomerulare (RT-PCR e Western blotting). Questi metodi sono fondamentali per la valutazione completa della funzione glomerulare in modelli murini di malattia renale.
Nel valutare la permeabilità della GFB, molti studi hanno optato per utilizzare il tasso di escrezione dell'albumina dell'uACR o 24h convenzionale come una misura efficace17,18. Anche se queste tecniche permettono la valutazione della permeabilità GFB nel suo complesso, non consente per la valutazione individuale permeabilità glomerulare e variazione tra i glomeruli. Gli studi precedenti hanno trovato misura del glomerulare LpA / V,i , per essere una misura più sensibile delle modifiche al GFB permeabilità5,9. Infatti, nei risultati della rappresentativi ha dimostrati in questa carta, a 14 settimane post induzione di VEGF-A KO, VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A165b topi hanno un significativamente più bassa dell'uACR rispetto ai topi KO VEGF-A; Tuttavia, questo risultato non viene riflessa nella glomerulare LpA / Vho misure, dove VEGF-A165b non ha impedito significativamente aumenta in GFB permeabilità (Figura 1 e Figura 2)5. Ciò dimostra l'importanza di utilizzare saggi multipli per valutare sia la permeabilità del rene e la permeabilità dei glomeruli individuali. Inoltre, la glomerulare LpA / Vho oncometric l'analisi suggerisce che la permeabilità dei glomeruli individuali dal rene stesso può variare notevolmente, in particolare malattia modelli5,10, 19. una limitazione alla misura la glomerulare LpA / Vho è che essa può essere eseguita solo nel punto finale sperimentale; Pertanto, misure regolari dell'uACR vengono richiesto di fornire un'indicazione del punto finale sperimentale.
Oltre a valutare il fenotipo funzionale, il presente metodo incoraggia inoltre la valutazione del fenotipo strutturale ed ultrastrutturale. Questo può essere fatto utilizzando una selezione di macchie quali PAS, tricromica e le macchie d'argento; ogni valutare diversi aspetti della morfologia glomerulare. Nei modelli acuti della malattia glomerulare, che è spesso il caso in modelli murini, è può essere difficile da rilevare eventuali anomalie strutturali maggiori utilizzando queste macchie, a meno che non sei un patologo renale addestrato. Di conseguenza, realizzazione di EM è suggerito per valutare l'ultrastruttura di GFB, che permette la misurazione quantitativa di parametri quali il GBM, fenestrae endoteliale e numero le dimensioni caratteristiche del Podocita. Tali misure richiedono una formazione minima eseguire e permette al ricercatore di determinare la cella-tipi e strutture interessate in un modello di malattia. Nell'esempio indicato nei risultati rappresentativi, il mouse VEGF-A KO è stato trovato per essere un modello delicato della malattia glomerulare, così, non presenti anomalie strutturali maggiori erano presenti al momento di colorazione PAS. Tuttavia, specifici del Podocita VEGF-A KO ha indotto i cambiamenti il GBM, podociti e cellule endoteliali durante l'esame l' ultra-struttura glomerulare5. Purtroppo, la preparazione del rene per EM descritte nel presente metodo non attivare il rilevamento del glicocalice endoteliale, che è anche conosciuto per avere effetti significativi sulla permeabilità del GFB19. Al fine di misurare con precisione la profondità di glicocalice, rene dovrebbe essere irrorare-fisso con glutaraldeide 2,5% con 1% Alcian blu per l'etichettatura di glicocalice endoteliale, come descritto in Oltean et al.19.
Una volta che sono stati valutati il fenotipo funzionale e strutturale, il pattern di espressione/attivazione di diversi geni e vie quindi può essere valutato specificamente nei glomeruli. Previa valutazione ultra-strutturale potrebbe dare alcune informazioni per quanto riguarda la cella tipi/glomerulare strutture coinvolte, che indica se Podocita o endoteliali specifici geni/pathways dovrebbe essere esaminato. Ad esempio, nei risultati rappresentativi dai topi KO VEGF-A, è stata osservata una riduzione del numero di fenestrae endoteliale (Figura 3D); Pertanto, l'espressione della proteina glomerulare di un indicatore endothelial noto per essere coinvolti nella via del VEGF-A è stato esaminato; VEGFR-2 (Figura 4B)5. Oltre l'espressione delle proteine nei glomeruli, la loro localizzazione possa anche essere visualizzata con se. In uno studio di Zhang et al.20, specifiche del Podocita sovraespressione di GLUT1 è stata confermata in podociti di se co-localizza il GLUT1 aumentata con podocina.
Rispetto ai metodi alternativi presentati nella letteratura per valutare la funzione glomerulare, l'uso del metodo descritto in questo documento per valutare la funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare permette il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Utilizzando questo metodo, il ricercatore è in grado di determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Queste informazioni vitali sul meccanismo della malattia sono necessarie quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli. Questo metodo può essere applicato facilmente per le indagini future in funzione glomerulare nella valutazione di fenotipi di malattia e di terapeutica potenziale.
In conclusione, questo protocollo generico ed adattabile descrive un work-up completo del rene per modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

L'utilizzo di modelli murini per imitare la malattia di rene umano sta diventando sempre più comune. Tali modelli murini includono spontanea come spontaneamente ipertesi (SHR) ratti1, streptozotocin (STZ)-indotta in ratti diabetici e topi2, e il db/db tipo II topi diabetici3, modelli geneticamente come primaria specifiche del Podocita sclerosi glomerulare segmentale focale (FSGS) modelli4, specifici del Podocita endoteliale fattore di crescita vascolare (VEGF-A) knock-out (KO VEGF-A) modello5, e la sindrome di Alport modelli6e acquisito modelli come la nefrectomia di 5/67 e l'ostruzione ureteral unilaterale (UUO) modello8. Al fine di valutare i diversi aspetti della funzione glomerulare in questi modelli, sono disponibili diverse tecniche. Lo scopo di questa carta di metodo è quello di dimostrare un work-up completo che deve essere eseguito in modelli murini di malattia renale al fine di valutare appieno la funzione glomerulare.
La spiegazione razionale dietro l'uso di questo metodo è che esso consente il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Questo include la valutazione della permeabilità glomerulare, sia di proteine e di acqua, le anomalie strutturali glomerulari e cambiamenti nell'espressione/impionbatura di mRNA e proteine essenziali per la normale funzione glomerulare. Utilizzando questo metodo, il ricercatore è in grado di determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Si tratta di informazioni vitali sul meccanismo della malattia, che è necessaria quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli.
Nella letteratura, è un evento comune per essere presentato con un modello murino di malattia glomerulare dove il fenotipo è determinato da un aumento del livello di albumina nelle urine. Tuttavia, ci è prova per suggerire che un unico metodo per determinare la funzione glomerulare non è sempre efficace; misura il tasso di escrezione urinaria dell'albumina o il rapporto di creatinina urinaria dell'albumina (dell'uACR) fornisce solo informazioni sulla funzione renale totale e non dei singoli glomeruli. Precedenti studi hanno dimostrato che la permeabilità può variare in glomeruli differenti dalla stessa rene5,9,10. Inoltre, la valutazione della permeabilità dei glomeruli individuali è un modo più sensibile di valutazione della funzione glomerulare; la tecnica di misurazione della permeabilità glomerulare individuali (LpA / Vio) ha dimostrato di essere più sensibili ai cambiamenti nella funzione glomerulare rispetto alla valutazione dell'uACR9. Questo test è utile in modelli murini che sono resistenti alla proteinuria, come quelle su una priorità bassa c57BL/611. Il vantaggio della carta metodo attuale è che esamina sia la totale permeabilità renale all'albumina, nonché i singole glomerulare permeabilità all'acqua.
Esame delle anomalie strutturali glomerulari è spesso valutata tramite una batteria di macchie quali acido periodico Schiff (PAS), tricromica e le macchie d'argento. Questi strumenti consentono un patologo renale addestrato per valutare il livello di malattia renale tramite un metodo segnante. Anche se tutti i buoni metodi, le modifiche alla macro-struttura glomerulare non sono sempre rispettati nel danno renale acuto modelli12. Questo metodo propone che oltre a svolgere le tecniche di istologia renale sopra descritte, l'ultra-struttura glomerulare dovrebbe essere valutata anche tramite microscopia elettronica (EM). Un glomerulo macchiato può guardare relativamente normale microscopio ottico regolari; Tuttavia, al momento della valutazione con EM, piccoli cambiamenti nella membrana basale glomerulare (GBM) larghezza, Podocita piede processo effacement, fenestrazioni endoteliali e la copertura dello spazio sub-Podocita è analizzato. Pertanto, è essenziale che l'ultra-struttura glomerulare e la microstruttura è valutato per determinare il meccanismo di disfunzione glomerulare.
Oltre a valutare le anomalie strutturali glomerulari, cambiamenti in mRNA e l'espressione della proteina e splicing, come pure l'attivazione della proteina (ad es., fosforilazione), dovrebbero essere esaminati per più ulteriormente per delucidare i meccanismi della malattia glomerulare. Quando guardando la malattia glomerulare, o, per esempio, quando KO/over-expressing un gene specificamente in cellule glomerulari, ad esempio il Podocita specifiche VEGF-A KO del mouse5, è importante che i cambiamenti di mRNA e proteina sono esaminati solo all'interno del cellule glomerulari e non l'intero rene. Questo protocollo descrive un metodo in cui i glomeruli sono isolati dalla corteccia del rene del mouse, e quindi il proteina/RNA sono isolati. Questo permette l'analisi specifica della disregolazione della proteina/mRNA nei glomeruli di modello della malattia.
Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

<table><tbody><tr><td>Gabbie metaboliche</td><td>Apparato di Harvard</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata Tris (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Set di quantificazione ELISA per albumina di topo</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB Soluzione di substrato ELISA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano o equivalente</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di stabilizzazione RNAlater</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15% gel proteico prefabbricato</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli Tampone campione</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Mini cella Trans-Blot</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris tampone di corsa</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Creatinina Companion</td><td>Exocell</td><td>1012 Strip Plate Soluzione</td><td></td></tr> di <tr><td>glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Provette per prelievo di sangue</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G Ago</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Fiala in vetro da 10 ml</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Provette in polipropilene da 10 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 0,5 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>Stampi monouso per tessuti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissezione chirurgica per topi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di taglio ottimale</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari in vetro</td><td>Harvard Apparatus</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>Glomerular Permeability Rig</td><td>Costruito presso l'Università di Bristol - non disponibile in commercio</td><td>Citazione del rig LpA: Salmon et al. 2006; J. </td> Setacci in acciaio inossidabile Physiol <td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di colorazione periodica acido-Schiff (PAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini Poly-Prep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tetrossido di osmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Resina di aradite</td><td>Agar Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di piombo</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ad es. 957000H</td><td></td></tr><tr><td>Penna idrofobica</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nefrin (1243-1256) Anticorpo</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Podocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Anticorpo secondario</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di montaggio Vectashield con</td> tampone per lisi cellulare DAPI <td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>ThermoFisher Scientific Cocktail</td><td>di FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>Halt per proteasi e inibitori della fosfatasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone di trasferimento</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>membrana PVDF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi secondari coniugati HRP</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>Substrato ECF per Western Blotting</td><td>Fisher</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Trascrittasi inversa</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>Primer casuali</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific 18427088</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della ribonucleasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Miscroscopio a luce fluorescente</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J Software di analisi</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Thermocycler ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Microscope</td><td>Britannica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

L'utilizzo di modelli murini per imitare la malattia di rene umano sta diventando sempre più comune. La nostra ricerca è concentrata sulla valutazione della funzione glomerulare in nefropatia diabetica e specifiche del Podocita VEGF-A topi knock-out; di conseguenza, questo protocollo descrive il rene completo work-up utilizzato nel nostro laboratorio per valutare questi modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. Rispetto ai metodi alternativi presentati nella letteratura per valutare la funzione glomerulare, l'utilizzo del metodo descritto in questo documento consente il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Utilizzando questo metodo, il ricercatore può determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Queste informazioni vitali sul meccanismo della malattia sono necessarie quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli. I metodi consentono dettagliata valutazione funzionale della barriera di filtrazione glomerulare attraverso misurazioni del rapporto creatinina urinaria dell'albumina e permeabilità glomerulare individuali, così come esame sia strutturale che ultra-strutturale usando la macchia dello Schiff dell'acido periodico e la microscopia. Inoltre, analisi della dysregulated geni a livello di mRNA e proteina consente analisi meccanicistica della funzione glomerulare. Questo protocollo descrive i metodi generici ma adattabili che possono essere applicati a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Urina è stata raccolta utilizzando gabbie metaboliche da wild type (WT), inducibile Podocita specifiche VEGF-A knock out (VEGF-A KO) e VEGF-A KO X Jhonny-VEGF165b topi (VEGF-A KO topi che over-esprimono l'isoforma b umano VEGF-A165in podociti in un maniera costitutiva). Su misura del rapporto albumina urinaria della creatinina alle settimane 0, 4, 10 e 14 dopo induzione di doxiciclina di VEGF-A KO, VEGF-A KO topi sviluppato progressivo albuminuria da 10 settimane rispetto al WT littermate controlli. I valori assoluti può essere visto in Figura 2Ae la normalizzazione alla linea di base di ogni valori del mouse nella Figura 2B. Tuttavia, albuminuria in non osservato nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (Figura 2), che indica che il VEGF-A165b è protettiva nel modello dell'albuminuria5.
La glomerulare LpAVmi è stata misurata in singoli glomeruli setacciati da WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b reni. Un esempio di come un glomerulo viene catturato e la contrazione osservata quando perifused con 8% BSA è mostrato in Figura 3A. Questo restringimento viene quindi utilizzato per determinare la glomerulare LpA / Vho per ogni glomerulo (Figura 3B). Topi KO per il VEGF-A ha avuto un significativo aumento glomerulare LpA / Vho a 14 settimane post induzione di VEGF-KO rispetto ai glomeruli controllo WT. Anche se più bassi in VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b topi, l'aumentata glomerulare LpA / V non è stato impedito di sovra-espressione di VEGF-A165b a 14 settimane5.
PAS di colorazione di sezioni di corteccia del rene 14 settimane dopo induzione di VEGF-A KO non ha rivelato alcune anomalie strutturali glomerulari nei VEGF-A KO o VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b topi (Figura 4A). Tuttavia, sull'analisi della ultra-struttura glomerulare tramite EM, VEGF-A KO topi avevano sviluppato una maggiore larghezza GBM, riduzione del numero di fenestrae endoteliale, è diminuito di copertura SPS e maggiore Podocita medio taglio (Figura 4-4F ). Il piede Podocita medio processo di larghezza e il numero di strisce è rimasto invariato (Figura 3B e 3G). Sovra-espressione di VEGF-A165b nei topi KO VEGF-A ha impedito i cambiamenti per il GBM e taglio (Figura 4 e 4F). Tuttavia, il VEGF-A165b ha avuto alcun effetto sul numero di fenestrae alterata e SPS copertura (Figura 4 e 4E)5.
RT-PCR effettuata su RNA Estratto da glomeruli setacciati ha rivelato che l'umano VEGF-A165b mRNA è presente solo nei topi di b165VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A (Figura 5A). Durante l'estrazione della proteina da glomeruli setacciati e valutazione dei livelli di proteine tramite Western blotting, l'espressione della proteina glomerulare di VEGFR-2 è stata trovata per essere diminuita in topi KO VEGF-A, che è stata impedita da sovra-espressione di VEGF-A165b ( Figura 5B e 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Figura 1. Impostare schematica dell'impianto di perforazione permeabilità glomerulare (LpA). (A) il glomerulo è catturato su (B) la micropipetta all'interno di un supporto mediante aspirazione, che è fissato su un supporto per la stabilità. (C) rettangolare 2mpx. Obiettivo 4x (D) di un microscopio con una videocamera. (E) soluzione di BSA 1% riscaldato a 37 ° C. (F) soluzione all'8% BSA riscaldato a 37 ° C. (G) remoto toccare cuscinetto perifusate-contenente due linee, che consente lo scambio rapido perifusate. (H) itinerario di perifusate verso la 2mpx, che poi si bagna il glomerulo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Figura 2. Rapporto della creatinina urinaria dell'albumina. (A) i valori dell'uACR alle settimane 0, 4, 10 e 14 dopo induzione di VEGF-A KO in topi165b WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A. (B) gli stessi valori dell'uACR normalizzato al valore basale (settimana 0) di ogni singoli mouse. Dell'uACR aumentato significativamente in topi KO per VEGF-A alle settimane 10 e 14 confrontati ai comandi di littermate WT, che è stata impedita nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (* p &lt; 0,05; ANOVA a due vie, correzione per il confronto tra le coppie; n = 4-12 topi al punto di tempo; barre di errore: errore standard della media [SEM]). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Figura 3. Misura della permeabilità glomerulare. (A) il glomerulo è catturato la micropipetta tramite aspirazione; il perifusate è passato da BSA 1% (Ai) a 8% BSA (Aii), e restringimento glomerulare è osservato. (B) le misurazioni effettuate prima e dopo il passaggio di BSA 8% vengono utilizzate per determinare la glomerulare LpA / Vho. (C) VEGF-A KO topi sviluppano un aumento glomerulare LpA / Vho a 14 settimane post induzione di VEGF-A KO confrontati ai comandi WT. Questo non è stato impedito significativamente nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (* p &lt; 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 4-9 topi, 15-30 glomeruli; barre di errore: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Figura 4. Analisi strutturale glomerulare. (A) PAS macchiatura della corteccia del rene non ha indicato tutte le anomalie strutturali nei glomeruli da topi WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b (Ai - iii). EM ha rivelato le anomalie ultrastrutturali nei glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) la media FPW non è cambiato tra gruppi. (C) The GBM aumentato nei glomeruli VEGF-A KO, che è stato impedito di VEGF-A165b. (D) il numero di fenestrae è stato diminuito in glomeruli VEGF-A KO, che è rimasto inalterati dalla copertura di VEGF-A165b. (E) la SPS è stato diminuito in glomeruli VEGF-A KO, che inoltre è rimasto invariati da VEGF-A165b. (F) la media a taglio larghezza è stata aumentata in glomeruli VEGF-A KO, che è stato impedito di VEGF-A165b. (G) il numero di fessura è rimasto invariato fra i tre gruppi (* p &lt; 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 3 topi, 9 glomeruli; barre di errore: SEM). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Figura 5. espressione di mRNA e proteina di marcatori. (A) RT-PCR ha mostrato che umana espressione di mRNA di VEGF-A165b solo era evidente nei glomeruli setacciati dai topi di VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A165b. (B) Western blotting hanno indicato che l'espressione della proteina VEGFR-2 era down-regolata in glomeruli VEGF-A KO, che è stata impedita in glomeruli di b165VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A (* p &lt; 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 3 - 6 topi; barre di errore: SEM). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della malattia glomerulare riguardanti il fenotipo funzionale e strutturale del glomerulo e consente l'analisi meccanicistica della patologia renale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è adattabile a tutti i modelli valutati di malattia glomerulare. Per la valutazione del rapporto urinario albumina-creatinina, mettere un topo maschio di sei-otto settimane in una gabbia metabolica per topi contenente acqua e cibo dietetico arricchente in una stanza tranquilla.Dopo sei ore, rimetti il topo al suo alloggio normale e raccogli un minimo di 50 microlitri del campione di urina di base da ciascuna gabbia, ripetendo la raccolta delle urine da una volta alla settimana a una volta al mese. Al punto finale dell'esperimento, prelevare i reni dall'addome di ciascun animale e lavare gli organi in PBS ghiacciato. Per esaminare i glomeruli corticali, rimuovere e tagliare un polo della corteccia renale in pezzi di un millimetro cubo.Per esaminare i glomeruli iuxtamidollari profondi, rimuovere e tagliare a cubetti una piccola sezione del midollo in pezzi di un millimetro cubo. Quindi, posizionare i frammenti di ciascuna sezione di tessuto in singole fiale di microscopia elettronica contenenti cinque millilitri di soluzione di glutaraldeide al 2,5% e conservare i campioni a quattro gradi Celsius. Per l'istologia dei glomeruli corticali e iuxtamidollari, rimuovere e fissare il terzo superiore del rene in cinque millilitri di paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per 24 ore.Quindi, trasferire il tessuto fissato in cinque millilitri di etanolo al 70% per 24 ore prima di immergerlo in paraffina. Per l'analisi immunofluorochimica dei glomeruli corticali e midollari, posizionare un terzo del rene in uno stampo di tessuto e immergere il tessuto in un composto a temperatura di taglio ottimale. Quindi, posizionare lo stampo su ghiaccio secco fino a quando il composto non si è congelato e conservare i campioni a 80 gradi Celsius fino a quando non vengono sezionati.Per l'analisi delle proteine, posizionare tre per due millimetri cubi di corteccia renale in provette di plastica da 0,5 millilitri e congelare i campioni in azoto liquido per la conservazione a 80 gradi Celsius. Per la conservazione a lungo termine dei tessuti per l'analisi dell'RNA, dopo il congelamento rapido di pezzi di rene da tre per due millimetri cubici, aggiungere cinque volumi di soluzione di stabilizzazione della RNasi per una conservazione a 80 gradi Celsius. Per l'isolamento dei glomeruli, affettare il tessuto renale rimanente e mettere i pezzi di tessuto in cinque millilitri di soluzione di ringer di mammifero integrata con albumina sierica bovina all'1%, o BSA, su ghiaccio per una setacciatura immediata.Per isolare i glomeruli, impilare i setacci con pori di dimensioni crescenti in micron su un bicchiere di vetro e posizionare le fette di rene sul setaccio superiore di 425 micron di pori. Successivamente, utilizzare uno stantuffo della siringa e una soluzione fresca di anelli di mammifero ghiacciata integrata con l'1% di BSA per schiacciare il tessuto renale attraverso il primo setaccio. Man mano che i pezzi di rene vengono spinti attraverso, rimuovere il setaccio superiore e continuare a spingere i frammenti di rene attraverso ciascun setaccio a turno.Quando rimangono solo i setacci da 100 e 70 micron, trasferire il raccolto glomerulare trattenuto dagli ultimi due setacci in un tubo conico da 50 millilitri con 10 millilitri di soluzione fresca di ringer di mammifero integrata con l'1% di BSA su ghiaccio. Dividere tre millilitri della sospensione di glomeruli tra due provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e pellettare i glomeruli mediante centrifugazione. Dopo aver rimosso il surnatante, congelare i glomeruli in azoto liquido per una conservazione di 80 gradi Celsius per la successiva estrazione di proteine e RNA.Quindi, mettere la soluzione di glomeruli rimanente in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per l'iniezione in un rig glomerulare di permeabilità all'acqua su un tavolino per microscopio ottico. Dopo la cattura di un singolo glomerulo intatto, liberare una capsula di Bowman e frammenti tubulari con una micropipetta, iniziare a registrare e perfondere il glomerulo con una soluzione di ringer fresca integrata con l'1% di BSA. Dopo 30 secondi, passare il perfusato a una soluzione concentrata di suoneria BSA all'8%.Dopo 10 secondi di perfusione, riportare il perfusato alla soluzione della suoneria all'1% BSA e interrompere la registrazione. Per una visualizzazione dettagliata delle cellule glomerulari e della matrice residua, essiccare i campioni di corteccia renale fissati e inclusi in paraffina a 37 gradi Celsius per un'ora, seguiti da deparaffinazione con xilene consecutivo e immersioni discendenti di etanolo. Reidratare i campioni in acqua distillata per cinque minuti e incubare i vetrini in una soluzione acida periodica in una cappa aspirante.Dopo cinque minuti, sciacquare i vetrini con tre lavaggi di cinque minuti in 100 millilitri di acqua distillata, seguiti da un'incubazione di 15 minuti nel reagente di Schiff. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti e contrastare la colorazione con ematossilina per tre secondi prima di risciacquare accuratamente in acqua corrente del rubinetto per altri 15 minuti. Quindi, disidratare i vetrini con immersioni ascendenti di etanolo e due immersioni consecutive di tre minuti con xilene.Dopo l'essiccazione all'aria, i vetrini possono essere montati con un mezzo di montaggio a base di xilene per la valutazione della loro struttura glomerulare su un microscopio ottico con un ingrandimento di 400x. I topi knockout per il fattore di crescita dell'endotelio vascolare, o VEGF-A, sviluppano albuminuria progressiva entro 10 settimane, rispetto ai controlli wild-type litter mate, mentre gli animali knockout con sovraespressione di VEGF165b sono protetti da questa condizione. I topi knockout per VEGF-A hanno una permeabilità all'acqua glomerulare significativamente aumentata rispetto ai controlli wild-type, che è parzialmente recuperata dalla sovraespressione di VEGF-A165b.La colorazione periodica con acido di Schiff delle sezioni della corteccia renale nei topi knockout per VEGF-A non rivela alcuna anomalia strutturale glomerulare mediante analisi al microscopio ottico. Dopo l'analisi al microscopio elettronico, tuttavia, i topi knockout dimostrano un aumento della larghezza della membrana basale glomerulare, una diminuzione del numero di finestre endoteliali, una diminuzione della copertura dello spazio subpodocitario e un aumento della larghezza media della fessura dei podociti, mentre il numero medio di fenditure è rimasto invariato. La sovraespressione di VEGF165b negli animali knockout per VEGF-A salva i cambiamenti nella membrana basale glomerulare e nella larghezza della fessura.Tuttavia, la sovraespressione di VEGF165b non influisce sui numeri alterati delle fenestrae o sulla copertura dello spazio dei subpodociti. L'RNA estratto dai glomeruli setacciati conferma l'espressione dell'mRNA umano di VEGF165b nei topi knockout con sovraespressione di VEGF165b, correlando con una ridotta espressione di VEGFR2 nei topi knockout per VEGF-A che viene salvata dalla sovraespressione di VEGF165b nel knock negli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come completare un esame completo del rene per la valutazione di un modello murino di malattia glomerulare, inclusa una valutazione della permeabilità glomerulare sia all'albumina che all'acqua.

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