Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della malattia glomerulare riguardanti il fenotipo funzionale e strutturale del glomerulo e consente l'analisi meccanicistica della patologia renale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è adattabile a tutti i modelli valutati di malattia glomerulare. Per la valutazione del rapporto urinario albumina-creatinina, mettere un topo maschio di sei-otto settimane in una gabbia metabolica per topi contenente acqua e cibo dietetico arricchente in una stanza tranquilla.

Dopo sei ore, rimetti il topo al suo alloggio normale e raccogli un minimo di 50 microlitri del campione di urina di base da ciascuna gabbia, ripetendo la raccolta delle urine da una volta alla settimana a una volta al mese. Al punto finale dell'esperimento, prelevare i reni dall'addome di ciascun animale e lavare gli organi in PBS ghiacciato. Per esaminare i glomeruli corticali, rimuovere e tagliare un polo della corteccia renale in pezzi di un millimetro cubo.

Per esaminare i glomeruli iuxtamidollari profondi, rimuovere e tagliare a cubetti una piccola sezione del midollo in pezzi di un millimetro cubo. Quindi, posizionare i frammenti di ciascuna sezione di tessuto in singole fiale di microscopia elettronica contenenti cinque millilitri di soluzione di glutaraldeide al 2,5% e conservare i campioni a quattro gradi Celsius. Per l'istologia dei glomeruli corticali e iuxtamidollari, rimuovere e fissare il terzo superiore del rene in cinque millilitri di paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per 24 ore.

Quindi, trasferire il tessuto fissato in cinque millilitri di etanolo al 70% per 24 ore prima di immergerlo in paraffina. Per l'analisi immunofluorochimica dei glomeruli corticali e midollari, posizionare un terzo del rene in uno stampo di tessuto e immergere il tessuto in un composto a temperatura di taglio ottimale. Quindi, posizionare lo stampo su ghiaccio secco fino a quando il composto non si è congelato e conservare i campioni a 80 gradi Celsius fino a quando non vengono sezionati.

Per l'analisi delle proteine, posizionare tre per due millimetri cubi di corteccia renale in provette di plastica da 0,5 millilitri e congelare i campioni in azoto liquido per la conservazione a 80 gradi Celsius. Per la conservazione a lungo termine dei tessuti per l'analisi dell'RNA, dopo il congelamento rapido di pezzi di rene da tre per due millimetri cubici, aggiungere cinque volumi di soluzione di stabilizzazione della RNasi per una conservazione a 80 gradi Celsius. Per l'isolamento dei glomeruli, affettare il tessuto renale rimanente e mettere i pezzi di tessuto in cinque millilitri di soluzione di ringer di mammifero integrata con albumina sierica bovina all'1%, o BSA, su ghiaccio per una setacciatura immediata.

Per isolare i glomeruli, impilare i setacci con pori di dimensioni crescenti in micron su un bicchiere di vetro e posizionare le fette di rene sul setaccio superiore di 425 micron di pori. Successivamente, utilizzare uno stantuffo della siringa e una soluzione fresca di anelli di mammifero ghiacciata integrata con l'1% di BSA per schiacciare il tessuto renale attraverso il primo setaccio. Man mano che i pezzi di rene vengono spinti attraverso, rimuovere il setaccio superiore e continuare a spingere i frammenti di rene attraverso ciascun setaccio a turno.

Quando rimangono solo i setacci da 100 e 70 micron, trasferire il raccolto glomerulare trattenuto dagli ultimi due setacci in un tubo conico da 50 millilitri con 10 millilitri di soluzione fresca di ringer di mammifero integrata con l'1% di BSA su ghiaccio. Dividere tre millilitri della sospensione di glomeruli tra due provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e pellettare i glomeruli mediante centrifugazione. Dopo aver rimosso il surnatante, congelare i glomeruli in azoto liquido per una conservazione di 80 gradi Celsius per la successiva estrazione di proteine e RNA.

Quindi, mettere la soluzione di glomeruli rimanente in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per l'iniezione in un rig glomerulare di permeabilità all'acqua su un tavolino per microscopio ottico. Dopo la cattura di un singolo glomerulo intatto, liberare una capsula di Bowman e frammenti tubulari con una micropipetta, iniziare a registrare e perfondere il glomerulo con una soluzione di ringer fresca integrata con l'1% di BSA. Dopo 30 secondi, passare il perfusato a una soluzione concentrata di suoneria BSA all'8%.

Dopo 10 secondi di perfusione, riportare il perfusato alla soluzione della suoneria all'1% BSA e interrompere la registrazione. Per una visualizzazione dettagliata delle cellule glomerulari e della matrice residua, essiccare i campioni di corteccia renale fissati e inclusi in paraffina a 37 gradi Celsius per un'ora, seguiti da deparaffinazione con xilene consecutivo e immersioni discendenti di etanolo. Reidratare i campioni in acqua distillata per cinque minuti e incubare i vetrini in una soluzione acida periodica in una cappa aspirante.

Dopo cinque minuti, sciacquare i vetrini con tre lavaggi di cinque minuti in 100 millilitri di acqua distillata, seguiti da un'incubazione di 15 minuti nel reagente di Schiff. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti e contrastare la colorazione con ematossilina per tre secondi prima di risciacquare accuratamente in acqua corrente del rubinetto per altri 15 minuti. Quindi, disidratare i vetrini con immersioni ascendenti di etanolo e due immersioni consecutive di tre minuti con xilene.

Dopo l'essiccazione all'aria, i vetrini possono essere montati con un mezzo di montaggio a base di xilene per la valutazione della loro struttura glomerulare su un microscopio ottico con un ingrandimento di 400x. I topi knockout per il fattore di crescita dell'endotelio vascolare, o VEGF-A, sviluppano albuminuria progressiva entro 10 settimane, rispetto ai controlli wild-type litter mate, mentre gli animali knockout con sovraespressione di VEGF165b sono protetti da questa condizione. I topi knockout per VEGF-A hanno una permeabilità all'acqua glomerulare significativamente aumentata rispetto ai controlli wild-type, che è parzialmente recuperata dalla sovraespressione di VEGF-A165b.

La colorazione periodica con acido di Schiff delle sezioni della corteccia renale nei topi knockout per VEGF-A non rivela alcuna anomalia strutturale glomerulare mediante analisi al microscopio ottico. Dopo l'analisi al microscopio elettronico, tuttavia, i topi knockout dimostrano un aumento della larghezza della membrana basale glomerulare, una diminuzione del numero di finestre endoteliali, una diminuzione della copertura dello spazio subpodocitario e un aumento della larghezza media della fessura dei podociti, mentre il numero medio di fenditure è rimasto invariato. La sovraespressione di VEGF165b negli animali knockout per VEGF-A salva i cambiamenti nella membrana basale glomerulare e nella larghezza della fessura.

Tuttavia, la sovraespressione di VEGF165b non influisce sui numeri alterati delle fenestrae o sulla copertura dello spazio dei subpodociti. L'RNA estratto dai glomeruli setacciati conferma l'espressione dell'mRNA umano di VEGF165b nei topi knockout con sovraespressione di VEGF165b, correlando con una ridotta espressione di VEGFR2 nei topi knockout per VEGF-A che viene salvata dalla sovraespressione di VEGF165b nel knock negli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come completare un esame completo del rene per la valutazione di un modello murino di malattia glomerulare, inclusa una valutazione della permeabilità glomerulare sia all'albumina che all'acqua.